CC BY
101
В.Н. Ильина, А.И. Субботовская, л.Г. Князькова, В.С. Козырева, т.С. Скачкова*, о.Ю. Шипулина*, д.С. Сергеевичев, А.П. Субботовский
Применение молекулярно-биологических методов исследования для диагностики инфекции области хирургического вмешательства, вызванной бактериями рода Staphylococcus
ФГБУ «ННИИПК
им. акад. Е.Н. Мешалкина»
Минздравсоцразвития
России, 630055,
Новосибирск,
ул. Речкуновская, 15,
cpsc@nricp.ru
* ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотреб-надзора, 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3 а
УДК 616-002-078:616.12-089-06 ВАК 14.01.20
Поступила в редакцию 7 сентября 2011 г.
© В.Н. Ильина,
А.И. Субботовская,
Л.Г. Князькова, В.С. Козырева,
Т.С. Скачкова, О.Ю. Шипулина,
Д.С. Сергеевичев,
А.П. Субботовский, 2011
В настоящее время наряду с традиционными микробиологическими и иммунологическими методами лабораторной диагностики инфекционных заболеваний используются методы, основанные на молекулярно-биологических технологиях. Они позволяют проводить прямое изучение этиологии и антибиотикорезистентности возбудителя без его предварительного культивирования. В работе представлены сравнительные данные, полученные в ходе ПЦР-анализа и микробиологического исследования инфекций области хирургического вмешательства (ИОХВ), вызванные стафилококками. Целью данной работы явилось изучение возможности использования ПЦР для прямой диагностики инфекций области хирургического вмешательства (ИОХВ) стафилококковой этиологии. В ходе проведенной работы получена высокая чувствительность (98,6%) и специфичность (95,8%) ПЦР-анализа. Показано, что ПЦР-анализ значительно ускоряет получение результатов, по сравнению с традиционным микробиологическим исследованием в случае возникновения ИОХВ, вызванной MR стафилококками. Ключевые слова: стафилококки; полимеразная цепная реакция; резистентность к метициллину; инфекции области хирургического вмешательства.
По данным Национальной системы наблюдения за нозокомиальными инфекциями (National Nosocomial Infections Surveillance, NNIS), инфекции области хирургического вмешательства (ИОХВ) являются второй-третьей по частоте нозокомиальной инфекцией, в зависимости от профиля стационара. Согласно результатам проспективного мультицентрового исследования, частота ИОХВ после проведения кардио-хирургических операций составляет 3,0% (38 гнойных осложнений на 1 268 операций). Однако, по данным отдельных авторов, инфекции области операции у кардиохирур-гических больных регистрируются в 10,4% случаев. Наиболее часто ИОХВ возникают после операции коронарного шунтирования, реже после операций по поводу ВПС и ППС. По данным многочисленных исследований, преобладающими возбудителями ИОХВ в кардиохирургии являются бактерии рода Staphylococcus, которые выделяются в 70-80% случаев [8, 10, 12-14, 17]. По результатам Национальной системы наблюдения за нозокомиальными инфекциями (NNIS) частота выделения S. aureus и коагулазоне-гативных стафилококков (CoNS) при ИОХВ
после кардиохирургических вмешательств составляет 32,5 и 21,9% соответственно.
Современные методы молекулярной диагностики (ПЦР) позволяют проведение прямого ПЦР-анализа этиологии и анти-биотикорезистентности возбудителя без предварительного культивирования последнего. Основным преимуществом ПЦР-анализа является высокая производительность и скорость получения результатов по сравнению с культуральными методами [3, 6, 7]. Нами проведено исследование по обнаружению ДНК S. aureus и участка геномного материала, несущего ген mecA в клинических образцах. Целью данного исследования стало изучение возможности использования ПЦР-анализа для прямого установления инфекции области хирургического вмешательства, вызванной бактериями рода Staphylococcus, и выявления резистентности к метициллину, обусловленной геном mec A.
материал и методы
Всего изучено 143 образца, доставленных в микробиологическую лабораторию
за период с февраля по июнь 2011 года. Забор материала производился сухим стерильным ватным тампоном с учетом клинической целесообразности в области стернотомной раны. В анализ были включены все поступившие для микробиологического исследования клинические образцы. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяли для исследования как исходного образца, так и чистой культуры выделенных стафилококков. Для ПЦР-анализа тампон с образцом или чистой культурой погружался в 0,5 мл транспортной среды «ТСМ» (ИнтерЛабСервис, Россия). Выделение ДНК осуществляли набором реагентов «Рибо-Преп» (ИнтерЛабСервис, Россия) согласно прилагаемой инструкции. Постановку реакции амплификации осуществляли с использованием коммерческой тест-системы «Амп-лиСенс MRSA-скрин-титр-FL» (ИнтерЛабСервис, Россия) на флюоресцентном детектирующем термоциклере CFX96 (Bio-Rad, США) в режиме реального времени.
Посев материала производили общепринятыми в микробиологической практике методами. Идентификацию проводили на анализаторах ATB-expression (bioMerieux, Франция) и Phoenix (Becton Dickinson, США). Для определения чувствительности использовали чистые культуры выделенных возбудителей. Метициллинорезистентность исследовали с помощью дисков, пропитанных оксациллином и цефокситином (Bio-Rad, США) на агаре Мюллер-Хинтон (bioMerieux, Франция) в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам США (CLSI, 2004) и Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2 1890-04. 2004) и на анализаторе ATB-expression (bioMerieux, Франция) и Phoenix (Becton Dickinson, США). Сравнение результатов микробиологического исследования и ПЦР-ана-лиза проводили после окончательного результата посева.
Сравнительный анализ чувствительности и специфичности ПЦР-анализа по сравнению с классическими бактериологическими методами осуществляли с использованием программного обеспечения Ridom EpiCompare (Германия).
результаты
Из 143 исследованных образцов в 87 (60,8%) пробах получен рост бактерий рода Staphylococcus. При этом в 72 (50,3%) случаях стафилококки были идентифицированы как S. epidermidis, в 8 (5,6%) - S. aureus, в 5 (3,5%) - S. saprophytics и по 1 (0,7%) S. sciuri и S. haemolyticus. В 37 (27,6%) рост отсутствовал и в 17 (11,7%) выявлен рост бактерий, не относящихся к роду стафилококков (рис. 1 ).
Фенотипически метициллинорезистентность выявлена у 69 штаммов стафилококков, что составило 48,2% от числа изученных клинических образцов. Устойчивость к метициллину выявлена в 1,4% (2 штамма) у S. aureus и в 46,8% у CoNS (67 штаммов) (табл. 1 ).
Метициллинорезистентные коагулазонегатив-ные стафилококки были представлены следующими видами: S. epidermidis (42,6%), S. saprophyticus (2,8%), S. sciuri (0,7%) и S. haemolyticus (0,7%).
Все чистые штаммы MRS тестировались на наличие гена mec A методом ПЦР-анализа, во всех случаях был выявлен участок гена mec A. В ходе ПЦР-анализа ДНК S. aureus обнаружена в 8 (5,6%), ген mec A S. aureus в 2 и ген mec A CoNS - 73 клинических образцах (табл. 2).
При сравнении результатов ПЦР-анализа и данных микробиологического исследования получены следующие результаты: в 6 пробах, в которых обнаружены только ДНК S. aureus, получен рост MSSA, в 2 пробах, в
Таблица 1
Результаты микробиологического исследования клинического материала (П = 143)
Результаты исследования Кол-во образцов, абс
Получен рост Рост отсутствовал % роста
S.aureus 8 135 5,6
MRSA 2 141 1,4
MR CoNS 67 76 46,8
Таблица 2
Результаты исследования клинического материала молеку-лярно-биологическим методом (п = 143)
Результаты исследования Кол-во образцов, абс
Обнаружен Не обнаружен % обнаружения
ДНК S.aureus 8 135 5,6
Ген mec A S.aureus 2 141 1,4
Ген mec A CoNS 73 70 51,0
Патология кровообращения и кардиохирургия 4. 2011
47
Таблица 3
Сравнение результатов исследования клинического материала молекулярно-биологи-ческим и микробиологическим методами (П = 143)
Общее кол-во образцов n (абс.)
Данные ПЦР-анализа, n (абс.)
ДНК.....
S. aureus
Ген
mec A
Данные микробиологического исследования, n (абс.)
MR MS CoNS CoNS
MSSA MRSA
Не стафилококки
Нет роста n (абс.)
8 8 2 6 2 - - - -
73 - 73 - - 66 - 3 3
62 - - - - 1 12 13 37
которых выделены ДНК S. aureus и ген mecA, рост MRSA (табл. 3). В 73 образцах, в которых обнаружены только ДНК участка несущего ген mec A: в 66 - получен рост метициллинорезистентных коагулазонегативных стафилококков (MR CoNS), в 3 - рост бактерий, не относящихся к роду Staphylococcus, и в 3 - рост отсутствовал.
Из 62 клинических образцов, в которых ДНК S. aureus и ген mecA не обнаружены, в 12 получен рост мети-циллиночувствительных коагулазонегативных стафилококков (MS CoNS), в 1 - рост метициллинорезистент-ного S. epidermidis, в 13 - рост бактерий, не относящихся к роду Staphylococcus, и в 37 - рост отсутствовал.
Таким образом, совпадение результатов ПЦР-анализа и микробиологического исследования составило 100% при обнаружении в клинических образцах ДНК S. aureus и гена mecA. В то время как при обнаружении только гена mec A совпадение отмечено в 95,5% случаев.
В целом, при сравнении результатов ПЦР-ана-лиза и результатов, полученных в ходе микробиологического исследования, совпадение наблюдалось в 137 (95,8%) случаях. При этом чувствительность ПЦР-анализа составила 98,6% и специфичность - 95,8%. Конкордантность теста 0,958.
обсуждение
Современные методы ПЦР позволяют выявить в клиническом материале как конкретного возбудителя, так и его генетически обусловленную антибиотикорезистен-тность. Иными словами, ПЦР дает ответ «узкой направленности», в то время как культуральные методы позволяют выявить рост различных видов микроорганизмов и определение чувствительности одновременно к препаратам, относящимся к разным группам. При этом время проведения ПЦР-анализа составляет 3-4 ч, а микробиологическое исследование в среднем длится от 3 до 5 дней.
К основным возбудителям инфекций, возникших после проведения кардиохирургических операций по данным [15] относятся коагулазонегативные стафилококки (CoNS) и S. aureus, частота которых составляет 36/91 (39,6%) и 15/91 (16,5%) соответственно. CoNS были выделены в 42-64% случаев при исследовании поверхнос-
тных и глубоких инфекций в области стернотомной раны [16]. Наиболее тяжел ым осложнен ием после ка р-диохирургических вмешательств является медиасти-нит. Большинство послеоперационных медиастинитов в кардиохирургии вызывается Staphylococcus aureus, на долю которых приходится не менее 50% случаев этого осложнения. Коагулазонегативные стафилококки чаще выделяются при нестабильности грудины [7, 9, 11].
Терапия ИОХВ включает хирургическое дренирование и использование антибиотиков и антисептиков. К основным антибиотикам, используемым для терапии стафилококковых инфекций, относятся бета-лактамы (прежде всего оксациллин, цефазолин и амоксициллин/клавула-нат), гликопептиды (ванкомицин) и оксазолидиноны (лине-золид) [7]. Ключевым моментом в выборе антибиотика служит выявление MRS. Резистентность стафилококков к метициллину может быть обусловлена тремя механизмами: продукцией дополнительного пенициллинсвязы-вающего белка (ПСБ) - ПСБ-2а, кодируемого геном mec А; инактивацией вследствие гиперпродукции бета-лакта-маз; модификацией нормальных ПСБ. При этом клиническое значение имеет mec А-обусловленная резистентность. Это связано с тем, что при инфекциях, вызванных штаммами стафилококков с mec A, терапия бета-лактам-ными антибиотиками неэффективна. Препаратом выбора при инфекциях, вызванных MRS штаммами, является ванкомицин [1, 5-7]. Таким образом, обнаружение mec А-обус-ловленной резистентности к метициллину необходимо для решения вопроса при выборе средства лечения. По результатам исследований отдельных авторов, выделение метициллинорезистентного Staphylococcus aureus при развитии послеоперационного медиастенита является фактором риска неблагоприятного исхода [1, 6, 7, 12].
Таким образом, при развитии ИОХВ предположительно стафилококковой этиологии с клинической точки зрения необходимо получить ответ о виде стафилококка (S. aureus или CoNS) и о наличии у выделенных стафилококков гена mec A.
Используемый нами набор реагентов позволяет выявить наличие ДНК золотистого стафилококка и участка геномного материала, несущего ген mecA, как у S. aureus, так и у коагулазонегативных стафилококков. При использовании набора в нашем исследовании регистрирова-
лось совпадение результатов ПЦР-анализа и результатов микробиологического исследования в 95,8% случаев. В случае выделения MRSA и MSSA совпадение отмечено в 100%. Чувствительность ПЦР-анализа составила 98,6%, специфичность - 95,8%. Конкордантность - 0,958.
Результат ПЦР-анализа был получен через 3 ч от момента поступления клинического образца в ПЦР лабораторию. На практике окончательный результат ПЦР-анализа обычно получают к концу рабочего дня, в связи с чем в клиническое отделение, направившее образец, результат поступит на следующий день, что позволит сравнить его с результатами посева и принять решение о соответствующей антимикробной терапии менее чем через сутки от момента доставки клинического образца в лабораторию.
При отсутствии ДНК S. aureus и участка, несущего ген mecA, возможными возбудителями могут быть как мети-циллиночувствительные CoNS, так и бактерии, не относящихся к роду Staphylococcus. Выделение возбудителя по-прежнему считается «золотым» стандартом диагностики инфекционных заболеваний, в связи с чем данные ПЦР-анализа следует сопоставлять c результатами, полученными в ходе микробиологического исследования.
ПЦР-анализ клинического образца, полученного у пациентов с инфекцией в области хирургической раны после кардиохирургического вмешательства, значительно ускоряет результат исследования (в сравнении с микробиологическим) в случае инфекции, обусловленной как MRSA, так и MR CoNS. ПЦР-исследование может быть использовано для контроля эффективности проводимой антимикробной терапии ИОХВ с ранее установленной MRSA и MR CoNS этиологией. Чувствительность ПЦР-анализа составила 98,6%, специфичность - 95,8%.
список литературы
1. Дехнич А.В. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 1999. Т. 1. №1. С. 89-91.
2. Зузова А.П., Белькова Ю.А. // Фарматека 2007. Т. 139. № 4. С. 67-74.
3. Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2000. Т. 2. № 3. С. 96-106.
4. Манграм А.Дж., Хоран Т.С., Пирсон М.Л. и др. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2003. Т. 5. № 1. C. 74-101.
5. Никулин А.А., Дехнич А.В. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2010. Т. 12. № 1. С. 4-22.
6. Сидоренко С. В., Шляпников С. А. // Успехи биологической химии. 2004. Т. 44. С. 263-306.
7. Шляпников С.А., Сидоренко С.В. // Инфекции в хирургии. 2010. Т. 8. № 3. C. 40-46.
8. Dodds A., Carroll D., Engemann J. et al. // Clin. Infect. Dis. 2004. V. 38. P. 1555-1560.
9. Eguia J., Chambers H. // Semin Respir. Crit. Care Med. 2003. V. 24. № 1. P. 37-34.
10. Gardlund B., Bitkover C., Vaage J. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2002. V. 21. № 5. P. 825-830.
11. Lin C., Hsu R., Chang S. // Clin. Infect. Dis. 2003. V. 37. P. 679-684.
12. Ridderstolpe L., Gill H., Granfeldt H. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2001. V. 20. № 6. P. 1168-1175.
13. Tegnell A., Aren C., Ohman L. // Ann. Thorac. Surg. 2000. V. 69. P. 1104-1109.
14. Upton A., Roberts S.A., Milsom P., Morris AJ. // J. Surg. 2005. V. 75. P. 198-203.
Ильина Вера Николаевна - кандидат медицинских наук, врач бактериологической лаборатории ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Субботовская Анна Игоревна - младший научный сотрудник группы клинической иммунологии лаборатории клинико-биохимических исследований ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Князькова Любовь Георгиевна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинико-биохимических исследований ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Козырева Виктория Сергеевна - врач клинической лабораторной диагностики лаборатории клинической иммунологии отделения лабораторной диагностики ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Скачкова Татьяна Сергеевна - младший научный сотрудник отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва).
Шипулина Ольга Юрьевна - руководитель лаборатории молекулярных методов отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва).
Сергеевичев Давид Сергеевич - кандидат биологических наук, и.о. заведующего лабораторией экспериментальной хирургии и морфологии ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск)
Субботовский Антон Павлович - стажер-исследователь лаборатории анестезиологии и реаниматологии ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
