CC BY
98
■ К ВОПРОСУ О ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ПОРОКОВ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
Беленкова О.В., Шабалдин А.В., Земерова Т.В., Лисаченко Г.В.
ООО «Авиценна»,
Кемеровская государственная медицинская академия, МУЗ Клинический диагностический центр,
г. Кемерово
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ В ДИАГНОСТИКЕ ИММУННЫХ ПРИЧИН РЕПРОДУКТИВНЫХ ПОТЕРЬ
Показана значимость проточной иммунной флуоресцентной цитометрии в выявлении факторов, блокирующих HLADR молекулы. При физиологической беременности в 80 % случаев блокируются HLADR на А-мононуклеарах (CD3 отрицательных). Иммунные формы репродуктивных потерь в 50 % ассоциированы с отсутствием блокирования HLADR на А-мононуклеарах (CD3 отрицательных), а в 30 % - с активацией HLADR на эффекторных лимфоцитах (CD3 положительных).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА:репродуктивные потери; HLADR; проточная иммунофлуоресцентная цитометрия.
Belenkova O.V., Shabaldin A.V., Zemerova T.V., Lisachenko G.V.
OLL «Avicenna»,
Kemerovo State Medical Academy,
Clinical diagnostic center, Kemerovo
APPLICATION OF FLOW CYTOMETRY IN DIAGNOSTICS OF THE IMMUNE REASONS OF REPRODUCTIVE LOSSES
The importance of application of flowing immune fluorescent assay in revealing of the factors blocking HLADR molecules was shown. At physiological pregnancy in 80 % of cases are blocked HLADR on A-cells (CD3 negative). Immune forms of reproductive losses in 50 % of cases are associated with absence of blocking HLADR on A-cells (CD3 negative), and in 30 % of cases - with activation HLADR on effects's lymphocytes (CD3 positive).
KEY WORDS: reproductive losses; HLADR; immune fluorescent flow cytometry.
Частота репродуктивных потерь остается высокой, как в целом в Российской Федерации, так и в Кемеровской области в частности [1, 2]. Показано, что причины привычного невынаши-
Корреспонденцию адресовать:
ШАБАЛДИН Андрей Владимирович,
650003, г. Кемерово, пр. Ленинградский, д. 47а, кв. 108. Тел.: +7-903-907-51-97.
E-mail: weit2007@yandex.ru
вания ранних сроков беременности, связанные с нарушениями иммунного распознавания полуаллоген-ного зародыша, занимают лидирующие позиции [3].
Формирование и вынашивание беременности является иммунным процессом, рестриктированным по антигенам главного комплекса гистосовместимости (HLA) [4]. Согласно современной концепции иммунологии репродукции, на оплодотворенном яйце экспрессируются эмбриональные антигены тканевой совместимости — HLA G, что принципиально изменяет
иммунный ответ: блокируются Т-киллеры и активируются Т-хелперы II типа, вырабатывающие трофические интерлейкины 4, 6, 10 [4, 5]. В то же время, при фертилизации происходит гибель и фагоцитирование более миллиона сперматозоидов, и презентация А-клетками аллогенных мужских антигенов в комплексе с классическими HLA иммуннокомпетентными клетками женщины [3]. С этих позиций остается открытым вопрос о механизмах блокирования эффекторного иммунного ответа по отношению к аллогеным антигенам зародыша. Этот вопрос актуален и в рамках диспута о роли антилейкоцитарных или антиHLA антител, выявляемых в больших титрах у многорожавших женщин [6].
Современный метод проточной цитофлуометрии позволяет наглядно увидеть взаимодействие антител, в том числе и против молекул HLA, с различными субпопуляциями лейкоцитов и лимфоцитов [7].
Цель настоящей работы — изучение роли ан-тиHLADR антител материнского происхождения в блокировании индукторной и эффекторной фаз иммунного ответа к аллогенным HLA мужского происхождения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В соответствии с целью исследования, было проведено клинико-лабораторное обследование 1072 семейных пар, обратившихся в период 2000-2009 гг. за различными консультациями в МУЗ «Детская городская клиническая больница № 5» г. Кемерово. Возраст женщин был в пределах от 18 до 43 лет, а мужчин — от 19 до 51 лет. В ходе работы проводился подробный клинико-анамнестический анализ, общий осмотр, гинекологическое бимануальное исследование.
По результатам обследования были выделены две группы семейных пар: исследуемая группа и группа сравнения.
Исследуемую группу (группа I) составили 484 женщины с потерями плода (в сроки беременности до 12 недель гестации) неясной этиологии и текущей беременностью на фоне угрозы прерывания. Предположение об иммунных нарушениях, сопровождающих репродуктивные потери, было сделано на основании исключения других возможных причин (гормональных, анатомических, хромосомных). Иммунологические исследования проводили во время текущей беременности в сроки до 11 недель.
Группу сравнения (группа II) составили 588 женщин с физиологическим течением беременности и отсутствием в анамнезе спонтанных абортов. Иммунологические исследования проводили в сроки беременности до 11 недель. Более 95 % обследуемых в
сравниваемых группах были представлены кавказои-дами и достоверных различий по возрасту не имели.
У всех обследованных забирали венозную кровь. Мононуклеары периферической крови получали из периферической крови на градиенте плотности (1,077) по стандартной методике. Доводили концентрацию клеток до 400000 в 200 мкл среды: RPMI-1640 с добавлением 0,3 мг/мл L-глутамина и 20 % эмбриональной сыворотки крови крупно-рогатого скота (ЭТС), и далее культивировали в круглодонных пробирках для проточной цитометрии при 37°С.
Схема смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) была следующая: в первую пробирку добавляли в равных концентрациях (по 200000 клеток в объеме 100 мкл культуральной среды) женские и мужские лимфоциты и смешивали их (400000 клеток в общем объеме 200 мкл культуральной среды — Сэ), и отдельно ставили пробирки с женскими (Жэ) и мужскими (Мэ) лимфоцитами в идентичной среде в равной СКЛ концентрации клеток (400000 клеток в 200 мкл среды). Культивировали 2 часа при температуре 37°С. После окончания инкубации во все лунки вносили 10 мкл смеси моноклональных антител (антиHLADR-PE/антиCD3-FITС) по инструкции производителя. Результаты оценивали с помощью проточной цитометрии на проточном иммуноцитометре Beckman Coulter, Epics XL-MCL по уровню экспрессии HLADR на лимфоцитах с фенотипами CD3+HLADR+ и CD3-HLADR+ в СКЛ против контрольных женских и мужских лимфоцитов с теми же фенотипами. Рассчитывали коэффициент СКЛ по формуле [адаптировано из 8]:
Кскл = {1 - [(Жэ + Мэ) / 2] / Сэ} х 100 %.
Блокирующую активность женской сыворотки крови в СКЛ оценивали согласно протоколу 11-го Международного Уоркшопа по тканевой совместимости (IHWS, Koyama et al., 1991) путем внесения 20 % исследуемой женской аутосыворотки (АС) вместо ЭТС при постановке выше описанной СКЛ (Кскла). Параллельно выполняли СКЛ с ЭТС (Ксклэ). Активность женской считалась блокирующей, если коэффициент СКЛ с АС был выше коэффициента с ЭТС. Для количественной оценки блокирующего или стимулирующего эффекта АС производили расчет коэффициента блокирования (Кб) = (Ксклэ — Кскла).
Экспрессия HLADR на лимфоцитах в СКЛ и в спонтанных культурах лимфоцитов женщины и мужчины, а также эффект женской сыворотки на СКЛ супругов, показаны на рисунке 1.
Как видно из рисунка 1, HLADR молекула экспрессировалась, как на клетках CD3+ (квадрат В2), так и на клетках CD3- (квадрат В1). Известно, что CD3+HLADR+ является фенотипом активирован-
Сведения об авторах:
БЕЛЕНКОВА Ольга Викторовна, врач акушер-гинеколог, ООО «Авиценна», г. Кемерово, Россия.
ШАБАЛДИН Андрей Владимирович, доктор мед. наук, ассистент, кафедра оториноларингологии, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России, г. Кемерово, Россия. E-mail: weit2007@ yandex.ru
ЗЕМЕРОВА Татьяна Валерьевна, врач дерматовенеролог, МУЗ Клинический диагностический центр, г. Кемерово, Россия.
ЛИСАЧЕНКО Геннадий Васильевич, доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России, г. Кемерово, Россия.
■ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ В ДИАГНОСТИКЕ ИММУННЫХ ПРИЧИН РЕПРОДУКТИВНЫХ ПОТЕРЬ____________
Рисунок 1
Экспрессия HLADR на лимфоцитах в СКЛ с эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (СКЛэ), в СКЛ с женской аутосывороткой и в контрольных спонтанных культурах лимфоцитов мужчины (мужа) и женщины (жены)
[j 1 1
Oh
І Л 1 ■ і Л
І И . * ■ \
\
v;
ft — d і
I- * 111 і
1
t
1 I
І!
z
1-
с
ї
r j
ЇЙ . j
1 1
1 . ■ - v-i* •ж _ \ J- * i'} ‘jfe* t ' t
(Н-ІЗЕІ
ных Т-лимфоцитов (эффекторов), а фенотип CD3-HLADR+ — В-лимфоцитов, макрофагов, моноцитов и дендритных клеток (АГ-презентирующих клеток или А-клеток) [7]. Для оценки избирательного влияния супрессорных факторов на экспрессию HLADR эф-фекторных и АГ-презентирующих лимфоцитов про-
водили сравнение изменения субпопуляционного состава по фенотипам CD3+HLADR+, CD3-HLADR+ в СКЛ с ЭТС по отношению к СКЛ с АС.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ППП (Statistica 5.0 for WINDOWS). Относительные величины сравни-
Information about authors:
BELENKOVA Olga Viktorovna, the accoucheur-gynecologist of OLL «Avicenna», Kemerovo, Russia.
SHABALDIN Andrey Vladimirovich, doctor of medical sciences, assistant, chair of otorhinolaryngology, Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia. E-mail: weit2007@yandex.ru
ZEMEROVA Tatyana Valerevna, the dermatologist-venerologist, Clinical diagnostic center, Kemerovo, Russia.
LISACHENKO Gennady Vasilevich, doctor of medical sciences, professor, managing chair of pathological physiology, Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia.
вали с помощью точного метода Фишера для малых выборок [9]. Нулевую гипотезу отвергали при ошибке достоверности менее 5 %, что соответствует биологическим и медицинским исследованиям.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сопоставление исследуемой группы с группой сравнения по приросту экспрессии HLADR на лимфоцитах в СКЛ (Кскл) без учета маркера CD3 показало следующее. В группе семей с репродуктивными потерями Кскл был достоверно ниже, чем в группе сравнения (3,9 ± 0,7 % против 11,5 ± 1,9 % в контроле, р < 0,05). Интервал Кс при невынашивании беременности находился в пределах 0,5-6 %, а при физиологической беременности — 7-16 %. Тем самым, активация экспрессии HLADR на иммуноком-петентных клетках беременной при распознавании аллогенных антигенов зародыша свыше 6 % обеспечивает вынашивание беременности.
Эти данные еще раз показали значимость первичного иммунного распознавания материнским иммунным микроокружением аллогенных антигенов оплодотворенного яйца. Результатом этого распознавания явилась активация мононуклеаров и появление на их поверхности дополнительных молекул HLADR. Тем самым, следующим этапом иммунного ответа должно быть отторжение полуаллогенного зародыша. Но этого не происходит, напротив, в группе семей с репродуктивными потерями экспрессия HLADR на имму-нокомпетентных клетках снижена. Вполне вероятно, и это согласуется с литературными данными, что изменение направленности эффекторного иммунного
ответа к аллогенным антигенам зародыша связано с женскими супрессорными репродуктивными факторами. Особенности влияния этих факторов на ал-логенное иммунное распознавание проследили в реакции СКЛ с женской аутосывороткой.
Выявили различные эффекты влияния женской аутосыворотки на СКЛ-индуцированную экспрессию HLADR в различных субпопуляциях лимфоцитов, в частности CD3+ (Т-лимфоциты, активные) и CD3-(макрофаги, моноциты и В-лимфоциты).
На рисунке 2 показан эффект блокирования АС молекул HLADR на АГ-презентирующих клетках. Так, на рисунке 2а показано, что в СКЛ с добавлением в культуральную среду ЭТС HLADR молекулы были представлены как на CD3+ лимфоцитах (квадрат В2 — 6 %), так и на CD3- мононуклеарах (квадрат В1 — 8 %). При проведении аналогичной СКЛ, но с добавлением в культуральную среду АС, распределение HLADR на субпопуляциях мононуклеа-ров принципиально изменилось. Как видно из рисунка 2б, количество клеток HLADR+CD3- снизилось, по сравнению с СКЛ с ЭТС, до 1 % (квадрат В1), а количество лимфоцитов HLADR+,CD3+, напротив, увеличилось до 10 % (квадрат В2).
Понимание механизма блокирования АС экспрессии молекул HLADR на АГ-презентирующих клетках, при отсутствии этого эффекта в отношении HLADR на эффекторных лимфоцитах, возможно, лишь допустив предположение о том, что эта молекула имеет различную структурную конформацию на А-моно-нуклеарах и на активных Т-лимфоцитах. Тем самым, при беременности появляются антитела только против HLADR В-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов.
Рисунок 2
Смешанная культура лимфоцитов супругов, где женщина не имела в анамнезе репродуктивных потерь, и настоящая беременность протекала без патологии а - СКЛ с добавлением ЭТС; б - СКЛ с добавлением АС
а
Мі Н*
1 '
■ : і
1 ■ я _ лі ■_ ТЧ . !№С; —г І і .
ІП
Работа выполнена по гранту Фонда поддержки медико-биотехнолгических исследований.
■ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ В ДИАГНОСТИКЕ ИММУННЫХ ПРИЧИН РЕПРОДУКТИВНЫХ ПОТЕРЬ___________
В то же время, эти антитела не блокируют HLADR (нет сайтов связывания) активных Т-лимфоцитов. Биологический смысл конформационного различия молекул HLADR на А-клетках и на эффекторных лимфоцитах, а также избирательного синтеза антител к этим АГ, заключается в снижении презентиру-ющей функции моноцитов, макрофагов и В-лимфо-цитов аллогенных АГ зародыша, при одновременном сохранении и незначительной активации эффектор-ных Т-лимфоцитов, обеспечивающих эффективную иммунную защиту и трофику оплодотворенного яйца. Данный феномен наблюдался у 80 % женщин с физиологической беременностью.
На последующих рисунках показаны феномены женской АС на СКЛ, которые достоверно чаще встречались в группе семей с репродуктивными потерями. На рисунке 3 показана СКЛ семейной пары с иди-опатическими репродуктивными потерями. Как видно из рисунка, процент А-мононуклеаров с поверхностным HLADR (квадраты В1 на 3а и на 3б) не снижался при добавлении АС в СКЛ, а, напротив, незначительно увеличивался (3,6 % в СКЛ с ЭТС и 4,1 % в СКЛ с АС). Процент эффекторных лимфоцитов CD3+, HLADR+ был сопоставим в культурах с ЭТС и АС (3,6 % против 3,5 %, соответственно). В этом случае флуоресцентная цитометрия показала отсутствие блокирования молекул HLADR на АГ-презентирующих клетках, что, по видимому, стало причиной отторжения полуаллогенного зародыша. Отсутствие эффекта блокирования HLADR на А-к-летках (напротив, незначительная стимуляция экспрессии HLADR на них) наблюдалось у 50 % женщин с невынашиванием беременности.
Следующий вариант репродуктивной иммунопатологии показан на рисунке 4. Как видно из рисунка, у семейной пары с репродуктивными потерями
наблюдался как выше описанный дефект блокирования HLADR на CD3-отрицательных мононуклеарах (квадрат В1 на 4а и на 4б), так и дополнительная АС-активация экспрессии HLADR на Т-эффектор-ных лимфоцитах (квадрат В2 на 5а — 12,5 %, а В2 на 5б — 18,3 %). Анализ других иммунологических показателей в данной семейной паре выявил присутствие у женщины антител к фосфолипидам в повышенной концентрации (28 МЕ/мл), а также повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов и соотношения клеток с фенотипом CD3+CD4+ к CD3+CD8+ (иммунорегуляторный индекс = 2,3 у.е. при норме 1,5-2,0 у.е.). Тем самым, в данном случае репродуктивные потери были обусловлены не только нарушением сдерживания презентации аллогенных АГ зародыша материнскому иммунному микроокружению, но и прямой иммунной атакой активными Т-лимфоцитами на АГ полуаллогенного зародыша. Эту форму невынашивания беременности можно определить как иммуноагрессивную, проявляющуюся не только отменной толерантностью к аллогенным АГ зародыша, но аутоиммунной и иммунокомплексной патологиями.
Эффект стимуляции Т-лимфоцитов (повышение экспрессии HLADR на CD3+ лимфоцитах) наблюдался у 30 % женщин с предположительно иммунными формами невынашиванием беременности.
Репродуктивные потери достоверно чаще, чем при физиологической беременности, сопровождаются теми или иными иммунными отклонениями. Одной из форм иммунопатологий, сопровождающих репродуктивные потери, может быть дефект выработки материнским иммунным микроокружением гуморальных иммунных супрессорных факторов, предположительно антител к антигенным детерминантам HLADR, которые ограничивают иммунную экспансию против ал-
Рисунок 3
Смешанная культура лимфоцитов супругов, где женщина имела в анамнезе более двух идиопатических репродуктивных потерь а - СКЛ с добавлением ЭТС; б - СКЛ с добавлением АС
Г
Г
Ї
і
.■4;..
- ■
Ш-Тпг
ш
Рисунок 4
Смешанная культура лимфоцитов супругов, где женщина имела в анамнезе более двух репродуктивных потерь и у нее обнаруживались иммунные антитела к фосфолипидам а - СКЛ с добавлением ЭТС; б - СКЛ с добавлением АС
логенных АГ оплодотворенного яйца. Наиболее часто встречаемый вариант из этой формы был связан с отсутствием блокирования экспрессии HLADR на АГ-презентирующих клетках (50 %). При втором варианте потери плода напрямую связаны с иммунным отторжением, так как не только не снижается презентация аллогенных АГ материнскому иммунному микроокружению, но и стимулируются эффекторные Т-лимфоциты. Стимуляция экспрессии HLADR на Т-лимфоцитах может быть определена антителами, направленными к мембранному участку HLADR молекулы. Частота этого варианта репродуктивных потерь может достигать 30 % из всех иммунных форм привычного невынашивания беременности.
Тем самым, появление у женщины антител к HLADR не всегда является прогностически благоприятным фактором. Предположительно, только антитела, блокирующие АГ-распознающий участок молекулы HLADR на АГ-презентирующих клетках (моноциты, макрофаги, В-лимфоциты), способствуют вынашиванию беременности. Выявление этих факторов (пред-
положительно антител) возможно с помощью проточной иммунофлуоресцентной цитометрии.
ВЫВОДЫ:
1. Исследование экспрессии HLADR на лимфоцитах в СКЛ супругов с помощью проточной цитометрии позволяет выявлять иммунные нарушения, приводящие к репродуктивным потерям.
2. Оценка эффекта женской аутосыворотки на ал-логенное иммунное распознавание в СКЛ супругов с помощью проточной цитометрии позволяет выявлять дефицит супрессорного потенциала как причину репродуктивных потерь.
3. Исследования блокирующего эффекта женской аутосыворотки на СКЛ супругов с помощью проточной цитометрии дает возможность разграничивать иммунные формы репродуктивных потерь на вариант с отсутствием факторов, блокирующих HLADR на А-клетках, и на вариант с активацией экспрессии HLADR на эффекторных Т-лимфоцитах.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Сидельников, В.М. Невынашивание беременности: Руководство для практикующих врачей /Сидельников, В.М. - М.: Мед. информ. агенство, 2010. - 536 с.
2. Симонова, Т.В. Врожденные пороки развития в Кемеровской области (по итогам социально-гигиенического мониторинга): информационно-аналитический обзор /Т.В. Симонова, Л.А. Глебова - Кемерово, 2010. - 14 с.
3. Говалло, В.И. Иммунология репродукции /В.И. Говалло. - М.: Медицина, 1987. - 304 с.
4. Сотникова, Н.Ю. Иммунные аспекты беременности /Н.Ю. Сотникова //Russian journal of immunology. - 2005. - V. 9(2). - С. 15-16.
5. Иммунологическая загадка беременности /под ред. Н.Ю. Сотниковой. - Иваново: Изд-во МИК, 2005. - 276 с.
6. Фрейдлин, И.С. Особенности иммунной системы организма женщины в период беременности, иммунологические взаимоотношения в системе мать-плод /И.С. Фрейндлин //Rus. J. of Immun. - 2005. - V. 9(2). - С. 9-11.
7. Галактионов, В.Г. Иммунология /В.Г. Галактионов. - М.: Академия, 2004. - 523 с.
8. Самбург, М.Б. Способ оценки взаимодействия лимфоцитов in vitro, основанный на определении их розеткообразующей способности /М.Б. Самбург //Иммунология. - 1991. - № 2. - С. 30-32.
9. Лакин, Г.Ф. Биометрия /Г.Ф. Лакин. - М.: Медицина, 1990. - 354 с.
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ В ДИАГНОСТИКЕ ИММУННЫХ ПРИЧИН РЕПРОДУКТИВНЫХ ПОТЕРЬ
REFERENCES:
1. Sidelnikov V.M. Miscarriage: Rukovodstvo dlya praktikuyuschih vrachey. M.: Meditsinskoe informatsionnoe agenstvo, 2010; 536 (In Russian).
2. Simonova T.V., Glebova L.A. Congenital malformations in the Kemerovo region (based on the environment and health monitoring): infor-matsionno-analiticheskiy obzor. Kemerovo, 2010; 14 (In Russian).
3. Govallo V.I. Immunology of reproduction. M.: Meditsina, 1987; 304 (In Russian).
4. Sotnikova N.Yu. Immune aspects of pregnancy. Rus. J. of Immun. 2005; 9(2): 15-16 (In Russian).
5. Immunological mystery of pregnancy /pod red. N.Yu. Sotnikovoy. Ivanovo: Izdatelstvo MIK, 2005; 276 (In Russian).
6. Freydlin I.S. Features of the immune system of the body of women during pregnancy, immunological relationship in the mother-fetus. Rus. J. of Immun. 2005; 9(2): 9-11 (In Russian).
7. Galaktionov V.G. Immunology. M.: Akademiya, 2004; 523 (In Russian).
9. Lakin G.F. Biometrics. M.: Meditsina, 1990; 354 (In Russian).
8. Camburg M.B. A method for measuring the interaction of lymphocytes in vitro, based on the determination of their ability to rosette. Immu-nologiya. 1991; 2: 30-32 (In Russian).
