CC BY
45
СЛУЧАИ ИЗ ПРАКТИКИ
© БАТОРОЕВ Ю.К. — 2009
ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕЙ ЦНС: РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36 ПЕРВИЧНЫХ И МЕТАСТАТИЧЕСКИХ ОПУХОЛЕЙ
Ю.К. Батороев
(Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра онкологии, зав. — д.м.н., проф. В.В. Дворниченко)
Резюме. На примере анализа результатов исследования 36 случаев первичных и метастатических опухолей ЦНС показана принципиальная возможность иммунофенотипирования в цитологических мазках для дифференциальной диагностики, определения гистогенеза опухолей ЦНС, оценки их гормонорецепторного статуса и пролиферативной активности. Показана принципиальная возможность оценки результатов иммунофенотипирования для всех вышеуказанных целей на цитологических мазках. Главным преимуществом являются короткие сроки ответа и простота выполнения процедуры. Все результаты были оценены в сравнении с иммуногистохимическим исследованием на парафиновых срезах.
Ключевые слова: иммуноцитохимия, цитологическая диагностика, опухоли ЦНС.
USE OF MONOCLONAL ANTIBODIES IN CYTOLOGIC DIAGNOSIS OF CNS TUMORS:
RESULTS OF THE INVESTIGATIONS 36 PRIMARY AND METASTATIC BRAIN TUMORS
ТК. Batoroev
(Irkutsk State Institute for Medical Advanced Studies)
Summary. On example of the analysis of study results 36 cases of primary and metastatic CNS tumors is shown principle possibility of immunodiagnosis in cytological smears for differential diagnostics, determine of histogenesis tumors CNS, estimations their hormone status and proliferative activities. It is shown principle possibility of the estimation result of immunodiagnosis on cytological smears. The main advantage are short periods of the response and simplicity of the performing the procedure. All results were evaluated in comparison with immunohistochemistry study on paraffin cuts.
Key words: cytology diagnostics, immunocytochemistry, CNS tumors.
Иммунофенотипирование (ИФТ) в современной онкоморфологии имеет чрезвычайно важное значение. Рационально используя методы и алгоритм иммунофе-нотипирования, в морфологических препаратах возможно определение гистогенеза опухолей ЦНС, проведение дифференциальной диагностики, оценки их гормонорецепторного статуса и пролиферативной активности. В большинстве морфологических лабораторий такие исследования проводятся на гистологических препаратах из срезов парафиновых блоков или замороженных кусочков тканей. Однако для парафиновой заливки требуется несколько дней, кроме того, предварительная фиксация препаратов формалином изменяет структуру белка, что требует перед исследованием восстанавливать антигенные детерминанты по специальному протоколу [2]. Исследование замороженных срезов для опухолей ЦНС вообще затруднено и далеко не всегда позволяет оценить гистовариант опухоли перед ИФТ.
Цели и задачи: Используя мазки-отпечатки из био-птатов, полученных во время стереотаксической биопсии или из фрагментов удаленных во время плановых операций опухолей ЦНС, мы попытались определить возможности ИФТ на цитологических мазках. Известно, что воспроизводимость методики в цитологических мазках ограничена по времени из-за контакта материала с атмосферным кислородом [2]. В парафиновых же блоках нет контакта тканей с кислородом, поэтому срезы, полученные из архивного материала даже после долгих лет хранения позволяют проводить полноценное ретроспективное изучение белкового состава [1]. Опубликованы лишь только единичные работы по применению моноклональных антител для диагностики опухолей ЦНС. Так, в конце 1980-х годов две группы японских авторов [3,5] опубликовали результаты применения на цитологических препаратах опухолей мозга антител к глиальному фибриллярному кислому белку, а известный нейропатогистолог ^ N из Гонконга в 1988 году показал определённые возможности иммуноци-
тохимической диагностики опухолей мозга [8]. Только одна работа посвящена изучению маркеров пролиферативной активности опухолей мозга на цитологических мазках [6]. Мы ставили задачу проведения в ряде случаев дифференциального диагноза, выявления прогесте-роновых и эстрогеновых рецепторов в клетках менин-гиом различной степени злокачественности, а также определения пролиферативной активности в клетках различных опухолей. Кроме того, мы хронометрировали скорость окраски от момента получения материала, а также попытались определить продолжительность сохранности мазков-отпечатков (в днях) при различных условиях и пригодности их для иммунофенотипиро-вания. Результаты окраски на цитологических мазках сравнивали с результатами окраски гистологических срезов с парафиновых блоков этих опухолей.
Материалы и методы
Иммуноморфологическому исследованию было подвергнуто 18 астроглиальных опухолей, 12 менингиом (девять типических, две атипических и одна анапласти-ческая), 6 метастазов в головной мозг из легких (п=2), молочной железы (п=1), толстой кишки (п=2) и почек (п=1). Использовались мазки-отпечатки полученные из биопсийного и операционного материала, нанесенные на адгезивные стекла (DAKO), обработанные силаном. Исследования выполнялись в 1-й, 7-й, 14-й день. Мазки не фиксировали, высушивали на воздухе и исследовали. Чтобы убедиться в наличии клеток опухоли, один мазок-отпечаток окрашивался обзорными красителями (азур-эозином или гематоксилин-эозином). Мазки хранили при комнатной температуре. Предназначенные для хранения мазки заворачивали в фольгу и хранили в холодильнике.
Для выявления иммунного окрашивания использовался стандартный пероксидазно-антипероксидазный метод. Приводим последовательность выполнения лабораторного этапа иммуноцитохимического исследования:
Таблица 1
Степень выраженности экспрессии прогестероновых рецепторов в ядрах клеток менингиом различной степени злокачественности в цитологических мазках и гистологических препаратах
Типическая менингиома (n=9) Атипическая менингиома (n=2) Анапластическая Менингиома (n=1)
Цитологич. мазки Гистологич. срезы Цитологич. мазки Гистологич. срезы Цитологич. мазки Гистологич. срезы
1-й день Выраженная экспрессия (4) Выраженная экспрессия (3, 4) Слабо выраженная экспрессия (1) Слабо выраженная экспрессия (1) Отсутствует (0) Отсутствует (0)
l-й день Выраженная экспрессия (3) Слабо выраженная экспрессия (1) Отсутствует (0)
14-й день Отсутствует (0) Отсутствует (0) Отсутствует (0)
1. Споласкивание в растворе фосфатного буфера (pH - 7,2)
2. Инкубация в 3% растворе перекиси водорода в течение 5 минут — блокирование активности эндогенной пероксидазы.
3. Споласкивание в растворе фосфатного буфера.
4. Устранение фонового окрашивания — нанесение раствора блокирующих антител на 20 минут.
5. Нанесение антител в рабочем разведении (см. таблицу), инкубация во влажной камере в течение часа при комнатной температуре.
6. Промывание в трех сменах фосфатного буфера.
7. Нанесение вторых (связывающих антител), инкубация во влажной камере 45 — 60 минут.
8. Промывание в трех сменах фосфатного буфера.
9. Нанесение пероксидазно-антипероксидазного (ПАП) комплекса, инкубация во влажной камере 30 минут.
10. Промывание в трех сменах фосфатного буфера.
11. Окрашивание в растворе 3,3 — диаминобензиди-на тетрахлорида (ДАБ) в течение 10 минут.
12. Промывание окрашенных мазков в дистиллированной воде и споласкивание в растворе фосфатного буфера.
13. Дегидратация (по 2 смены 96% спирта, абсолютного спирта и ксилола), докраска ядер в течение 1 минуты в гемалауне Майера, заключение в бальзам. Проводился негативный и позитивный контроль. В качестве позитивного контроля использовались стандартные наборы микропрепаратов, поставляемые фирмой — изготовителем.
Проведено изучение гормонорецепторного статуса менингиом (рецепторов к эстрогену и прогестерону), пролиферативной активности с применением антител к белку Ki-67 (клон MIB-1), экспрессии глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) и протеина S-100, цитокератина, эпителиального мембранного антигена (ЕМА), виментина, CD-45, СD-99, хромогранину, согласно рекомендациям W.W. Vick и соавт. [9].
Оценка степени экспрессии рецепторов половых гормонов проводилась по шкале, предложенной D. Hsu [4]: гормонорецепторный статус оценивался как нулевой при отсутствии окрашенных ядер (0% положительно окрашенных ядер), как 1 при окраске одного процента ядер опухолевых клеток или менее (< 1%), как 2 при окраске от 1 до 9%, как 3 при окраске от 10 до 49%, как 4 при окраске > 50%.
Для оценки пролиферативной активности в цитологических мазках подсчитывалось количество окрашенных ядер на 500 клеток, с последующим вычислением индекса пролиферации (ИП) в процентах, а в гистологических срезах подсчитывалось количество окрашенных ядер опухолевых клеток в 10 случайно выбранных полях зрения большого увеличения (ПЗБУ), при окуляре х10, объективе х40. Площадь поля зрения при этом составляла 0,16 ц2. ИП также определялся в процентах.
Результаты и обсуждение
При окраске мазков менингиом различной степени злокачественности экспрессии эстрогеновых рецепторов (ЭР) не обнаружено вообще, выраженная экспрессия прогестро-новых рецепторов (ПР) найдена в клетках типических менингиом (п=9) в 1-й и 7-й день хранения; слабо выраженная экспрессия в клетках атипических менингиом (п=2) и отсутствовала в клетках анапластической менингиомы (п=1). Оценка экспрессии прогестероновых рецепторов приведена в таблице 1.
При оценке пролиферативной активности в цитологических мазках отмечалось (табл. 2), что окраска ядер на седьмой день становилась менее интенсивной, но хорошо различимой. При окраске на 14-й день ядра практически не визуализировались. Взаимосвязь результатов цитологической и гистологической оценки пролиферативной активности оценен с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Обнаружена линейная зависимость — 0,67±1,62^Х, где Х — результат цитологического исследования (г=0,98±0,001, р=0,007). Полученные результаты позволяют предполагать, что и в цитологических мазках возможно стандартизация оценки пролиферативной активности.
Окраска препаратов с целью дифференциальной диагностики показала, что во всех астроглиальных опухолях, независимо от гистотипа и степени злокачественности имеет место позитивное окрашивание при обработке мазков антителами к ГФКБ и одновременно фокальной позитивной окраске к виментину и протеину 8-100.
Окраску на коллаген IV типа оценить было крайне сложно из-за неравномерного распределения его во внеклеточном пространстве по препарату. Алгоритм дифференциальной диагностики первичных опухолей ЦНС между собой включал использование ГФКБ, хро-могранина, протеина 8-100, синаптофизина и нейрофи-ламентов.
Выявлена одновременная выраженная диффузная экспрессия ЕМА и протеина 8-100 в 6 типических ме-нингиомах, слабая фокальная экспрессия этих же антигенов в одной атипической и отсутствие в анапластиче-ской. Особые сложности вызывала дифференциальная диагностика анапластических вариантов астроцитом и менингиом, на что указывает 8. КоЬа^'зЫ с соавторами [7]. Единственным надёжным дифференциальнодиагностическим признаком оказалась экспрессия в ГФКБ в астроцитомах.
Для целей дифференциальной диагностики первичных и метастатических опухолей ЦНС в панель антител включались маркеры эпителиальной и мезенхимальной дифференцировки (цитокератины, антиген эпителиальных мембран, виментин, коллаген IV типа), а также общий лейкоцитарный антиген CD-45. Так, для отли-
Таблица 2
Оценка пролиферативной активности проводилась с применением антител к белку Ю-67 (клон М1В-1)
Типическая менингиома (n=9) Атипическая менингиома (n=2) Анапластическая Менингиома (n=1)
Цитологич. Гистологич. Цитологич. Гистологич. Цитологич. Гистологич.
мазки срезы мазки срезы мазки срезы
3,4% 3,9% 6,5% 5,2% 12,3% 11,6%
r = 0,98, р = 0,001
чия метастазов колоректального рака от изоморфноклеточного варианта глиобластомы (голые ядра клеток этих опухолей в мазках имеют чрезвычайное сходство), достаточно было применение антител к ГФКБ и цитокератинам. Для верификации метастаза эпидермо-идного рака (из легкого) применялись цитокератины, для мелкоклеточного рака легкого — цитокератины в сочетании с хромогранином и синаптофизином. С целью исключения первичной лимфомы мозга использовались антитела к общему лейкоцитарному антигену. Диагностировать метастазы рака молочной железы помогло выявление рецепторов стероидных гормонов, экспрессия которых выявлялась как в клетках метастатических опухолей, так и в клетках первичного очага. Клетки метастаза карциномы почки экспрессировали как цитокератины, так и виментин, что характерно для почечноклеточного рака.
Анализ интенсивности окраски для целей дифференциальной диагностики с антителами к ГФКБ, вимен-тину, цитокератинам, ЕМА, CD-45, хромогранину, ней-рофиламентам, ПР, показал, что интенсивность окраски в 1-й и 7-й день была практически одинаковой, а на 14-й день окрашивание мазков, хранившихся при комнатной температуре было заметно слабее. Мазки, которые хранились в холодильнике и были завернутыми в фольгу показывали однотипную интенсивность.
Обсуждение. Проведенное исследование показывает, что метод иммуноцитохимического исследования позволяет проводить дифференциальную диагностику в случаях неясного гистогенеза первичной опухоли ЦНС и выявлять первичный или метастатический характер опухоли. Хорошо выявляются белки расположенные в ядре, цитоплазме и клеточной мембране. Оценку наличия коллагена в мазках из-за случайного его расположения между клетками оценивать крайне сложно, т.к. он относится к белкам внеклеточного матрикса и его
практически невозможно отличать от фонового окрашивания.
Окраска ядер при выявлении белков пролиферативной активности в цитологических мазках хорошо определяется и предложенный метод подсчета окрашенных ядер на 500 клеток сопоставим с гистологическим и позволяет адекватно оценить пролиферативную активность. Время окраски по стандартной процедуре иммунофенотипирования на цитологических мазках составляет 2-3 часа.
К преимуществам можно отнести:
1. Возможность получения ответа в кратчайшие сроки — при необходимости уже через 2-3 часа после взятия материала при биопсии или операции возможно не только сделать выводы о наличии опухоли, но и дать полноценное морфологическое заключение о её гистотипе и гистогенезе, основанное на иммунодиагностике, что максимально приближает ответ к точности гистологического диагноза.
2. Более простая по сравнению с иммуногистохими-ческими методиками процедура окраски, где не требуется демаскировка образца из-за отсутствия фиксация материала, что исключает артефакты, связанные с ней (изменение третичной структуры белка)
К недостаткам относят:
1. Более короткие сроки сохранности цитологических мазков из-за повреждающего действия атмосферного кислорода — оптимальные сроки использования мазка, хранящегося при комнатной температуре составляют 7-10 дней.
2. Невозможность оценки экспрессии белков внеклеточного матрикса на цитологических мазках.
Рекомендации: С целью удлинения сроков сохранности мазков для иммуноцитохимического исследования, их рекомендуется хранить в холодильнике завёрнутыми в фольгу, желательно, в морозильной камере.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аничков Н.М., Зиновьев А.С. Морфологические маркёры в диагностике опухолей. — Новосибирск: Издательство Новосибирского университета, 1993. — 130 с.
2. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногисто-химической диагностике опухолей человека. — Казань: Титул, 2004. — 451 с.
3. Chen Y, Zhang Y.X. Use of monoclonal antibodies to glial fibrillary acidic protein in cytologic diagnosis of brain tumors // Cytology. — 1989. — Vol. 33. — P.922-928.
4. Hsu D.W., Efird J.T., Hedley-Whyte E.T. Progesterone and estrogen receptors in meningiomas: prognostic considerations // J Neurosurg. — 1997. — Vol. 86. — № 1. — P.113-20.
5. Iwa N., Yutani C., Ishibashi-Ueda H., Katayama Y. Immunocytochemical demonstration of glial fibrillary acidic
protein in imprint smears of human brain tumors // Diagn Cytopathol. — 1988/ — Vol.4. — № 1. — P.74-77.
6. Girino M., Riccardi A., Danova M., Gaetani P., Butti G., Giordano M., Cuomo A. Immunocytochemical evaluation of proliferative activity in human brain tumours // Anal Cell Pathol. — 1990 — Vol.2. — P. 269-275.
7. Kobayashi S., Haba R., Hirakawa E. Cytology and immunohistochemistry of anaplastic meningiomas in squash preparations // Acta cytol. — 1993. — Vol. 39. — №1. — P.118-124.
8. Ng HK, and Lo ST: Immunocytochemical diagnosis of central nervous system tumours on smear preparations // Eur Neurol/ — 1988. — Vol. 28. — P.142-145.
9. Vick WW, Wikstrand C.J., Bullard D.E. The use a panel of monoclonal antibodies in the evalution of cytology specimens from central nervous system // Acta cytol. — 1987. — Vol. 31. — P. 815-824.
Адрес для переписки: 664079, Иркутск, м/р Юбилейный, 100, ИГИУВ, кафедра онкологии
© ШАЛАШОВ С.В., КУЛИКОВ Л.К., БУСЛАЕВ О.А, СМИРНОВ А.А., ЕГОРОВ И.А., ГОРБУНОВ И.А. — 2009
СПОСОБ ПАХОВОЙ ГЕРНИОПЛАСТИКИ ИЗ МИНИДОСТУПА
С.В. Шалашов2, Л.К. Куликов1, О.А. Буслаев2, А.А. Смирнов1, И.А. Егоров2, И.А. Горбунов2 ('Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах; 2Дорожная клиническая больница на ст. Иркутск-пассажирский ОАО «РЖД», гл. врач — к.м.н. Е.А. Семенищева)
Резюме. Предложен метод паховой герниопластики «без натяжения» из минидоступа длиной 2-3 см в проекции наружного пахового кольца. Существенным отличием от операции I.L. Lichtenstein является характер фиксации сетчатого протеза в тканях. При этом для его подшивания не используют глубокие структуры пахового канала. Поэтому операция возможна из минидоступа. В работе подробно изложена техника герниопластики. При этом не требуется специальных инструментов. По предложенной методике выполнено 23 герниопластики.
Ключевые слова: паховая грыжа, герниопластика, способ, минидоступ.
