CC BY
567
Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, № 4-5, стр 507-514 © 2002, СПб РО РААКИ
Обзоры
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕГРИИ В ИММУНОДИАГНОСТИКЕ
Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Климова С.В., Бахус Г.О., Ярилин А.А., Пинегин Б.В.
ГНЦ - Институт иммунологии Минздрава России, Москва
Резюме. В статье подробно охарактеризованы возможности применения проточной цитометрии в клинической лабораторной диагностике. Дана сравнительная оценка метода с другими современными подходами иммунодиагностики. Показаны преимущества и ограничения проточной цитометрии при анализе клеточных параметров, а также перспективы ее развития. Описаны различные методы проточной цитометрии, в том числе разработанные в лаборатории клинической иммунологии.
Ключевые слова: проточная цитометрия, иммунодиагностика.
Mazurov D. V, Dambaeva S. V., Klimova S. V., Bakhus G.O., Yarilin A.A., Pinegin В. V.
FLOW CYTOMETRY IN IMMUNODIAGNOSTICS
Abstract. A flow cytometry implement in the clinical laboratory diagnostics was discussed widely. This method was combined with other current approaches of immunodiagnostics. The advantages and limitations of cell analysis by flow cytometry as well as the prospects of its development were shown. The different flow cytometry methods, including those developed in the laboratory of clinical immunology, were described. (Med.Immunol., 2002, vol.4, N 4-5, pp 507-514)
Введение
Разработка и внедрение в лабораторную практику новых методов иммунодиагностики тесно связано с развитием материально-технической базы лаборатории клинической иммунологии, а именно, наличия современного оборудования и соответствующих диагностических систем. Имеющиеся на рынке диагностические системы позволяют идентифицировать практически все параметры иммунитета. Несколько упрощая ситуацию, можно выделить три основные группы методов, используемых в клинической иммунологии и уже становящихся в настоящее время рутинными: проточная лазерная цитометрия (ПЛЦ), иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция. Остановимся в этом обзоре только на ПЛЦ.
Цитофлюорометрические подходы характеризуются рядом преимуществ, в первую очередь связанных с возможностью исследования метаболиз-
Адрес для переписки:
Пинегин Борис Владимирович - дм.н, профессор, руководитель отдела иммунодиагностики и иммунокоррекции.
ГНУ - институт иммунологии МЗРФ.
115478, Москва, Каширское шоссе, д.24, корп.2.
Тел.: (095) 117-76-49.
Факс: (095) 117-10-27.
ма отдельно взятой клетки, а также с относительной простотой, быстротой и точностью метода. Применение методов ПЛЦ только в анализе «фенотипа» клеточной поверхности клетки по экспрессируемым ею маркерам в настоящее время становится не столь приоритетным. Большая часть методов направлена на исследование функционального состояния клеток. Кроме того, с помощью ПЛЦ можно оценивать как внеклеточный, так и внутриклеточный уровень определенных белков, например, цитокинов.
Исследование фагоцитоза. ПЛЦ дает возможность оценки практически всех параметров оценки фагоцитарного звена иммунной системы, где наряду с идентификацией поверхностных рецепторных молекул фагоцитов (например, изучение экспрессии молекул адгезии CDllb, CD18, CD62L), широко применяются и иные подходы к изучению функционального состояния клеток.
Мобилизация кальция один из самых ранних процессов, который сопровождает активацию клетки. Разработано достаточно флюоресцентных красителей для исследования концентрации ионов Са2+. В основном это нефлюоресцирующие мембрано-прони-цаемые эфиры, которые задерживаются в цитоплазме клетки после обработки эстеразами. Под влиянием Са2+ индикатор, практически нефлюоресцирую-
щий, начинает излучать (например, 1пс1о-1, БЬю-Э) или излучающий на одной длине волны, начинает излучать на другой (например, Рига-2) [21, 28]. Интенсивность свечения клетки при ПЛЦ анализе в итоге отражает уровень внутриклеточного Са2+.
Образование активных форм кислорода [19,23,39]. Подобный принцип лежит и в основе применения индикаторов активных форм кислорода, генерируемых во время респираторного «взрыва». Так, дихло-рофлюоресцеин (ДХФ) главным образом после реакции с перекисью водорода (Н202) и дигидрородамин 123 (ДГР 123) после реакции с Н202 и перокси-нитритом превращаются во флюоресцирующие соединения [21, 28]. По интенсивности свечения фагоцитарной клетки можно судить об уровне синтеза в ней соответствующих кислородных радикалов. На рис.1 представлены типичные цитофлюорограммы теста с ДХФ для отдельных лейкоцитарных популяций, где в качестве индуктора кислородного «взрыва» использован форболмиристат ацетат (ФМА), активатор протеинкиназы С [23, 28, 39].
Тесты с ДХФ и с ДГР 123 не требуют большого количества крови, выделения отдельных клеточных популяций. Методики прекрасно подходят для применения в рутинных лабораторных исследованиях для оценки функционального состояния фагоцитов. Ярким клиническим примером значимости кислородного «взрыва» в функционировании фагоцитов является врожденный дефект НАДФН-оксидазы - хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ). На рис.2 представлены гистограммы ДХФ-теста ребенка с ХГБ (рис.2А) и его матери (рис.2Б). Нейтрофилы больного ребенка практически не отвечают продукцией Н202 в ответ на стимуляцию ФМА, популяция ней-трофилов матери ребенка гетерогенна - и содержит как нормальные, так и дефектные по НАДФН-окси-дазе клетки. Исследование женщин на предмет гетерозиготного носительства дефектного гена при X-сцепленном варианте ХГБ имеет значение при скрининговом тестировании возможной ХГБ у ребенка, а также для определения типа ХГБ у больного ребенка [23, 48].
Оценка поглотительной активности фагоцитов периферической крови - один из наиболее распространенных показателей, применяемых для характеристики фагоцитарного звена. По сравнению с микроскопическим методом оценки поглощения использование ПЦЛ и меченых флюорохромом микробов или частиц латекса имеет существенные преимущества: быстрота, объективность, точность измерения, малая трудоемкость, возможность измерения поглотительной активности отдельно нейтрофилами и моноцитами (в ряде случаев эозинофилами) без специальной сепарации клеток, а также отличия поглощения бактерий от их адгезии к клеточной поверхности за счет использования гасящих флюоресценцию веществ, не проникающих внутрь живых клеток, например, три-панового синего или таниновой кислоты [20, 29].
Нами разработаны методы оценки поглощения стафилококка, кишечной палочки и грибов рода
Candida [8, 9]. Для постановки реакции мы пометили эти микроорганизмы с помощью флюоресцеин-5-изо-тиоцианата (ФИТЦ). Принцип метода основан на том, что фагоцит, захвативший меченые микроорганизмы, сам начинает интенсивно флюоресцировать. При этом он четко отличается от фагоцитов, не поглотивших микробы, что регистрируется при ПЛЦ анализе отдельно для нейтрофилов и моноцитов (рис.З). Исходя из этого, вычисляется фагоцитарный индекс - количество фагоцитов, поглотивших микроорганизмы, к общему числу фагоцитов.
Важно, что методика позволяет оценивать поглотительную активность моноцитов. Существуют некоторые трудности при работе с этими клетками: малое содержание их в крови, их активное прилипание к стеклу и пластику, нечеткое образование облака на экране цитометра по светорассеивающим свойствам. Однако эти недостатки можно существенно устранить, используя соответственно анализ большего числа событий, свежую кровь или свежевыделенные лейкоциты, также силиконизированную посуду и применяя моноклональные антитела CD14, меченые фикоэрит-рином для выделения моноцитов в отдельный гейт.
Оценка бактерицидной и фунгицидной функций фагоцитов периферической крови с помощью ПЛЦ по сравнению с классическим микробиологическим методом это - быстрый выход результатов (несколько часов, а не сутки), отсутствие необходимости посева и выращивания микроорганизмов на питательных средах, достаточная точность и автоматическое вычисление процента погибших микроорганизмов. Для постановки реакции микроорганизмы метят ФИТЦ с сохранением их жизнеспособности. После инкубации лейкоцитов с живыми ФИТЦ-мечеными микробами, лейкоциты разрушают, а высвободившиеся микробы докрашивают пропидиума иодидом (PI), который проникает только в убитые клетки. Таким образом, по зеленой флюоресценции ФИТЦ микроорганизмы выделяются на фоне клеточного дебриза (обломков и ядер лейкоцитов), a PI служит для определения процента убитых микробов. В нашей лаборатории адаптирована методика оценки киллинга
C.albicans с использованием ПЛЦ [44,45]. Для анализа бактерицидности мы разработали новую методику, где в качестве бактериальной мишени используется Staphilococcus aureus Cowan I [7, 8]. Цитофлюорограммы оценки внутриклеточного киллинга St.aureus представлены на рис.4.
Оценка процессинга белков и презентации их пептидов на поверхности моноцитов. Процессинг экзогенных антигенов является ключевым моментом запуска адаптивного иммунного ответа и осуществляется антигенпрезентирующими клетками. Процессинг белковых антигенов обеспечивается набором эндопротеаз, находящихся в лизосомах и эндосомах клеток и расщепляющих белки до 15-20-мерных пептидов. Далее олигопептиды связываются сМН С-Пис помощью соответствующего транспортного белка доставляются на поверхность клетки, где распознаются CD4+ лимфоцитами.
10° 10' 10J 101 10‘ FL1-H
лк
■я ї'_ . '"i
10° 10і 10і 10‘ 10* FL1-H
10} 10' 102 10і 10* FL1-H
А Б В
Рис.1. Гистограммы свечения ДХФ-меченых лейкоцитов крови (по оси ординат - относительная частота встречаемости, по оси абсцисс - интенсивность флюоресценции по РП в отн.единицах). Спонтанная флюоресценция показана в виде заштрихованных пиков, контуром обозначено свечение клеток после стимуляции ФГА. А - нейтрофилы, Б - моноциты, В - лимфоциты.
Рис.2. Гистограммы флюоресценции меченых ДХФ нейтрофилов до (заштрихованный пик) и после стимуляции ФМА (контурная линия): А - ребенка с ХГБ, Б - матери ребенка с ХГБ.
FSC-H
1023
10е
R2
ю1
М1
10і
FL1-H
10і
10*
Рис. 3. Цитофлюорограммы поглощения ФИТЦ-стафилококка. А - Dot Plot FSC/SSC с изображением облаков гранулоцитов (R3), моноцитов (R1) и лимфоцитов (R2). R3 и R1 - гистограммы FL1 поглощения ФИТЦ-стафилококка гранулоцитами и моноцитами соответственно. Клетки, интенсивность свечения которых больше 102-канала, считаются фагоцитировавшими. R2 - гистограмма свечения лимфоцитов: они фактически не поглощают стафилококк.
FL1-H
А Б
Рис.4. Цитофлюорограммы измерения внутриклеточной бактерицидности фагоцитов. А - Dot Plot FL1/FL3, отображающий облако убитых (правый верхний квадрант) и живых (правый нижний квадрант) ФИТЦ-меченых бактерий. Б - Гистограмма FL3, где курсором М1 выделены окрашенные PI бактерии.
Рис.5. ПЦЛ анализ жизнеспособности К-562. Правый нижний квадрант - живые К-562, правый верхний - убитые К-562. А - К-562 после контрольной 4-х часовой инкубации. Б • К-562 после 4-х часовой инкубации с мононуклеарами периферической крови человека (соотношение «эффектор-мишень» - 50:1).
уменьшение интенсивности свечения <г
Н3 Ml 11.8%
М2н-ч
101 10 2 FL1 -Н
Рис.6. А - нестимулированные лимфоциты, М1 =90,5% лимфоцитов с исходной, высокой интенсивностью свечения. Б - стимулированные ФГА (5 мкг/мл) лимфоциты. Видно последовательное уменьшение интенсивности свечения клеток в процессе их пролиферации (М2-М8), лимфоцитов с исходной интенсивностью свечения осталось М1=11,8%.
Мы использовали ПЛЦ для изучения способности моноцитов человека процессировать бычий альбумин (БСА). Сущность метода заключается в том, что при мечении БСА избытком ФИТЦ происходит самогашение молекул флюорохрома. После поглощения «перемеченного» БСА-ФИТЦ моноцитами он расщепляется до олигопептидов, которые начинают ярко флюоресцировать. Эти олигомеры удерживаются в клетке и на ее поверхности с молекулами МНС. Интенсивность флюоресценции моноцитов прямо пропорциональна степени процессинга БСА и увеличивается с продолжением инкубации клеток.
Примером нарушения процессинга является синдром Чедиака-Хигаси, при котором поражен гранулярный аппарат клеток и имеет место патология слияния цитоплазматических гранул. Нарушение процесса презентации у человека наблюдается при синдроме «голых лимфоцитов», на поверхности которых отсутствуют МНС-П. Искусственную блокаду презентации антигенов можно наблюдать у нокаут-мышей по транспортным белкам ТАР, что сопровождается отсутствием экспрессии МНС-1 или МНС-П.
Оценка функциональной активности естественных киллерных клеток (ЕК) с использованием ПЛЦ. Анализ состояния данного звена иммунной системы может быть количественным - идентификация ЕК по экспрессируемым маркерам, и функциональным - определение способности ЕК лизи-ровать клетки-мишени. В качестве мишеней для постановки цитотоксического теста традиционно используют клетки эритромиелолейкозной линии К-562, меченные радионуклидом (3Н уридином или 51Сг) [3,3]. Нами была разработана методика определения ЕК активности, которая исключает применение радиоактивной метки. Клетки К-562 метят флюоресцентным красителем 5-,6-карбоксифлюо-ресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром (КФДА-СЭ), который в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клетки [26, 40]. После инкубации клеток-мишеней (К-562) с клетками-эффекторами (мононуклеарами периферической крови) в пробу добавляют Р1, который проникает только в убитые в ходе реакции клетки-мишени. При ПЛЦ анализе среди всех К-562, положительных по зеленой флюоресценции благодаря КФДАСЭ, оценивают процент клеток, имеющих дополнительное красное свечение Р1 (рис.5). У здоровых доноров средний процент мертвых К-562 зависит от соотношения «эффектор-мишень» и достигает максимума через 6 часов от начала реакции, а затем снижается вследствие лизиса уже мёртвых клеток. Цитомет-рический метод оценки ЕК активности показал высокую степень корреляции с классическим радио-изотопным цитотоксическим тестом.
Иммунофенотипирование лимфоцитов. В основе иммунофенотипирования лежит взаимодействие моноклональных антител (МкАТ), связанных с флюоресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и последующий анализ образцов на ПЛЦ. Однако применение одного типа МкАТ (так называе-
мая одинарная метка) не всегда дает объективную информацию о той или иной популяции лимфоцитов, поскольку каждая клетка несет на своей поверхности одновременно несколько типов антигенов. Более точное и информативное исследование субпопуляций достигается при анализе лимфоцитов по двойной метке, то есть к образцу крови добавляют одновременно два типа МкАТ, несущих на себе различные флюоресцентные красители [24,31,32]. Таким образом, можно дифференцировать лимфоциты, связавшие на своей поверхности только первый тип антител, только второй и оба типа. В ряде случаев важно также определение интенсивности свечения анализируемых лимфоцитов, что отражает выраженность экспрессии антигена на поверхности клеточной мембраны.
Оценка пролиферативной активности лимфоцитов. Результаты пролиферативного ответа лимфоцитов до последнего времени оценивались либо с помощью микроскопического метода (морфологическая идентификация и подсчет процента бластов), либо с помощью включения радиоактивной метки (3Н-тимидин). Применение уже упоминаемого выше флюоресцентного красителя КФСЭДА для окрашивания лимфоцитов с сохранением их функциональных качеств позволяет оценивать пролиферативную активность этих клеток с помощью ПЛЦ [18, 25, 38]. Сущность метода заключается в том, что под влиянием митогена (ФГА) окрашенные КФДАСЭ лимфоциты делятся и из одной клетки с большей (исходной) интенсивностью свечения получаются две клетки со сниженной приблизительно в 2 раза интенсивностью свечения. Методика позволяет проследить до 8 митозов. На рис.6. представлены цитофлюорограммы анализа пролиферативной активности лимфоцитов, где М1 — это клетки, которые не вышли в фазу деления и остались в «состоянии покоя», М2-8 - делящиеся бласты. По этим данным можно рассчитать такие параметры, как митотическая активность бластов (процент активно делящихся бластов), индекс деления (обозначает, сколько митозов в среднем претерпевает каждый лимфоцит в процессе культивирования) и др.
Следует отметить, что добавленные в культуру митогены (ФГА, Кон А, митоген лаконоса и др.) неспецифически стимулируют лимфоциты к бластт-рансформации [30, 36] и полученные таким образом показатели характеризуют состояние клеток в данный момент и их общую способность к реакции. С помощью данного метода возможно оценивать и специфический ответ лимфоцитов на определенный антиген, однако требующий более длительного (до 7 суток) культивирования клеток.
Анализ внутриклеточных цитокинов с помощью ПЛЦ. В основе дифференцированного анализа субпопуляций Т-хелперов, а также любых других интересующих субпопуляций цитокин-продуцирую-щих клеток лежит определение цитокинов в цитоплазме клетки с помощью МкАТ и ПЛЦ одновременно с фенотипированием клеток [14, 22, 33]. Сущность методики заключается в следующем: мо-
нонуклеары периферической крови человека стимулируют поликлональными активаторами лимфоцитов (ФМА и иономицином), фиксируют параформальдегидом, клеточную мембрану пермеабилизи-руют сапонином и для накопления цитокина в цитоплазме клетки к активированным культурам добавляют ингибитор аппарата Гольджи - моненсин. Количество Thl-и ТЬ2-клеток, содержащих внутриклеточные цитокины, оценивают с помощью проточной цитометрии при окрашивании соответственно анти-у-интерферон-МкАТ или анти-1Ь-4-МкАТ, мечеными фикоэритрином. Одновременно клетки окрашивают ФИТЦ-мечеными анти-СОЗ-антитела-ми. Чувствительность метода сравнима с чувствительностью при фенотипировании лимфоцитов. Интенсивность свечения клеток, содержащих в цитоплазме анализируемый цитокин, отличается от интенсивности свечения негативных клеток в среднем в 100 раз.
Определение внутриклеточных цитокинов и идентификацию Thl- и ТЬ2-клеток важно оценивать при аутоиммунных и аллергических заболеваниях, при первичных и вторичных иммунодефицитах. Особенно высокое диагностическое и прогностическое значение могут иметь динамические наблюдения за изменением соотношения у-интерферон- и IL-4-содер-жащих CD3+ Т-лимфоцитов [42]. Наиболее выражены эти изменения среди у-интерферон-продуцирую-щих CD3+ Т-клеток при некоторых тяжелых Th-1-опосредованных аутоиммунных заболеваниях, а также при развитии ВИЧ-инфекции.
Количественное определение внеклеточных цитокинов с помощью ПЛЦ. В настоящее время для диагностики и мониторинга состояния иммунной системы все чаще возникает необходимость оценки продукции в организме цитокинов. Кроме того, цитокиновый ответ клеток in vitro в ответ на стимуляцию позволяет судить о функциональной активности того или иного пула иммунокомпетент-ных клеток.
Метод количественного определения уровня цитокинов в биологических жидкостях (сыворотке крови, секретах слизистых оболочек) или в культуральных средах (супернатанте культуры активированных и неактивированных клеток) основан на поэтапном связывании молекулы искомого цитокина с двумя типами моноклональных антител, направленных к его двум различным антигенным детерминантам. Первые антитела связаны с поверхностью специальных парамагнитных полистироловых частиц, а вторые несут на себе флюоресцентную метку. При дальнейшем анализе полистироловых частиц на проточном цитометре учитывается интенсивность свечения частиц, которая коррелирует с количеством связанного цитокина. Содержание цитокинов в исследуемых образцах определяют по калибровочной кривой (рис.7). Специфичность моноклональных антител, входящих в состав набора, гарантируется предприятием-изготовителем. Чувствительность метода является очень высокой.
Интенсивность флюоресценции парамагнитных частиц прямо коррелирует с концентрацией искомого цитокина в исследуемом образце и превышает фоновую флюоресценцию (парамагнитные частицы, не взаимодействовавшие с цитокином) до 1000 раз. Поскольку цитокины в основном обладают местным действием и вырабатываются клетками в ответ на стимулирующий фактор, обычно их содержание в сыворотке крови и в супернатанте нестимулирован-ной культуры клеток невелико - от 0 до 100 пг/мл для различных цитокинов. С помощью данной методики можно анализировать образцы, содержащие цитокины в концентрации от 5 пг до 20 нг в 1 мл.
Оценка апоптоза активированных лимфоцитов периферической крови человека с помощью ПЛЦ и пропидиума иодида (Р1). В настоящее время для регистрации апоптоза лимфоцитов все шире применяют методы, основанные на ПЛЦ. Например, с помощью меченного флюорохромом аннексина V, который связывается с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток, подвергающихся апоптозу. Ориентировочное представление о «склонности» лимфоцитов к развитию апоптоза можно получить, определяя экспрессию на их поверхности Раз-рецептора (СВ 95) и в митохондриях - протонкогена Ьс1-2.
С помощью флюоресцентного красителя Р1 можно выявлять гиподиплоидные вследствие потери части ДНК клетки [17]. Этот метод чаще всего используют для изучения активационного апоптоза лимфоцитов. Для этого лимфоциты культивируют 3 суток в присутствии митогена (ФГА). Затем клетки фиксируют, клеточную мембрану пермеабилизуют с помощью детергента тритон Х-100. После такой предварительной обработки в лимфоциты свободно проникает Р1, который связывается с ДНК. При ПЦЛ-анализе оценивают процент клеток во фракции, расположенной в зоне гистограммы, соответствующей субдипло-идному содержанию ДНК (рис.8).
Оценка процента гиподиплоидных клеток с помощью ПЛЦ является очень чувствительным методом, который не требует выделения клеточных популяций, позволяет проанализировать за короткий промежуток времени большое количество образцов и значительное количество клеток. Клиническая значимость оценки апоптоза при клинико-иммунологическом обследовании больных несомненна, поскольку с его нарушением связан целый ряд заболеваний. Однако наиболее общезначимой является оценка «активационного апоптоза», которому подвергаются лимфоциты при их стимуляции митоге-нами [12, 43, 47]. Дело в том, что апоптоз, наряду с пролиферацией, является формой ответа лимфоцитов на активационные стимулы. Чем выше вклад апоптоза в ответ лимфоцитов на митоген, тем менее эффективной будет антигенспецифическая иммунная защита. Таким образом, определение апоптоза при активации лимфоцитов митогенами является наиболее информативным при условии параллельной оценки пролиферативного ответа клеток на тот же стимул.
Рис.7. Выделение полистироловых частиц по показателям малоуглового (РБС) и бокового (БЭС) светорассеяния (А.) и образец показателей свечения частиц по Р1.2-Н в шести калибровочных пробах (Б.)
Рис.8. А - Dot Plot с выделенным окном лимфоцитов. Б - Гистограмма свечения лимфоцитов, меченных пропидиумом иодидом (М1).
Заключение
В принципе возможности ПЛЦ безграничны. С ее помощью при наличии моноклональных антител можно идентифицировать в клетке не только цито-кины, но и сигнальные молекулы, транскрипционные факторы и любые другие внутриклеточные белки. С помощью ПЦЛ можно идентифицировать и любые внеклеточные белки: комплемент, иммуноглобулины, специфические антитела, цитокины, белки острой фазы и т.д. В молекулярной биологии ПЦЛ используется для изучения клеточного цикла с применением ядерных красителей, РНК- и ДНК-диаг-ностики в виде методов флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), флюоресцентной RT-PCR и PCR in situ и на частицах с иммобилизованной ДНК, для изучения трансдукции сигналов (меченые субстраты, которые при фосфорилировании начинают флюоресцировать) и пр. ПЦЛ, по крайней мере, для России действительно является технологией 21-го века.
Список литературы
1. Кулаков В.В., Воробьёва Н.В., Пинегин Б.В. Способность нейтрофилов и мононуклеаров пе-
риферической крови нормальных доноров оказывать цитотоксическое действие на Т-лимфоблас-тоидные клетки M0LT-4// Иммунология.-1995,-№4. - С.31-34.
2. Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии // Иммунология. - 2000. - №2.
- с.57-59.
3. Мазуров Д.В., Пинегин Б.В. Применение проточной цитометрии для оценки поглотительной и бактерицидной функций гранулоцитов и моноцитов периферической крови // Аллергия, астма и клиническая иммунология - 1999. - №9. - с.154-156.
4. Мазуров Д.В., Хамидуллина К.Ф., Пинегин Б.В. Оценка поглощения бактерий гранулоцитами и моноцитами периферической крови методом проточной цитометрии // Иммунология. - 2000. - №1.
- с.57-61.
5. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Варфоломеева М.И., Ярилина A.A., Ярилин А.А. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию // Иммунология. -1999. - №2. - с. 20-23.
6. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М.: Изд-во ВНИРО, 1995.
7. Ханухова ЛМ, Рабинович ОФ, Пинегин БВ. Определение ТН1- и ТН2-клеток в периферической крови больных с красным плоским лишаем и влияние на них иммуномодулятора ликопида // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 1999.
- №6. - с.3-6.
8. Ярилин А.А., Никонова М.Ф.. Ярилина А.А., Варфоломеева М.И., Григорьева Т.Ю. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клиникоиммунологическом обследовании больных // Медицинская Иммунология. - 2000. - Т.2. - № 1. - с.7-16.
9. Angulo R., Fulcher D.A. Measurement of Candida-specific blastogenesis - Comparison of carboxifluo-rescein succinimidyl ester-labeling of T-cells, thymi-din incorporation and CD 69 expression // Comm. Clin. Cytometry.- 1998. - V.34. - P.143-151.
10. Bass D.A., Parce J.W., Dechatelet L.R., Szejda P., Seeds M.C., Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neurtophils: a graded response to membrane stimulation // J. of Immunol. -1983. - V.130. - N.4. - P. 1910-1917.
11. Bjerknes R. Flow cytometric assay for combined measurement of phagocytosis and intracellular killing of Candida albicans //J Immunol Methods - 1984. -V.72. - N.I. - P.229-41.
12. Eeden S.F., Klut M.E., Walker B.A.M., Hogg J.C. The use of flow cytometry to measure neutrophil function // J. of Immun. Meth. - 1999. - V.232. -P.23-43.
13. Elson L, Nulman T.B., et al. Flow cytometric analysis for cytokine production identifiens Thl, Th2, and within thq CD4+CD27+lymphocyte subpopulation //J.Immunol. - 1995. - V.154. - P.4294-4301.
14. Emmendorffer A., Hecht М., Lohmann-Mattes M.-L., Roester J. A fast easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorodamine 123 // J. of Immunol. Meth. - 1990. - V.131. - P.269-275.
15. Foucar K., Glueken J.A. Clinical application of immunologic techniques to the diagnosis of lymphop-roliferative and immunodeficiency disorders // Lab. Medicine. - 1982. - V.13. - P.403-413.
16. Fulcher D.A., Wong S. Carboxifluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T-cell function in the diagnostic laboratory // Immunology and Cell Biology. - 1999. - Vol.77. - P.-559-564.
17. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. - 6-th Ed. \ Ed. R.P.Haugland. - London, 1996.
18. Hasbold J., Gett AV, RushJS. et.al. Quantitative analysis of lymphocyte differentiation and proliferation in vitro using carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester // Immunology and Cell Biology. -1999.
- V.77. - P.516-522.
19. Hed J., Hallden G., Johansson S.G., Larsson P. The use of fluorescence quenching in flow cytofluo-rometry to measure the attachment and ingestion phases in phagocytosis in peripheral blood without prior cell separation //J Immunol Methods. - 1987. - V.101. -N.l - P.119-25.
20. Hume D. A., Weidemann M. J. Mitogenic Lymphocyte Transformation.-Elsevier-1980.
21. Jackon A, Warner N. Preparation, staining, and analysis be flow cytometry of periferal blood leukocytes. In: Manual of Clinical Laboratory Immulogy. 3rd ed. Washington DC:American Society for Microbiology - 1986. - P.226-235.
22. Jackson A. Basic phenotyping of lymphocytes: Selection and testing of agents and interpretation of data. // Clin. Immunol. Newslett. - 1990. - V.10. - P.43-55.
23. Jung T, Schauer U. et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry // J.Immunol. Meth.
- 1993. - V.159. - P.197-207.
24. Lazda V., Baram P. Participation of different cell population in antigen- and mitogen-induced lymphocyte proliferation // J. of Immunology. - 1974. -V.112. - P. 1705-1717.
25. Lyons A.B., et al. Determination of lymphocyte division by flow cytometry // J. of Immunol. Methods.
- 1994. - V.171. - P.131-137.
26. Model M.A, KuKuruga M.A., Todll R.F. A sensitive flow cytometric method for measuring the oxidative burst //J. of Immunol. Meth.- 1997. - V.202. -P.105-111.
27. Parish R C. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies // Immunology and Cell Biology.- 1999,-Vol. 77.-Р,- 499-508.
28. Romagnani S. Human TH1 and TN2 in human diseases // Clin.Immunol.Immunopath. - 1996. - V.80.
- P.225-235.
29. Russel J.H. Activation-induced apoptosis of mature T-cells in the regulation of immune responses // Curr. Opin. Immunol. - 1995. - V.7 - P.382-388.
30. Saresella M., Roda К., Spéciale D., Taramelli
D., Mendozzi E., Guerini F., Ferrante P. A flow cytometric method for the analysis of phagocytosis and killing by polymorphnuclear leukocytes // Ann N Y Acad Sci. - 1997. - V.832 - P.53-61.
31. Saresella M., Roda К., Spéciale L., Taramelli D., Mendozzi E., Guerini F., Ferrante P. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD 13+ leukocytes //J Immunol Methods - 1997. -V.210 - P.227-234.
32. Wesselberg S., Janssen O., Kabelitz D. Induction of activation-driven death (apoptosis) in activated but not resting peripheral blood T cells // J. Immunol. - 1993. - V.150. - P.4338-4345.
33. Zeman K., Banasik М., Scopczynska H., Pokoca L., Bernatowska E. Contemporary diagnostics of chronic granulomatous disease // Centr Eur J Immunol. - 2000. - V.25. - N3. - P.113-118.
поступила в редакцию 22.01.2002 принята к печати 03.09.2002
