CC BY
38
УДК 616 - 053.2 - 07 : 577.21] 001.895 О.И. Морозова1, Н.В. Морозова2, О.В. Островская1, В.К. Козлов1
ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ ПРИ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ У ДЕТЕЙ
Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства1, 680022, ул. Воронежская, 49, кор. 1, e-mail: iomid@yandex.ru; Дальневосточный государственный медицинский университет2, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел.: 8-(4212)-32-63-93, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru, г. Хабаровск
Болезни органов дыхания занимают первое место в структуре общей заболеваемости у детей и подростков и не имеют тенденции к снижению. В последние годы отмечается рост хронической и рецидивирующей патологии органов дыхания [6]. В сложившейся ситуации весьма актуально совершенствование методов этиологической верификации бронхолегочных заболеваний, уточнение доли генетических аномалий в структуре хронической и рецидивирующей бронхолегочной патологии у детей. В этой связи важным и своевременным является внедрение молекулярно-генетических подходов в медицинскую диагностическую практику [7]. Молекулярно-генетические методы обладают рядом преимуществ — это быстрота выполнения, непревзойденная чувствительность и высокая специфичность. С помощью этих методов определяется ДНК возбудителей ряда болезней человека, диагностика которых была ранее затруднительна [1,3].
Молекулярно-генетические методы открывают перспективы для совершенствования диагностики ряда наследственных заболеваний человека, что способствует улучшению оказания качества медицинской помощи семьям с наследственной патологией [2, 5].
Цель работы состояла в оценке эффективности применения молекулярно-генетического метода диагностики для выявления хламидий и микоплазм при бронхолегоч-ных заболеваниях и детекции генетических маркеров при легочных формах муковисцидоза у детей.
Материалы и методы
Обследовано 847 детей в возрасте от 2 до 14 лет с бронхолегочной патологией, в том числе: 491 детей — с
пневмонией, 128 детей — с рецидивирующим бронхитом, 97 — с бронхиальной астмой, 131 — с врожденными пороками легких, а также 21 ребенок в возрасте от 1,5 до 12 мес. с внебольничной пневмонией. В мазках из ротоглотки, мокроте, бронхоальвеолярных лаважах выявляли ДНК Mycoplasma pneumoniae (M.pneumoniae), Chlamydophila pneumoniae (Chl.pneumoniae), Chlamydia trachomatis (Chl.trachomatis) (тест-системы «GenePac», ООО «ИзоГен» и НПФ «Литех», г. Москва). Проведено сравнительное исследование мазков из ротоглотки 55 детей с различными бронхолегочными заболеваниями и 94 здоровых детей на наличие ДНК Streptococcus pneumoniae (Str.pneumoniae), Haemophilus influenzae (H.influenzae), Moraxella catarrhalis (M.catarrhalis), Streptococcus agalactiae (Str.agalactiae).
У 32 детей с рецидивирующей бронхолегочной патологией и у 14 здоровых детей проведена генодиагностика муковисцидоза с изучением 9 мажорных мутаций (Phe508Del, Gly542Ter, Gly551Asp, Trp1282Ter, Asn1303Lys, 394de1TT, Arg334Trp, 3821de1T, 2143de1T) в генетрансмембранном регуляторном белке муковисци-доза (тест-системы НПФ «Литех», г. Москва) с использованием форменных элементов крови, с визуализацией методом электрофореза в 3,0% агарозном геле.
Результаты и обсуждение
Для проведения своевременной этиологической верификации и адекватной терапии пневмоний у детей, особенно при вспышках заболевания, актуальным является экспресс-диагностика пневмотропных возбудителей. Для оценки диагностического значения метода ПЦР в этиологической верификации бронхолегочных заболеваний про-
ведено изучение частоты детекции пневмотропной флоры в ротоглотке здоровых детей. В результате проведенного исследования выявлена высокая обсемененность детей Str.pneumoniae, H.influenzae, средняя — M.catarrhalis и низкая — M.pneumoniae, Str.agalactiae. Chl.pneumoniae в ротоглотке здоровых детей не обнаружена (табл. 1).
При обследовании ротоглотки детей с воспалительными бронхолегочными заболеваниями выявлено возрастание M.pneumoniae в 13 раз по сравнению с группой здоровых детей, Chl.pneumoniae — не определена. Достоверных различий в детекции H.influenzae, M.catarrhalis и S.agalactiae в сравнении с группой здоровых детей обнаружено не было. Str.pneumoniae при бронхолегочных заболеваниях находили реже, чем у здоровых, поскольку дети поступали в стационар на фоне амбулаторного антибактериального лечения (табл. 2).
Сопоставление результатов обследования ротоглотки здоровых детей и детей с бронхолегочной патологией показывает, что частота выявления таких инфекционных агентов, как Str.pneumoniae, H.influenzae и M.catarrhalis, методом ПЦР не имеет различий в исследуемых группах, поэтому малоинформативно и диагностического значения не имеет. Необходимо проведение ПЦР в режиме Real-time с определением болезнетворного титра выявленных патогенов.
Детекция M.pneumoniae и Chl.pneumoniae в ротоглотке здоровых детей и детей с воспалительными бронхо-легочными заболеваниями показала, что Chl.pneumoniae выявляется крайне редко и только у заболевших детей, a M.pneumoniae выявляется чаще, чем у здоровых. Сравнительный клинико-лабораторный анализ, проведенный ранее, установил диагностическую эффективность при-
Таблица 1
Распространенность пневмотропной флоры у здоровых детей в зависимости от возраста с использованием метода ПНР
Показатель Возрастная группа Всего (n=94)
2-3 г. (n=12) 4-5 лет (n=42) 6-7 лет (n=19) 7-11 лет (n=21)
Str.pneumoniae - абс. 12 39 19 17 87
- %±m 100,0 ±25,0 92,8 ±4,0 100,0 ±17,4 80,9 ±8,6 92,6 ±2,7
H.influenzae - абс. 10 28 17 11 66
- %±m 83,31 ±10,8 66,6 ±7,3 89,5 ±7,0 52,4 ±10,9 70,2 ±4,7
Chl.pneumoniae - абс. 0 0 0 0 0
- %±m 0 ±25,0 0 ±8,7 0 ±17,4 0 ±16,0 0 ±4,1
M.pneumoniae - абс. 2 0 0 0 2
- %±m 16,6 ±10,7 0 ±8,7 0 ±17,4 0 ±16,0 2,1 ±1,5
M.catarrhalis - абс. 7 16 10 3 36
- %±m 58,3 ±14,2 38,1 ±7,5 52,6 ±11,5 14,3 ±7,6 38,3 ±5,0
Str.agalactiae - абс. 0 3 0 0 3
- % 0 ±25,0 7,1 ±4,0 0 ±17,4 0 ±16,0 3,2 ±1,8
Резюме
С использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) обследовано 847 детей с бронхолегочными заболеваниями и 94 здоровых ребенка. В результате проведенного исследования обнаружено, что доля Chlamydophila pneumoniae в развитии заболеваний составляет не более 3,0%. Mycoplasma pneumoniae наиболее часто определяется при пневмониях у детей (до 17,2%), при вспышке респираторного микоплазмоза этот показатель может возрастать в 3 раза. При бронхиальной астме инфицирован-ность зева Mycoplasmatis pneumoniae составляет 9,3%. При рецидивирующих бронхитах, пороках и дисплазиях брон-холегочной системы Mycoplasma pneumoniae выявляется редко. Обнаружена высокая частота (до 28,1%) мажорных мутаций в гене муковисцидоза у детей с рецидивирующей бронхолегочной патологией.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, брон-холегочные заболевания, дети, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumoniae, муковис-цидоз.
O.I Morozova, N.V. Morozova, O.V. Ostrovskaja, V.K. Kozlov
APPLICATION OF MOLECULAR-GENETIC METHOD OF DIAGNOSTICS IN BRONCHOPULMONARY DISEASES IN CHILDREN
Khabarovsk subsidiary of state organization
Far-eastern research center of respiratory pathology and physiology of Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences - Mother and child care institute;
Far Eastern State Medical University, Khabarovsk
Summary
Using the method of polymerase chain reaction (PCR) 847 children with bronchopulmonary diseases and 94 healthy children are examined. The examination of children with various bronchopulmonary pathology by PCR revealed, that Chla-mydophila pneumoniae in development of diseases makes up no more than 3,0%. Mycoplasma pneumoniae has the greatest significance has in pneumonias in children (up to 17,2%), at outbreak of respiratory mycoplasmosis, this parameter can grow in 3 times. In bronchial asthma prevalence of DNA My-coplasma pneumoniae makes up 9,3%. In recurrent bronchitis, defects and anomalies of bronchopulmonary systems, Myco-plasma pneumoniae comes to light rather seldom. As a result of carried out research high frequency (up to 28,1%) major mutations in a gene mucoviscidosis in children with recurrent bronchopulmonary pathology is revealed.
Key words: polymerase chain reaction, bronchopulmonary diseases, children, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumoniae, mucoviscidosis.
менения метода ПЦР в отношении M.pneumoniae в этиологии бронхолегочных заболеваний у детей [4]. Таким образом, выявленные факты свидетельствуют о возможности использования метода ПЦР с целью верификации этиологии заболевания в отношении атипичных пневмот-ропных возбудителей, таких как хламидии и респиратор-
Таблица 2
Таблица 4
Распространенность различных микроорганизмов в ротоглотке у детей с бронхолегочными заболеваниями по данным ПЦР (%±m)
Выявление ДНК M.pneumoniae у детей с бронхолегочными заболеваниями методом ПЦР
Возбудитель Бронхолегочные заболевания* (n=55) Здоровые дети (n=94) Р1 и Р2
S.pneumoniae 76,4±5,7 92,6±2,7 <0,05
H.influenzae 61,8±6,6 70,2±4,7 <0,05
M.catarrhalis 38,2±6,6 38,3±5,0 >0,05
M.pneumoniae 27,3±6,0 2,1±1,5 <0,001
S.agalactiae 3,6±2,5 3,2±1,8 >0,05
Chl. pneumoniae 3,3±0,4 0±4,1 >0,05
Примечание. * — дети с различными бронхолегочными заболеваниями (бронхиальная астма, рецидивирующий бронхит, острая пневмония, бронхолегочная дисплазия).
Таблица 3
Детекция ДНК Chl.pneumoniae у детей с бронхолегочными заболеваниями методом ПЦР
Заболевание Мазок из ротоглотки Мокрота Бронхоаль-веолярные лаважи Всего
Пневмония внебольничная: - абс./n 2/23 8/241 1/46 11/310
- %±m 8,7±6,0 3,3±1,2 2,2±2,1 3,6±1,0
Бронхиальная астма, обострение: - абс./n 1 /12 0/31 0/11 1/54
- %±m 8,3±8,3 0±11,4 0±28,6 1,9±1,8
Рецидивирующий бронхит: - абс./n 0/29 2/22 1/39 3/90
- %±m 0±12,5 9,1±6,3 2,6±2,5 3,3±1,9
ВПР и тканевые дисплазии бронхоле-гочной системы: - абс./n 0/19 1/15 3/97 4/131
- %±m 0±18,2 6,7±6,7 3,09±1,8 3,1±1,5
Здоровые дети: - абс./n 0/94 ни ни 0/94
- %±m 0±4,1 0±4,1
Примечание. Ни - не исследовали.
ные микоплазмы, с учетом клинических особенностей заболевания.
В дальнейшем изучена частота выявления Chl. pneumoniae, Chl.trachomatis и M.pneumoniae при различных бронхолегочных заболеваниях у детей методом ПЦР.
При изучении мазков из ротоглотки, мокроты и ла-важей у детей с различными бронхолегочными заболеваниями ДНК Chl.pneumoniae обнаруживали редко, в 1,9-3,6% случаев, без достоверной разницы в исследуемых нозологических группах и с группой контроля. У здоровых детей в зеве ДНК Chl.pneumoniae не выявлена (табл. 3).
При исследовании мокроты 21 ребенка с заболеваниями нижнего отдела дыхательного тракта в возрасте от 1,5 до 12 мес. ДНК Chl.trachomatis обнаружена в 85,7%. Дети с пневмонией составили 68,5% случаев, с бронхитами — 31,5%. При анализе антенатального анамнеза указания на урогенитальный хламидиоз были только у
Заболевание Мазок из ротоглотки Мокрота Бронхо-альвеолярные лаважи Всего Группа
Пневмония внебольничная - вне вспышки: - абс./n 4/34 48/239 3/47 55/320 1
- %±m 11,8±5,5 20,1±2,6 6,4±3,6 17,2±2,1*
- во время вспышки: - абс./n 84/160 3/11 ни 87/171
- %±m 52,5±4,0 27,3±14,1 50,9±3,8
Бронхиальная астма, обострение: - абс./n 2/27 4/59 3/11 9/97 2
- %±m 7,4±5,0 6,8±3,3 27,3±14,1 9,3±2,9**
Рецидивирующий бронхит: - абс./n 3/47 0/22 2/41 5/110 3
- %±m 6,4±3,6 0±16,0 4,9±3,4 4,6±2,0
ВПР и тканевые дисплазии бронхолегоч-ной системы: - абс./n 1 /19 0/14 4/98 5/131 4
- %±m 5,3±5,3 0±23,5 4,1±2,0 3,8±1,7
Здоровые дети: - абс./n 2/94 ни ни 2/94 5
- %±m 2,1±1,5 2,1±1,5
Примечания. * -— р<0,05 между
— р<0,05 между 1 и 2, 2 и 4, 5 группами; ни —
1 и 3, 1 и 4, 1 и 5 группами; - не исследовали.
Частота и спектр мажорных мутаций в гене муковицидоза у детей с хронической и рецидивирующей бронхолегочной патологией (%)
23,0% матерей. При изучении клинических особенностей пневмоний хламидийной этиологии в сравнении с типичными пневмониями установлено, что хламидий-ная пневмония имеет более легкое течение с нормальной или субфебрильной температурой, минимальными симптомами интоксикации, удовлетворительным или средней тяжести общим состоянием ребенка. Для этих детей было характерно диспноэ. Изменения в гемограмме носили неспецифический характер. По данным В.К. Таточенко (2005), Chl.trachomatis является возбудите -
лем пневмоний у детей в возрасте 1-3 мес., заражение происходит анте- или интранатально и часто протекает бессимптомно. Результаты наших исследований демонстрируют высокую информативность метода ПЦР при исследовании мокроты у детей первого года жизни в отношении CЫ.trachomatis.
По результатам изучения частоты детекции М.рпеитошае при бронхолегочных заболеваниях у детей методом ПЦР установлено, что наиболее часто патоген определяется при пневмониях — 17,2% (р<0,05), при вспышке респираторного микоплазмоза этот показатель возрастает до 50,9% случаев (табл. 4).
При бронхиальной астме частота выявления ДНК М.рпеитошае при изучении всех исследованных образцов составила 9,3%, что в 2,5-4,4 раза чаще, чем при пороках развития бронхолегочной системы и у здоровых детей (р<0,05), и в 1,8-5,5 раза реже, чем при острых пневмониях (р<0,05). М.рпеитошае при рецидивирующих бронхитах (4,6%), пороках легких (3,8%) у здоровых детей (2,1%) выявляется редко.
В результате проведенного генетического исследования 32 детей у 9 (28,1%) выявлено носительство од-нонуклеотидных замен в гене муковисцидоза, у 5 детей — сочетание 2 различных мутаций (рисунок). Наиболее часто определяли полиморфизм Тгр1282Тег (7 случаев из 9), хотя, по данным В.И. Иванова и соавт. (2006), наиболее часто обнаруживается мутация Phe508Del. При обследовании 14 детей группы контроля мутаций в гене муковисцидоза не обнаружено.
Диагноз муковисцидоза с использованием молеку-лярно-генетического метода установлен 3 детям: у двоих, с учетом клинической симптоматики, предположена компаунд-мутация (две разные мутации, расположенные в разных хромосомах, в итоге синтезируется дефектный белок), и мутация в гомозиготном состоянии обнаружена у 1 ребенка в возрасте 1,5 мес. с обструктивным бронхитом.
Таким образом, проведенное молекулярно-генетичес-кое исследование подчеркивает значимость использования этого метода в дальнейших работах по выяснению этиологии заболевания.
Выводы
1. Проведенное исследование с использованием метода ПЦР показало, что при пневмониях, бронхиальной астме, пороках развития легких у детей СЫ.рпеитошае
обнаруживается редко. Более чем в 80,0% случаев при пневмониях у детей первого года жизни выявляется Chl. trachomatis. M.pneumonia наиболее часто определяется у детей дошкольного и школьного возраста при острых пневмониях (в 17,2-50,9%).
2. Среди детей с бронхолегочной патологией выявлена высокая частота носительства мажорных мутаций в гене муковисцидоза (до 28,1%), обнаружена наиболее часто встречающаяся мутация — Тгр1282Тег.
Литература
1. Гучев И.А. Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae как возбудители внебольничной пневмонии у взрослых // Medlinks.ru. - с.32-38. - Февраль. 2005 г. - Режим доступа: http://www.medlinks.ru/article. php?sid=:14225 (дата обращения 04.03.2007).
2. Иванов В.И. Генетика: учеб. для вузов. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 638 с.
3. Кухтинова Н.В., Кротов С.А., Кротова В.А. Рецидивирующие и хронические формы хламидофилеза у детей.
- М., 2004. - 84 с.
4. Морозова О.И., Островская О.В., Козлов В.К. Клинические и лабораторно-рентгенологические особенности микоплазменных пневмоний у детей в Хабаровском крае // Дальнев. мед. журнал. - 2007. - №1. - С. 29-32.
5. Руководство по применению «SNP-экспресс». - М: НПФ «Литех», 2008. - 32 с.
6. Таточенко В.К. Проект клинических рекомендаций «Пневмония у детей» [под ред. А. А. Баранова]. - М.: Гэо-тар-Медиа, 2005. - 23 с.
7. Talkinyton D.F., Thacker W., Keller D.W. et.al. Diagnosis of M.pneumoniae infection in autopsy and open-lung biopsy tissues by Nested PCR // J. Clin.Microbiol. -1992. - Vol. 36. - P. 1151-1153.
Координаты для связи с авторами: Морозова Ольга Игоревна — врач-вирусолог клиники НИИ охраны материнства и детства, тел: 8-(4212)-98-05-91, e-mail: iomid@ yandex.ru; Морозова Нина Викторовна — канд. мед. наук, доцент кафедры детских болезней ДВГМУ, тел.: 8-(4212)-98-05-91, e-mail: iomid@yandex.ru; Островская Ольга Васильевна — канд. мед. наук, науч. сотрудник НИИ охраны материнства и детства СО РАМН, тел.: 8-(4212)-98-05-91, e-mail: iomid@yandex.ru; Козлов Владимир Кириллович
— доктор мед. наук, профессор, засл. деятель науки, членкор. РАМН, директор НИИ охраны материнства и детства, тел: 8-(4212)-98-03-35, e-mail: iomid@yandex.ru.
□□□
