Применение низких температур для создания ксеногенных сосудистых скаффолдов Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

і

МЕТОДИ

УДК: 57.085.23:615.361.018.5.013.8

ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР ДЛЯ СОЗДАНИЯ КСЕНОГЕННЫХ СОСУДИСТЫХ СКАФФОЛДОВ

Д. В. Бызов1 Институт проблем криобиологии и криомедицины

О. П. Сынчикова1 НАН Украины, Харьков

И. П. Михайлова1

C. М. Дергун2 2Харьковский национальный технический институт «НТУ ХПИ»

Б. П. Сандомирский1

Е-mail: [email protected]

В работе изучено влияние низких температур на артерии свиньи при создании бесклеточных ксеногенных сосудистых скаффолдов. В группе замороженных-оттаявших артерий (n = 15) наблюдали частичную децеллю-ларизацию эндотелия, изменение структуры соединительнотканных волокон при сохранении прочностных свойств сосудов.

Ключевые слова: сосудистые протезы, скаффолды, биоинженерия, децеллюларизация.

Единственным радикальным методом лечения окклюзионных и травматических поражений магистральных сосудов, включая ишемическую болезнь сердца, является оперативный — замена участка поврежденной артерии с целью реваскуляризации зоны ишемии. Существует также серьезная проблема, связанная с обеспечением сосудистого доступа для проведения гемодиализа у больных с почечной недостаточностью, стандартом которого считается наложение периферического артериовенозного шунта с использованием сосудистых протезов. В связи с этим возрастает необходимость в сосудистых трансплантатах, поскольку количество случаев сердечно-сосудистых заболеваний постоянно увеличивается, а возраст больных неуклонно снижается [1].

На сегодняшний день в сосудистой хирургии применяются следующие виды трансплантатов: аутогенные (v.saphena magna,

a.thoracica interna, a.radialis); синтетические протезы (PTFE, еPTFE в различных модификациях), алло- и ксеногенные сосудистые графты [2, 3]. Однако наиболее перспективными, лишенными недостатков биологических и синтетических трансплантатов, являются биоинженерные сосудистые протезы [4]. Они представляют собой двух-или трехслойные тканево-клеточные струк-

туры, выращиваемые в особых условиях in vitro на основе сосудистого каркаса (скаф-фолда), выполняющего опорную функцию для наслаиваемых клеточных структур. На первом этапе на скаффолд наслаивают гладкомышечные клетки стенки артерий, затем — эндотелиальные клетки реципиента.

Идеальный скаффолд должен обладать такими свойствами [5]:

1) био-, гемосовместимость; 2) нетоксич-ность; 3) функциональность; 4) прочность; 5) проявление адекватных упругоэластических свойств; 6) способность к адгезии и росту наслаиваемых клеток.

Естественные бесклеточные ксеногенные биологические ткани в значительной степени превосходят синтетические материалы в качестве каркасов сосудистых протезов мелкого диаметра, проявляя лучшие адгезивные свойства при последующей эндоте-лизации, способствуют росту эндотелия и, в зависимости от метода обработки, могут обладать механическими свойствами, подобными нативным сосудам [6]. Отсутствие синтетического материала способствует форм и -рованию устойчивой, долгосрочной структуры биоинженерного сосуда и обеспечивает полноценную интеграцию трансплантата в организм реципиента [7]. Бесклеточный ксе-нокаркас постепенно преобразовывается,

замещаясь аутогенным внеклеточным матриксом, формируемым собственными клетками реципиента [8].

Цель данного исследования — изучение влияния низких температур на морфологическую структуру и биомеханические свойства артериальных сосудов свиньи при создании бесклеточных ксеногенных сосудистых скаффолдов.

Материалы и методы

Общие сонные и внутригрудные артерии были взяты от половозрелых свиней с соблюдением правил биоэтики. В стерильных условиях выполняли препарирование сосудов: удаляли соединительную ткань и излишек адвентициальной оболочки.

Для исследования 14 сонных и 16 внут-ригрудных артерий разделили на две группы: 1-я — группа контроля (нативные артерии — 7 a. carotis com., 8 a. thoracica int.), n = 15; 2-я группа — 7 сонных и 8 внутри-грудных артерий, подвергающихся воздействию низких температур, n = 15.

Сосуды 2-й группы погружали в жидкий азот (-196 С), изучение проводили после их полного оттаивания на водяной бане (+37 C).

Оценку морфологической структуры сосудов выполняли с помощью оптической микроскопии (х200) при импрегнации серебром межклеточных границ эндотелия, окраске гематоксилин-эозином и пикрофук-сином по Ван-Гизону.

Биомеханические свойства оценивали, определяя механическую прочность при продольном растяжении с помощью деформирующего устройства FP 100/1 (VEB TIW Rauenstein) и измеряя давление на разрыв на установке, состоящей из ресивера с электронным датчиком давления (Freescale Semicondacter MPX-5700DP).

Результаты и обсуждение

Поскольку эндотелиальные клетки являются «первым эшелоном», который реагирует на изменения среды, использовали серебрение клеточных границ для оценки степени их повреждения (рис. 1, 2).

Характерными свойствами эндотелия в норме являются непрерывность выстилки и полиморфизм клеток. После погружения в жидкий азот отмечали обширные деэндо-телизированные поля, чередующиеся с участками сохранившейся эндотелиальной выстилки , а также единичные группы эндотелиоцитов.

1

Рис. 1. Эндотелий нативного сосуда (импрегнация межклеточных границ серебром):

1 — непрерывность выстилки и полиморфизм клеток.

Подобную структуру имели все изучаемые образцы (п = 15)

Рис. 2. Артерия после охлаждения до —196 °С (импрегнация межклеточных границ серебром):

1 — деэндотелизированные поля;

2 — сохраненный эндотелий;

3 — отдельные группы эндотелиоцитов.

Подобные изменения выявлены во всех образцах (п = 15)

При окраске гематоксилин-эозином замороженных сосудов обнаруживали множественные участки десквамации эндотелия (рис. 3, 4).

В средней оболочке артерий образовались продольные дефекты в виде микроразрывов и расслоения стромы, что, очевидно, связано с механическими напряжениями, которые претерпевает стенка сосуда после воздействия. Наружная эластическая мембрана сохраняла свою целостность.

Возможности окраски по Ван-Гизону позволили оценить состояние коллагеновых, мышечных и эластических волокон стенки артерий (рис. 5, 6).

Отмечалось изменение структурной ориентации волокон. Каждое из коллагеновых волокон нативной артерии демонстрировало выраженную извитость, в то время как в ох-

Рис. 3. Нативный сосуд (окраска гематоксилин-эозином ):

1 — эндотелиальная выстилка;

2 — коллагеновые и мышечные волокна.

Подобную структуру имели все изучаемые образцы (п = 15)

Рис. 4. Артерия после охлаждения до —196 °С (окраска гематоксилин-эозином):

1 — участки десквамированного эндотелия;

2 — средняя оболочка сосуда (определяются дефекты в виде микротрещин и микроразрывов).

Подобные изменения, разной степени выраженности, выявлены во всех изучаемых образцах (п = 15)

лажденных до -196 С сосудах извитость снижена, волокна уплотнены и утолщены. Продольная ориентация и структурная целостность коллагеновых и эластиновых волокон сохранялись.

Биомеханические свойства сосудов обеих групп представлены в виде диаграмм. Испытание на разрыв выявило тенденцию к увеличению прочностных свойств заморожен-ных-оттаянных сосудов по сравнению с контролем (рис. 7).

Наблюдали также достоверное увеличение (в 1,5 раза) механической прочности замороженных сосудов в экспериментах на растяжение (рис. 8).

Рис. 5. Нативный сосуд (окраска по Ван-Гизону):

1 — эндотелий;

2 — коллагеновые и эластиновые волокна.

Подобную структуру имели все изучаемые образцы (п = 15)

. 6. Артерия после охлаждения до ■

(окраска по Ван-Гизону):

1 — десквамированный эндотелий;

2 — утолщенные и уплотненные соединительнотканные волокна.

Такие изменения наблюдали во всех изучаемых образцах (п = 15)

Таким образом, замораживание-оттаивание свиных артерий мелкого диаметра (< 6 мм) приводило к их начальной девитализации: во всех изучаемых образцах (n = 15) образовывались обширные деэндотелизированные поля и участки десквамированного эндотелия, чередующиеся с отдельными группами сохранившихся эндотелиоцитов. Отмечалось сохранение структурной целостности эластической мембраны стенки сосуда. Охлаждение сосудов до -196 °С во всех случаях обусловливало изменение структурной ориентации соединительнотканных волокон, что проявлялось в снижении степени

Î

2

0,3 0,275 0,25 £ ix:v!3 "■ 0,2 = 0,175

M ■

- 0,15

- 0,125

0,1

0,075

0,05

0,025

Burst test, MPa Щ — Нативные артерии (1-я группа)

Щ — Артериии после замораживания до -196 °С (2-я группа)

Рис. 7. Диаграмма сравнения влияния приложенного давления на разрыв сосудов (Burst test) для артерий нативных и после замораживания, MPa (n = 15)

Strength-test N Щ — Нативные артерии (1-я группа)

Щ — Артерии после замораживания до -196 °С (2-я группа)

Рис. 8. Диаграмма сравнения результатов испытаний зависимости разрыва сосудов от силы растяжения (Strength-test N),

(n = 15), p < 0,05 для артерий нативных и после замораживания

извитости, их уплотнении и утолщении при сохранении продольной ориентации и структурной целостности. Учитывая сохранение биомеханических свойств группы за-мороженных-оттаянных артерий (п = 15), охлаждение кровеносных сосудов до -196 С

может явиться одним из этапов создания бесклеточных сосудистых скаффолдов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бокерия Л. А., Ступаков И. Н., Самородская И. В. и др. Мнение врачей первичного звена в оценке потребности пациентов в хирургических методах лечения ишемической болезни сердца // Кардиол. серд.-сосуд. хир. — 2008. — № 1. — С. 10-15.

2. Kannan R. Y., Salacinski H. J., Butler P. E. et al. Current status of prosthetic bypass grafts: A review // J.Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. — 2005. — V. 74. — P. 570-581.

3. Rashid S. T., Salacinski H. J., Fuller B. J. et al. Engineering of bypass conduits to improve patency // Cell Prolif. — 2004. — V. 37. — P. 351-366.

4. Григорян А. С. Испытания новых тканеинженерных кровеносных сосудов в экспериментальных моделях // Клет. трансплан-тол. ткан. инженер. — 2006. — № 3(5). — С. 23-24.

5. Elazer R.Edelman. Vascular tissue engineering: designer arteries // Circul. Res. — 1999. — V. 85. — P. 1115-1117.

6. Prachi Dixit, Diane Hern-Anderson, John Ranieri et al. Vascular graft endothelializa-tion: Comparative analysis of canine and human endothelial cell migration on natural biomaterials // J. Biomed. Mater. Res. Part

A. — 2001. — V. 56, Is. 4. — P. 545 — 555.

7. Omke E. Teebken, Axel Haverich. Tissue Engineering of Small Diameter Vascular Grafts // Eur. Jour. Vasc. Endovasc. Surg. — 2002. -V. 23, Is. 6. — P. 475-485.

8. Lee R. T., Berditchevski F., Cheng G. C., Hemler M. E. Integrinmediated collagen matrix reorganization by cultured human vascular smooth muscle cells // Circ. Res. — 1995. — V. 76. — P. 209-214.

ЗАСТОСУВАННЯ НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР ДЛЯ СТВОРЕННЯ КСЕНОГЕННИХ СУДИННИХ СКАФОЛДІВ

Д. В. Бизов1

0. П. Синчикова1

1. П. Михайлова1

C. М. Дергун2

Б. П. Сандомирський1

1 Інститут проблем кріобіології

і кріомедицини НАН України, Харків 2 Харківський національний технічний інститут «НТУ ХПІ»

E-mail: [email protected]

У роботі вивчено вплив низьких температур на артерії свині під час створення безклітинних ксеногенних скафолдів судин. У групі заморо-жених-відтанутих артерій (n= 15) спостерігали часткову децелюляризацію ендотелію, зміну структури сполучнотканинних волокон при збереженні властивостей міцності судин.

Ключові слова: судинні протези, скафолди, біоінженерія, децелюляризація.

USE OF LOW TEMPERATURES FOR CREATION OF VASCULAR SCAFFOLDS

D. V. Byzov1

0. P. Synchikova1

1. P. Mikhaylova1

S. M. Dergun2

B. P. Sandomirskiy1

1 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv

2 National Technical University «Kharkiv Polytechnical Institute «NTU KhPI»

E-mail: [email protected]

We investigated the effect of low temperatures on pig’s arterial vessels at creation of acel-lular xenogeneic vascular scaffolds. It was observed partial decellularization of endothelium layer, structure changing of connective tissue's fibers and preservation of mechanical properties of vessels in a group of frozen-thawed arteries.

Key words: vascular grafts, scaffolds, bioengineering, decellularization.