CC BY
70
Применение проточной цитометрии при разработке вакцин против особо опасных инфекций: современные достижения и перспективы
А.Л. Кравцов, Т.П. Шмелькова, С.Н. Клюева, Е.А. Смолькова
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов ([email protected])
Резюме
В обзоре приводятся сведения о применении проточной цитометрии при разработке вакцин нового поколения против чумы, холеры, сибирской язвы и других особо опасных инфекций. Обсуждаются результаты некоторых собственных исследований авторов в этой области, а также перспективы, связываемые с более широким использованием в вакцино-логии современных методов автоматизации и стандартизации цитологических исследований.
Ключевые слова: проточная цитометрия, особо опасные инфекции, клеточный иммунный ответ, оценка иммуноген-ности и безвредности вакцин
Application of Flow Cytometry to Vaccine Development against Particularly Dangerous Infections: Modern Achievements and Perspectives
A.L. Kravtsov, T.P. Shmel'kova, S.N. Klueva, E.A. Smol'kova Russian Anti-Plague Research Institute «Microbe», Saratov ([email protected]) Abstract
Information about application of flow cytometry to vaccine development against plague, cholera, anthrax and other particularly dangerous infections is presented in this review. Some results of the own author's investigations in this field and perspectives, connected with more using of flow cytometry in vaccinology, are discussed.
Key words: flow cytometry, particularly dangerous infections, cell immune response, vaccine immunogenicity and safety estimation
Способность вакцин защищать организм от острых инфекций бактериальной, вирусной и паразитарной этиологии длительное время косвенно оценивалась исключительно по титрам сывороточных специфических антител, соответствующим определенному пороговому значению. Однако серологическая оценка не отражает в полной мере иммунологический ответ на вакцинацию [1]. Для защиты организма от возбудителей инфекционных болезней необходимы не только антитела, но и эффекторные цитокины, продуцируемые активированными иммунокомпетентны-ми клетками [51], что требует внедрения новых принципов оценки иммунологической эффективности вакцин - на основании результатов детального изучения клеточных механизмов иммунного ответа [29, 52, 55, 58, 67]. В последние годы качество вакцинных препаратов все чаще определяется с использованием современных достижений в области автоматизации и стандартизации цитологических исследований, неразрывно связанных с разработкой технологии проточно-цитометрического анализа [56].
Благодаря внедрению импульсной проточной цитометрии открылись новые горизонты в развитии иммунологии и вакцинологии [35]. С 80-х го-
дов прошлого столетия в России с каждым годом увеличивалось число работ, приводящих данные, полученные методом проточной цитометрии (МПЦ) при исследовании показателей клеточного иммунитета у людей и лабораторных животных, привитых различными профилактическими и терапевтическими вакцинами [9, 10, 12 - 14, 18, 19, 21]. Однако на сегодняшний день в российской и зарубежной печати отсутствуют публикации, посвященные анализу итогов и перспектив использования МПЦ при разработке вакцин против чумы, холеры, сибирской язвы и других особо опасных инфекций.
цель настоящей работы - обзор литературы по данной тематике, включая анализ результатов некоторых наших собственных исследований, выполненных с помощью МПЦ в РосНИПЧИ «Микроб».
Показатели Т-клеточного иммунитета, определяемые МПц и коррелирующие с защитной эффективностью вакцин против особо опасных инфекций. Успешность вакцинации зависит от продукции и функциональной активности ряда субпопуляций Т-клеток:
а) 004+ Т-лимфоцитов (хелперов), секретирующих цитокины и стимулирующих защитную функцию клеток врожденного иммунитета;
б) цитотоксических СD8+ T-лимфоцитов (киллеров), уничтожающих клетки организма хозяина, инфицированные вирусами и бактериями;
в) Т-лимфоцитов, являющихся носителями иммунологической памяти и способных в случае повторного контакта с возбудителем дикого типа, против которого была направлена вакцинация, осуществить максимально быструю мобилизацию соответствующих эффекторных клеток [11, 68].
Важная роль T-клеток СD4+ и CD8+ в защите от первично-легочной формы чумы была установлена в опытах на мышах-мутантах с врожденным дефектом функции В-лимфоцитов и, как следствие, с нарушением процесса образования антител к специфическим антигенам чумного микроба. Был сделан вывод, что для защиты людей от аэрогенного заражения чумой необходима, вероятно, вакцина, способная стимулировать образование Т-клеток с фенотипами СD4+ и CD8+. В новом тысячелетии приобрела актуальность и практическую значимость проблема адекватной оценки содержания и функциональной активности таких клеток в организме вакцинированных против чумы людей и лабораторных животных [58].
A.V. Philipovskiy и S.T. Smiley (2007 г.) [62] с помощью МПЦ и соответствующих меченых монокло-нальных антител (МКА) идентифицировали прими-рованные СD4+ и CD8+ Т-лимфоциты в организме мышей, привитых живой чумной вакциной, и выделяли эти клеточные субпопуляции в чистом виде для переноса из иммунного организма в организм не привитых против чумы (наивных) мышей. Данная процедура с высокой эффективностью защищала животных от легочной чумной инфекции только тогда, когда для переноса использовали смесь двух типов клеток. Синергический защитный эффект двух клеточных субпопуляций в 1000 раз снижал интенсивность размножения чумных микробов в крови, печени и селезенке, предотвращая развитие инфекционных осложнений, характерных для генерализации воспалительного процесса при чуме. В его основе лежала способность примиро-ванных СD4+ и CD8+ Т-клеток стимулировать in vivo (или in vitro) бактерицидную функцию клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов) путем секреции в кровь и ткани организма большого количества интерферона гамма (IFN-g) и фактора некроза опухоли альфа (TNF-a).
Так как факторы вирулентности чумного микроба подавляют секрецию IFN-g и TNF-a иммуноком-петентными клетками, защитить животных от чумной инфекции можно путем парентерального введения этих двух цитокинов либо с помощью вакцинации, стимулирующей секрецию цитокинов при-мированными Т-клетками и «включающей» очень важный механизм антибактериальной защиты, который функционирует независимо от специфических антител и существенно дополняет защитный
эффект факторов гуморального иммунитета. Предполагают, что этот механизм играет ключевую роль в защите от чумы людей и приматов, для которых, в отличие от мышей, недостаточно эффективна химическая противочумная вакцина на основе кап-сульного антигена F1 и V-антигена чумного микроба [51].
Благодаря исследованию штаммов чумного микроба, различающихся по плазмидному составу и признаку пигментсорбции, было установлено, что Т-клетки с фенотипами СD4+ и CD8+, примирован-ные антигенами Yersinia pestis, при повторном контакте с чумными микробами (в частности, при инкубации in vitro c зараженными чумой моноцитами и дендритными клетками) распознают не только известные протективные антигены, но и антигены, которые в настоящее время еще не идентифицированы. То есть у чумного микроба имеются протективные антигены, которые не могут быть выявлены с помощью препаратов специфических антител к капсульному антигену F1, V-антигену или белкам YopH, YopD и YopM. Идентификация этих новых протективных антигенов с помощью современных методов цитологического анализа создаст основу для конструирования химических противочумных вакцин, обладающих более высокой иммунологической эффективностью [67].
Уникальные возможности открылись благодаря МПЦ для изучения иммунологических механизмов защиты от Burkholderia pseudomallei, для создания пока несуществующей вакцины против ме-лиоидоза. В недавно проведенных исследованиях A. Haque и соавт. [44] установлено, что вакцинация живым аттенуированным мутантом B. pseudomallei 2D2 генерирует у мышей выраженную иммунную защиту, которая не связана с активацией В-клеток и продукцией специфических антител, а обусловлена резким увеличением продукции Т-лимфоцитов-хелперов с фенотипом CD4+ и способностью этих клеток секретировать большое количество эффекторных цитокинов IFN-g и ТNF-a. За примирование Т-клеток в иммунном организме были ответственны белки вирулентности возбудителя мелиоидоза BipD и BopE. Повысить иммунологическую эффективность предложенной авторами живой экспериментальной мелиоидозной вакцины планируется в перспективе за счет более детального изучения клеточных механизмов антибактериальной защиты с использованием МПЦ.
По литературным данным, одновременная активация СD4+ и CD8+ Т-клеток необходима для эффективной защиты животных от сибирской язвы и в последние годы с помощью МПЦ интенсивно изучается Т-клеточный иммунный ответ на летальный токсин и протективный антиген (ПА) Bacillus anthracis [69, 70]. В крови людей, привитых коммерческой адсорбированной сибиреязвенной вакциной (AVA-anthrax vaccine adsorbed, BioThrax, США), в течение пяти лет после вакцинации МПЦ позволяет регистрировать и подсчи-
тывать Т-клетки памяти с фенотипом CD45RA, ответственные за специфическое распознавание ПА возбудителя сибирской язвы, за гиперпродукцию IFN-g и TNF-a при повторном контакте этих клеток с ПА в условиях in vitro [52].
По результатам опытов на животных, холерный токсин вызывает иммунный ответ слизистой желудочно-кишечного тракта, зависимый от функциональной активации T-клеток, и прежде всего CD4+ Т-лимфоцитов-хелперов [40]. Разработан быстрый способ оценки эффективности иммунизации животных антигенами холерного вибриона, основанный на регистрации в крови относительного содержания активированных Т-хелперов с помощью МПЦ. При противохолерной вакцинации он используется для определения факторов, влияющих на тип и характер развивающегося иммунного ответа (способ введения, адъюванты и др.) [76]. Напряженный иммунитет к повторному заражению Vibrio cholerae формируется, как известно, у пациентов, перенесших холерную инфекцию. В крови и слизистой кишечника появляются антитела к липополи-сахариду (ЛПС), холерному токсину и другим специфическим антигенам возбудителя, но роль механизмов клеточного иммунитета в формировании у людей невосприимчивости к холерной инфекции еще фактически не изучена. По данным T.R. Bhuiyan и соавт. (2009) [34], впервые полученным с использованием МПЦ, при холере у людей развивается выраженный клеточный иммунный ответ с функциональной активацией Т-лимфоцитов-хелперов по типам Th1 (IFN-g) и Th2 (IL-13), а также наблюдается стимуляция цитотоксических Т-клеток. На стадии выздоровления из кровяного русла в желудочно-кишечный тракт мигрируют Т-клетки памяти с фенотипами CD4+ b7+ и CD8+ b7+ (gut-homing cells) для защиты организма от повторного заражения возбудителем. Эти исследователи считают, что холерная вакцина, способная вызвать у привитых людей аналогичную защитную клеточную реакцию, будет наиболее эффективной.
Таким образом, косвенная оценка протектив-ных свойств вакцин нового поколения против чумы, сибирской язвы, мелиоидоза, холеры, а также многих других опасных инфекций бактериальной и вирусной этиологии основана в последние годы на идентификации и подсчете в крови и органах иммунной системы Т-клеток памяти, а также функционально активированных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, имеющих различные и взаимодополняющие друг друга функции. При разработке и испытании вакцин против особо опасных инфекций, наряду с оценкой традиционных серологических показателей, необходим мониторинг популя-ционного и субпопуляционного состава клеток иммунной системы с использованием меченых моно-клональных антител (МКА) к определенным фено-типическим маркерам (CD-маркерам).
Адекватно решить эту сложную практическую задачу невозможно без использования МПЦ, кото-
рый специально разработан для быстрого количественного иммунофлуоресцентного анализа больших статистических выборок отдельных клеток [7, 23 - 25]. По существу, в МПЦ используется тот же принцип сортировки клеток по интенсивности им-мунофлуоресценции, что и в традиционном методе люминесцентной микроскопии. Только дифференцирование идет не на четыре субъективных уровня свечения (от 1+ до 4+), а автоматически на 512 и более (в зависимости от требуемой разрешающей способности) абсолютно одинаковых электронных уровней (каналов компьютера или анализатора импульсов). Клетка, изменившая интенсивность специфической иммунофлуоресценции всего на 1/512 часть исходного значения, обязательно будет воспринята фотодетектором цитометра как клетка с иными функциональными свойствами. Это лежит в основе автоматизации количественных цитологических исследований и обеспечивает возможность получения уникальной информации о функциональных сдвигах, происходящих в отдельных клетках иммунной системы под влиянием вакцинации [35, 57]. Защитная эффективность вакцин коррелирует с показателями Т-клеточного иммунитета, определяемыми с помощью МПЦ, в большей степени, чем с титрами специфических антител, особенно в том случае, когда проводится многопараметрический проточно-цитометрический анализ для идентификации и подсчета в крови и органах иммунной системы полифункциональных Т-клеток одновременно по нескольким поверхностным маркерам и/или внутриклеточным антигенам [54, 66].
По характерному профилю цитокинов, продуцируемых 004+ Т-лимфоцитами-хелперами, путем использования МПЦ определяют при вакцинации тип иммунного ответа: клеточный (ТИ1) и/или гуморальный (ТИ2). Оценка продукции цитокинов осуществляется с использованием специальных трехцветных или четырехцветных реагентов, включающих, кроме МКА к поверхностным С0-маркерам, МКА к исследуемым внутриклеточным цитокинам. Никакой другой метод исследования, кроме МПЦ, не позволяет проводить количественный анализ лимфоцитов в микрообъемах цельной крови людей или животных одновременно по двум и более фе-нотипическим маркерам с дополнительной оценкой внутриклеточной продукции сразу нескольких цитокинов (цитокиновый профиль) для автоматически идентифицированных и дифференцированных субпопуляций лимфоцитов с различными феноти-пическими свойствами [57]. Путем одновременного измерения содержания 1РИ-у (ТИ1) и И-4 (ТИ2) в отдельных Т-лимфоцитах-хелперах в настоящее время определяют, используя МПЦ, эффективность функционирования механизмов, регулирующих интенсивность клеточного и гуморального иммунного ответа при вакцинации против чумы или сибирской язвы [72]. А.Н. БМпп и соавт. [70] при разработке сибиреязвенных вакцин нового поколения предлагают контролировать с помощью МПЦ уровень син-
теза цитокинов в отдельных Т-клетках памяти людей и лабораторных животных.
Основой клеточной дифференцировки, определяющей тип развития иммунного ответа, являются процессы, связанные с регуляцией экспрессии генов [27]. Поэтому перспективу более глубокого изучения иммунологических механизмов, лежащих в основе защиты от возбудителей особо опасных инфекций, связывают с исследованием проводников сигналов и активаторов транскрипции (STATs - signal transducers and activators of transcription) [41], а также активируемых митоге-нами протеинкиназ (MAPKs - mitogen activated protein kinases), участвующих в передаче сигналов с поверхности к ядру эукариотической клетки и изменяющих свое функциональное состояние под влиянием факторов вирулентности патогенных бактерий [60]. Важно, что при изучении STATs и MAPKs чувствительность МПЦ в 10 раз выше, чем при Western blot-анализе, и требуется в 100 раз меньше клеток иммунной системы для быстрого получения необходимой информации [77]. С помощью МПЦ измеряется внутриклеточное содержание функционально активированных (фосфорилированных) STATs и MAPKs fàSTATs и рМАР^), меченных соответствующими флуоресцирующими МКА. Разработанные методы позволяют получать результаты анализа в динамике и, главное, на субпопуляционном уровне, что в принципе невозможно для традиционных биохимических методов, обеспечивающих получение только усредненной информации по всей неоднородной клеточной популяции в целом [42, 46, 50].
В области экстренной и специфической профилактики особо опасных инфекций прогресс возможен в ближайшем будущем - за счет генетических (ДНК) вакцин, которые имеют как существенные потенциальные преимущества, так и недостатки. Сконструированы и находятся на различных стадиях испытаний ДНК-вакцины для профилактики чумы, холеры, сибирской язвы, геморрагических лихорадок, оспы, бешенства и многих других инфекций. Однако все ДНК-вакцины пока существенно уступают по эффективности живым вакцинам, и продолжается поиск путей усиления иммунного ответа при генетической вакцинации [16]. Результат поиска во многом зависит от внедрения в практику МПЦ, так как именно этим методом в настоящее время оцениваются ключевые показатели клеточного иммунитета при разработке различных ДНК-вакцин [35]. В частности, МПЦ широко применяется при конструировании и испытании ДНК-вакцин против бешенства [43], а также при изучении механизмов иммунного ответа при геновакцинации, связанной с оригинальной системой доставки ДНК с помощью «теней» неживых клеток грамотрицательных бактерий, лишенных цитоплазматического содержимого, но сохраняющих морфологию и антигенные структуры [39].
Вышеперечисленные показатели Т-клеточного иммунитета широко используются при разработке и испытании вакцин против особо опасных инфекций пока только за рубежом. В России работа в данном направлении начата относительно недавно. В частности, предложено оценивать напряженность клеточного звена поствакцинального иммунитета к чуме путем определения экспрессии маркера ранней активации CD69 на CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах, стимулированных in vitro капсуль-ным антигеном чумного микроба [21].
оценка МПц показателей В-клеточного и гуморального иммунитета. В настоящее время разработаны быстрые цитофлуориметриче-ские методы, позволяющие идентифицировать и подсчитывать в крови и органах иммунной системы активированные В-клетки и В-клетки памяти по их специфическим поверхностным фе-нотипическим маркерам [7, 25, 35]. Путем измерения внутриклеточного содержания pSTATs и pMAPKs можно определять, используя МПЦ, сигнальный статус В-лимфоцитов и изучать молекулярные механизмы В-клеточной дифференцировки, приводящие к образованию в организме специфических антител или аутоантител, обладающих соответственно защитными и патогенными свойствами [42]. Анализ литературы свидетельствует, что оценка показателей В-клеточного иммунитета с использованием МПЦ - это перспективное, но еще недостаточно разработанное направление в современной вакцинологии [35]. Поэтому МПЦ еще не используется широко для определения показателей В-клеточного иммунитета при конструировании вакцин нового поколения против особо опасных инфекций.
Ведутся исследования по разработке эффективных тестов, позволяющих проводить быструю серодиагностику возбудителей инфекционных болезней у людей и животных с использованием МПЦ [30]. При определении в крови вакцинированных людей титров специфических антител к антигенам возбудителей чумы и туляремии цитофлуориметрические методы серодиагностики не отличаются по чувствительности от ИФА и приближаются по специфичности к иммуноблот-тингу, обладая при этом более высокой степенью надежности и достоверности [63, 73]. Перспективным направлением использования МПЦ при характеристике показателей гуморального иммунитета является также быстрая количественная оценка функциональной активности антител в системе их взаимодействия in vitro с зараженными клетками организма хозяина. Это наглядно иллюстрируют, например, результаты анализа, полученные с помощью МПЦ при оценке нейтрализующей активности антирабических иммуноглобулинов и определении эффективности вакцинации против бешенства по данному показателю [36, 78].
оценка показателей интенсивности пролиферации и апоптоза клеток иммунной системы при вакцинации против особо опасных инфекций. Лимфоциты, вступившие в контакт с антигенами, реагируют усилением процессов пролиферации и трансформации. Они увеличиваются в размерах, вступают в митоз, в них активируется синтез ДНК, РНК, белка. Поэтому иммунологическую активность различных клеточных популяций, а также иммунобиологические свойства антигенов, входящих в состав испытываемых вакцин, можно оценивать не только с помощью дорогостоящих МКА к фенотипическим клеточным маркерам - могут быть использованы относительно дешевые проточно-цитофлуориметрические методы оценки интенсивности пролиферации и бласттрансформа-ции лимфоцитов, которые являются экологически чистой альтернативой радиоизотопному методу и в сравнении с ним значительно более информативны [30, 35, 76].
В крови, тимусе, селезенке и регионарных лимфатических узлах кроликов, привитых против холеры препаратом холероген-анатоксин + О-антиген, относительное количество ДНК-синтезирующих лимфоцитов резко увеличивается, по нашим данным, полученным с использованием МПЦ, на первые и третьи сутки после вакцинации [12]. Так как через кровь обеспечивается обмен клетками между различными лимфоидными органами, по изменению в крови числа пролиферирующих клеток можно судить о характере развития иммунного ответа в организме привитых против холеры людей [13].
Проявление активности иммунной системы в ответ на введение в организм протективного антигена сопровождается процессами, связанными со считыванием генетической информации, что обязательно меняет активность центрального генетического аппарата (хроматина) иммунокомпетент-ных клеток. Активированный хроматин после его суправитальной окраски в образцах цельной крови красителем акридиновым оранжевым (АО) обладает повышенной интенсивностью зеленой флуоресценции (свечением комплексов АО-ДНК в области от 515 до 580 нм), что позволяет быстро подсчитывать с помощью МПЦ относительное содержание активированных лимфоцитов в суммарной лейкоцитарной популяции и использовать данный показатель для характеристики степени вовлеченности клеток иммунной системы в ответную реакцию на антигены исследуемой вакцины [9, 10].
На сегодняшний день МПЦ является единственным методом исследования, позволяющим измерять в условных единицах специфической ДНК-флуоресценции относительное содержание ДНК в отдельных иммунокомпетентных клетках и получать частотное распределение лейкоцитов по фазам клеточного цикла с определением их долевого соотношения в крови и органах иммунной системы на стадиях пролиферации Б + 02 + М (клетки, несущие более 2С ДНК на клетку) и апоптоза (клетки, несу-
щие менее 2С ДНК на клетку) [7]. Вакцинные штаммы не должны повреждать ядерный хроматин иммунокомпетентных клеток [2], вызывать, в отличие от вирулентных штаммов, их интенсивную гибель по типу апоптоза in vivo и in vitro [59]. Еще в 80 -90-е годы прошлого столетия было предложено использовать МПЦ для быстрого получения информации о цитотоксичности штаммов возбудителей особо опасных инфекций [8] и бактериальных антигенов [3]. В настоящее время цитотоксические свойства вакцинных препаратов оцениваются в России и за рубежом путем определения с помощью МПЦ степени их повреждающего воздействия на ядерный хроматин и цитоплазматические гранулы клеток иммунной системы [14, 18, 80].
Иммунологическую эффективность противочумных вакцин можно определять с применением МПЦ по их способности предотвращать в условиях in vitro цитотоксический эффект вирулентных штаммов возбудителя чумы на клетки иммунной системы организма хозяина [59]. По существу, если использовать преимущества МПЦ для сравнительной оценки интенсивности повреждения клеток привитого и не привитого против чумы организма, то способ подсчета числа погибших и выживших при экспериментальной чуме лабораторных животных можно заменить способом, учитывающим in vitro количество погибших и выживших клеток животных или человека [33]. В условиях невозможности оценки иммуногенности противочумных вакцин для людей биологическим методом это особенно актуально. В РосНИПЧИ «Микроб» в настоящее время разработана экспериментальная система для характеристики антифагоцитарных и ци-тотоксических свойств чумного микроба, основанная на добавлении живых бактерий в цельную де-фибринированную кровь человека, на измерении с помощью МПЦ относительного содержания ДНК и бактерицидных (азурофильных) гранул в отдельных лейкоцитах культивируемой крови. С ее помощью установлено, что противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития в крови индуцируемого чумными микробами апоптоза [26].
Проточно-цитофлуориметрический мониторинг апоптоза и пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток в модели RITARD (removable intestinal tie adult rabbit diarrhea) холерного инфекционного процесса позволил установить значения данных показателей в зависимости от различного исхода инфекции в вакцинированном и не вакцинированном организме [53]. Холерные вакцины, существенно различающиеся по своей иммунологической эффективности, формировали в иммунном организме различную степень устойчивости клеток крови, костного мозга и селезенки к индуцируемому возбудителем холеры апоп-тозу [14].
Применение МПц для оценки функциональной активности клеток врожденного иммунитета. В настоящее время сформулирована концепция конструирования нового типа вакцин для создания быстрой неспецифической иммунологической защиты от патогенов путем активации системы врожденного иммунитета [17]. Активаторами клеточных элементов, входящих в эту систему (кератиноцитов, эпителиальных клеток, нейтрофилов, моноцитов, макрофагов, дендритных клеток и др.) являются лиганды (патоген-ассоциированные молекулярные структуры микроорганизмов), взаимодействующие с образраспознающими (Toll-подобными) рецепторами клеток иммунной системы организма хозяина [19, 75]. Важную роль играют также рецепторы, которые с помощью уникального молекулярного механизма активируются бактериальными и лейкоцитарными протеазами (protease-activated receptors) и функционируют в кооперации с Toll-подобными рецепторами [64, 71].
Для оценки активации системы врожденного иммунитета МПЦ открывает уникальные возможности и перспективы, но это направление практического использования данного метода находится с точки зрения вакцинологии на самой начальной стадии своего развития, если сравнивать его с выдающимися современными достижениями в сфере оценки показателей Т-клеточного иммунитета [35].
Дальнейшее совершенствование специфической профилактики чумы и сибирской язвы требует детального изучения с использованием МПЦ взаимодействия антигенов Y. pestis и В. anthracis с дендритными клетками, так как недостаточным созреванием и неэффективным функционированием дендритных клеток объясняют низкую эффективность специфической иммунологической защиты от этих двух особо опасных инфекций при однократной вакцинации [72]. С помощью МПЦ в настоящее время контролируют экспрессию TLR (Toll-like receptors) и других рецепторов в моноцитах, макрофагах и дендритных клетках [5, 67], определяют степень заражения клеток организма хозяина вирусами и бактериями [30, 78], быстро оценивают различные количественные показатели фагоцитарной реакции [15, 20, 38, 67], а также регистрируют степень активации клеток системы врожденного иммунитета по интенсивности их секреторной (азурофильной) дегрануляции [26, 28, 49] или продукции провоспалительных цитокинов [37, 65].
С учетом сомнений по поводу экстраполяции на людей экспериментальных данных, полученных в опытах на лабораторных животных, необходимы исследования, выполненные на моделях взаимодействия возбудителей особо опасных инфекций с клетками врожденного иммунитета людей и приматов [26, 51]. Благодаря использованию МПЦ удалось экспериментально доказать, что у зараженных чумными микробами моноцитов и дендритных клеток человека сохраняется важная функция переработки и представления специфиче-
ских бактериальных антигенов Т-лимфоцитам, несмотря на то, что факторы вирулентности Y. pestis нарушают функционирование бактерицидных механизмов и активируют гибель клеток врожденного иммунитета [67]. В этих уникальных исследованиях, недавно выполненных американскими учеными, МПЦ использовали: для контроля экспрессии в клетках ИЯ-Э, ответственных за распознавание бактериальной ДНК; для дифференцирования и подсчета клеток, зараженных чумными микробами; для определения доли клеток, находящихся на стадии гибели по типу апоптоза; для идентификации цитотоксических Т-лимфоцитов с фенотипом 008+ и определения функциональной активности этих клеток по уровню внутриклеточной продукции цитокинов.
Косвенная оценка иммунологической эффективности вакцин все чаще проводится в последние годы с использованием показателей функционального статуса нейтрофилов, на долю которых у людей приходится более 90% циркулирующих в крови клеток врожденного иммунитета [22]. Одним из таких показателей является формирование внеклеточных нейтрофильных ловушек (ВНЛ), осуществляющих киллинг патогенных бактерий с большей эффективностью, чем при фагоцитозе [4]. Образование ВНЛ под влиянием цитокинов, продуцируемых тромбоцитами, моноцитами и активированными Т-лимфоцитами, играет, как предполагают, ключевую роль в предотвращении генерализации инфекционного процесса. Появился термин «внутрисосу-дистый иммунитет», который означает, что клетки врожденного иммунитета человека и животных могут осуществлять киллинг патогенных бактерий непосредственно в кровеносных сосудах - путем секреции во внеклеточное пространство сетеподоб-ных структур, состоящих из ядерного хроматина и содержимого бактерицидных гранул нейтрофильных гранулоцитов [45, 79].
С точки зрения регистрации уровня активации системы врожденного иммунитета и оценки влияния этой системы на функционирование клеточных механизмов адаптивного иммунитета большое значение может иметь уникальная способность МПЦ количественно определять содержание нейтральных протеаз в отдельных лейкоцитах крови человека и животных с использованием соответствующих специфических флуорогенных субстратов или препаратов меченых специфических МКА [23, 47]. Дело в том, что грызуны существенно отличаются от людей и других крупных млекопитающих по активности и субстратной специфичности трех наиболее изученных протеаз (эластаза, катепсин О и протеаза-3), локализованных в бактерицидных гранулах нейтрофилов периферической крови [31] и играющих важную роль в киллинге патогенных бактерий. Являясь триггерами воспаления и ключевыми регуляторами иммунного ответа, эти сери-новые лейкоцитарные протеазы расщепляют бактериальные антигены, обладающие иммуностиму-
лирующими свойствами, регулируют экспрессию рецепторов и антигенов на поверхности клеток иммунной системы, а также модулируют клеточную реакцию на ТИР-а и интерлейкины. Действуя подобно адъювантам, они активируют у вакцинированных лабораторных животных механизмы Т-клеточного иммунитета, модулируют процесс созревания и ан-тигенпрезентирующую функцию дентритных клеток, участвующих в формировании адаптивного иммунитета, а также существенно стимулируют продукцию специфических антител [32, 61].
Таким образом, анализ литературы свидетельствует, что в новом тысячелетии изменился подход к оценке качества вакцин, разрабатываемых для про-
филактики особо опасных инфекционных заболеваний. Оценку показателей клеточного и гуморального иммунитета при испытании вакцин нового поколения против чумы, холеры, сибирской язвы и многих других особо опасных инфекций все чаще осуществляют в последние годы с помощью МПЦ. Благодаря созданию и внедрению в практику новых проточно-цитометрических технологий планируется повысить в ближайшем будущем эффективность косвенной оценки иммунологической активности и безвредности вакцин в различных экспериментальных системах in vitro, создать необходимую основу для прогнозирования и оценки качества вакцин в опытах с клетками иммунной системы человека. ■
Литература
1. Бывалов А.А., Дубровин М.Ю., Елагин Г.Д. и др. Зависимость между уровнем сероперестройки вакцинированных животных и напряженностью иммунитета к экспериментальной чуме // Клин. лаб. диагн. 2007. № 7. С. 48 - 51.
2. Волгарева Г.М. Генотоксичность вакцин: проблема с незавершенным решением // Генетика. 1995. № 31 (4). С. 437 - 457.
3. Гусева Н.П., Ермакова Г.В., Кравцов А.Л., Наумов А.В. Цитотоксиче-ское действие липополисахарида чумного микроба и его липосо-мальной формы на лимфоциты крови мышей / Актуальные проблемы и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций. - Саратов, 1991. С. 35 - 38.
4. Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса ней-трофилов. - М.: Издательство РАМН, 2009. - 208 с.
5. Ильинская А.Н., Пичугина Л.В., Олиферук Н.С. и др. Компонент бактериального пептидогликана как фактор созревания макрофагов // Иммунология. 2005. № 1. С. 12 - 15.
6. Исачкова Л.М., Плехова Н.Г. К развитию представлений об антиинфекционной резистентности // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. № 1. С. 11 - 15.
7. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др. Клетки крови - современные технологии их анализа. - М.: Триада-фарм, 2002. -535 с.
8. Кравцов А.Л., Ледванова Т.Ю., Сергеева Г.М., Коровкин С.А. О различном воздействии клеток вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба на структуру хроматина лейкоцитов зараженных животных / Микробиология и биохимия особо опасных инфекций. - Саратов, 1988. С. 59 - 62.
9. Кравцов А.Л., Наумов А.В., Коровкин С.А. и др. Использование двухцветной цитофлуориметрии в потоке для быстрого обнаружения и количественной оценки изменений в функциональной активности лейкоцитов в процессе иммуногенеза при чуме / Микробиология, биохимия и специфическая профилактика карантинных инфекций. - Саратов, 1990. С. 66 - 74.
10. Кравцов А.Л., Шведун Г.П., Ледванов М.Ю. О действии продуктов плазмид У. pestis на лейкоциты крови морских свинок в процессе иммуногенеза при чуме по данным цитофлуориметрическо-го анализа // Проблемы особо опасных инфекций. 1993. № 3 (73). С. 135 - 146.
11. Лавров В.Ф., Кузин С.Н. Механизмы формирования иммунологической памяти и вакцинация // Эпидемиология и Вакцинопрофилак-тика. 2004. № 4 (17). С 39 - 41.
12. Ледванов М.Ю., Адамов А.К., Кравцов А.Л., Наумов А.В. Влияние иммунизации холерной вакциной на синтез ДНК в лимфоцитах / Механизмы формирования иммунитета к особо опасным инфекциям. - Саратов, 1986. С. 76 - 85.
13. Ледванов М.Ю., Тихонов Н.Г., Адамов А.К. и др. Распределение лимфоцитов по фазам клеточного цикла в популяциях Т, В, й, 0 в крови людей и в органах иммунной системы животных, вакцинированных против холеры // ЖМЭИ. 1986. № 10. С. 80 - 85.
14. Лоцманова Е.Ю. Оценка эффективности пероральных холерных вакцин в ШТАРй-модели на этапе доклинических испытаний: Автореф. дис. ... к.м.н. - Саратов, 2006. - 22 с.
15. Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитофлуориметрии // Иммунология. 2000. № 2. С. 57 - 59.
16. Попов Ю.А., Микшис Н.И. Генетические (ДНК) вакцины // Проблемы особо опасных инфекций. 2010. № 105. С. 20 - 24.
17. Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов // ЖМЭИ. 2007. № 4. С. 93 - 100.
18. Синичкина Н.А., Кравцов А.Л., Наумов А.В. и др. Сравнительный ци-тофлуориметрический анализ лейкоцитов крови морских свинок
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31
32.
33.
34.
35.
36.
37
38.
39.
при воздействии фосфолипазы Д и некоторых антигенов возбудителя чумы // ЖМЭИ. 1992. № 11 - 12. С. 52 - 54. Сорокина Е.В., Масюкова С.А., Курбатова Е.А., Егорова Н.Б. Терапевтическая бактериальная вакцина Иммуновак в комплексном лечении пациентов с хронической пиодермией // ЖМЭИ. 2010. № 4. С. 31 - 37.
Филатов А.В., Храмцов А.В., Сенченков Е.П., Земсков В.М. Кинетика закисления в фагосомах макрофагов по данным проточной цитофлуориметрии // Цитология. 1983. № 25 (6). С. 707 - 710. Фирстова В.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М. и др. Определение экспрессии маркера ранней активации CD69 на лимфоцитах иммунных мышей после стимуляции их антигенами чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 2010. № 103. С. 56 - 59. Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови. - М.: Медицина, 1985. - 176 с.
Хайдуков С.В. Проточная цитофлуориметрия как современное средство диагностики // Лаборатория. 1998. № 10. С. 7 - 10. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Цитометрический анализ субпопуляций Т-хелперов (Th±, Th2, Treg, Th, T-хелперы активированные) // Медицинская иммунология. 2011. № 13 (1). С. 7 - 16. Чередеев А.Н., Горлина Н.А., Козлов И.Г. СD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий // Клин. лаб. диагн. 1999. № 6. С. 25 - 32.
Шмелькова Т.П. Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro: Автореф. дис. ... к.б.н. - Саратов, 2008. - 26 с.
Ярилин А.А. Транскрипционные регуляторы дифференцировки Т-хелперов // Иммунология. 2010. № 3. С. 153 - 168. Abrams W., Diamond L., Kane A. A flow cytometric assay of neutrophil degranulatlon // J. Histochem. Cytochem. 1983. V. 31 (6). Р. 734 - 744. Allen J., Scowera A., Rubin G. et al. Long-lasting T cell responses to biological warfare vaccines in human vaccines // Clin. Infect. Dis. 2006. V. 43. Р. 1 - 7.
Alvarez-Barrientos A., Arroyo J., Canton R. et al. Applications of flow cytometry to clinical microbiology // Clin. Microbiol. Rev. 2000. V. 13 (2). Р. 167 - 195.
Ashe B., Zimmerman M. Comparison of the neutral proteinases of polymorphonuclear leukocytes of several experimental animal species // Biochem. Int. 1982. V. 5 (4). Р. 487 - 494.
Bank U., Ansoge S. More th^n destructive: neutrophil-derived proteinases in cytokine bioactivity control // J. Leukocyte Biology. 2001. V. 69. Р. 197 - 206.
Bashaw J., Norris S., Weeks S. et al. Development of in vitro correlate assay of immunity to infection with Yersinia pestis // Clinical and Vaccine Immunology. 2007. V. 14 (5). Р. 605 - 616. Bhuiyan T., Lundin S., Khan A. et al. Cholera caused by Vibrio cholerae 01 induces T-cell responses in the circulation // Infect. Immun. 2009. V. 77 (5). Р. 1888 - 1893.
Bolton D., Roederer M. Flow cytometry and the future of vaccine development // Expert Rev. Vaccines. 2009. V. 8 (6). Р. 779 - 789. Bordignon J., Comin F., Ferreira S. et al. Calculating rabies virus neutralizing antibodies titres by flow cytometry // Rev. Inst. Med. Trop Sao Paulo. 2002. V. 44 (3). Р. 151 - 154.
Bueno C., Almeida J., Alguero M. et al. Flow cytometric analysis of cytokine production by normal human peripheral blood dendritic cells and monocytes: comparative analysis of different stimuli, secretion-blocking agents and incubation periods // Cytometry. 2001. V. 46. Р. 33 - 40.
Cinco M., Murgia R., Perticarari S., Presani G. Simultaneous measurements by flow cytometry of phagocytosis and metabolic burst induced in phagocytic cells in whole blood by Borrelia burgdorferi // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 122. Р. 187 - 194. Ebensen T., Paukner S., Link C. et al. Bacterial ghosts are an efficient delivery system for DNA vaccines // J. Immunology. 2004. № 172. Р. 6858 - 6865.
40. Elson C., Ealding W. Ir gene control of the immune secretory IgA response to cholera toxin // Eur. J. Immunol. 1987. V. 17. P. 425 - 428.
41. Elvin S., Williamson E. Stat4 but not Stat6 mediated immune mechanisms are essential in protection against plague // Microbial Pathogenesis. 2004. V. 37 (4). P. 177 - 184.
42. Grammer A., Fischer R., Lee O. et al. Flow cytometric assessment of the signaling status of human B lymphocytes from normal and autoimmune individuals // Arthritis Res. Ther. 2004. V. 6 (1). P. 28 - 38.
43. Gupta P., Dahiya S., Kumar P. et al. Sindbis virus replicon-based DNA vaccine encoding rabies virus glycoprotein elicits specific humoral and cellular immune response in dogs // Acta Virologica. 2009. V. 53. P. 83 - 88.
44. Haque A., Chu K., Easton A. et al. A live experimental vaccine against Burkholderia pseudomallei elicits CD4+ T cell-mediated immunity, priming T cells specific for 2 type III secretion system proteins // J. Infectious Diseases. 2006. V. 194 (9). P. 1241 - 1248.
45. Hickey M., Kubes P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels // Nature Rev. Immunol. 2009. V. 9. P. 364 - 375.
46. Hubert P., Grenot P., Autran B., Debre P. Analysis by flow cytometry of tyrosine-phosphorylated proteins in activated T-cell subsets on whole blood samples // Cytometry. 1997. V. 29. P. 83 - 91.
47. Ito Y., Kawanishi Y., Shoji N., Ohyashiki K. Decline in antibiotic enzyme activity of neutrophils is a prognostic factor for infections in patients with myelodysplastic syndrome // Clin. Invest. Dis. 2000. V. 31 (5). P. 1292 - 1295.
48. Kelly D., Pollard A., Moxon E. Immunological memory: the role of B cells in long-term protection against invasive bacterial pathogens // JAMA. 2005. V. 294 (23). P. 3019 - 3023.
49. Kravtsov A., Bobyleva E., Grebenyukova T. et al. Flow microfluorometric analysis of phagocyte degranulation in bacteria infected whole blood cell cultures // Proc. SPIE. 2002. V. 4707. P. 395 - 402.
50. Krutzik P., Clutter M., Nolan G. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry // J. Immunology. 2005. V. 175. P. 2357 - 2365.
51. Kummer L., Szaba F., Parent M. et al. Antibodies and cytokines independently protect against pneumonic plague // Vaccine. 2008. V. 26 (52). P. 6901 - 6907.
52. Kwok W., Yang J., James E. et al. The anthrax vaccine adsorbed vaccine generates protective antigen (PA)-specific CD4+,T cells with a phenotype distinct from that of naive PA T cells // Infect. Immun. 2008. V. 76 (10). P. 4538 - 4545.
53. Lotzmanova E., Kravtsov A., Livanova L. et al. Flow cytofluorometric monitoring of leukocyte apoptosis in experimental cholera // Proc. SPIE. 2002. V. 5068. P. 462 - 466.
54. McElhaney J., Xie D., Hager W. et al. T cell responses are better correlates of vaccine protection in the elderly // J. Immunol. 2006. V. 176 (10). P. 6333 - 6339.
55. Mellman I., Stainman R. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines // Cell. 2001. V. 106. P. 255 - 258.
56. Metz B., van den Dobbelsteen G., van Els C. et al. Quality-control issues and approaches in vaccine development // Expert Rev. Vaccines. 2009. V. 8 (2). P. 227 - 238.
57. Nomura L., Walker J., Maecker H. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4+ T cells // Cytometry. 2000. V. 40. P. 60 - 68.
58. Parent M., Berggren K., Kummer L. et al. Cell-mediated protection against pulmonary Yersinia pestis infection // Infect. Immun. 2005. V. 73 (11). P. 7304 - 7310.
59. Parrino J., Hotchkiss R., Bray M. Preventation of immune cell apoptosis as potential therapeutic strategy for severe infections // Emerg. Infec. Dis. 2007. V. 13 (2). P. 191 - 198.
60. Perez O., Nolan G. Simultaneous measurement of multiple active kinase states using polychromatic flow cytmetry // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 155 - 162.
61. Pham C. Neutrophil serine proteases fine-tune the inflammatory response // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2008. V. 40 (6 -7). P. 1317 - 1333.
62. Philipovskiy A., Smiley S. Vaccination with live Yersinia pestis primes CD4 and CD8 T cells that synergistically protect against lethal pulmonary Y. pestis infection // Infect. Immun. 2007. V. 75 (2). P. 878 - 885.
63. Porsch-Özcürümez M., Kischel N., Priebe H. et al. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay, Western blotting, microagglutination, indirect immunofluorescence assay, and flow cytometry for serological diagnosis of tularemia // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. V. 11 (6). P. 1008 - 1015.
64. Rallabhaudi P., Nhu Q., Toshchakov V. et al. Analysis of proteinase-activated receptor 2 and TLR4 signal transduction: a novel paradigm for receptor cooperativity // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 24314 - 24325.
65. Rodriguez-Caballero A., Garcia-Montero A., Bueno C. et al. A new simple whole blood flow cytometry-based method for simultaneous identification of activated cells and quantitative evaluation of cytokines released during activation // Lab. Investigation. 2004. V. 84. P. 1387 - 1398.
66. Roederer M., Brenchley J., Betts R., De Rosa S. Flow cytometric analysis of vaccine responses: how many colors are enough? // Clin. Immunol. 2004. V. 110 (3). P. 199 - 205.
67. Saikh K., Kissner T., Dyas B. et al. Human cytolytic T cell recognition of Yersinia pestis virulence proteins that target innate immune responses // J. Infectious Diseases. 2006. V. 194. P. 1753 - 1760.
68. Seder R., Darrah P., Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design // Nat. Rev. Immunol. 2008. V. 8 (4). P. 247 - 258.
69. Shaw C., and Starnbach M. Both CD4* and CD8* T cells respond to antigens fused to anthrax toxin // Infect. Immun. 2008. V.76 (6). P. 2603 - 2611.
70. Shinn A., Bravo N., Maecker H., Smith J. TNF-alpha detection using a flow cytometric assay to determine cellular responses to anthrax vaccine // J. Immunol. Methods. 2003. V. 282 (1 - 2). P. 169 - 174.
71. Shpacovitch V., Feld M., Hollenberg M. et al. Role of protease-activated receptors in inflammatory response, innate and adaptive immunity // J. Leukocyte Biology. 2008. V. 83. P. 1309 - 1322.
72. Skowera A., de Jong E., Schuitemaker J. et al. Analysis of anthrax and plague biowarfare vaccine interactions with human monocyte-derived dendritic cells // J. Immunol. 2005. V. 175. P. 7235 - 7243.
73. Splettstoesser W., Grunow R., Rahalison L. et al. Serodiagnosis of human plague by a combination of immunomagnetic separation and flow cytometry // Cytometry. 2003. V. 53 A (2). P. 88 - 96.
74. Szaba F., Kummer L., Wilhelm L. et al. D27-pLpxL, an avirulent strain of Yersinia pestis, primes T cells that protect against pneumonic plague // Infect. Immun. 2009. V. 77. P. 4295 - 4304.
75. Tang A., Brunn G., Cascalho M. et al. Pivotal advance: endogenous pathway to SIRS, sepsis, and related conditions // J. Leukocyte Biology. 2007. V. 82. P. 282 - 285.
76. Tanvir A. Vaccination against cholera and ETEC diarrhea and interventions to improve vaccine immune response / Printed by University of Gothenburg, Sweden, 2009.
77. Uzel G., Frucht D., Fleisher T., Holland S. Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry // Clin. Immunol. 2001. V. 100. P 270 - 276.
78. Vengatesan D., Raj G., Raja A. et al. Detection of rabies virus antigen or antibody using flow cytometry // Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 2006. V. 70 B. P 335 - 343.
79. Von Köckritz-Blickwede M., Nizet V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps // J. Mol. Med. 2009. V. 87 (8). P. 775 - 783.
80. Zaritskaya L., Shafer-Weaver K., Gregory M. et al. Application of a flow cytometric cytotoxicity assay for monitoring cancer vaccine trails // J. Immunotherapy. 2009. V. 32 (2). P. 186 - 194.
