CC BY
42
ПРИМЕНЕНИЕ МОДУЛЯ ЮНГА ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДЕФОРМАЦИИ РИЗОБАКТЕРИЙ
Артамонова Марина Николаевна
ассистент кафедры общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии Ульяновского государственного университета, РФ, г. Ульяновск
E-mail: artamonovamn2013@yandex. ru Пчелинцева Екатерина Сергеевна канд. физ.-мат.наук, начальник лаборатории зондовой и электронной микроскопии Научно-исследовательского технологического инстититута Ульяновского государственного университета, РФ, г. Ульяновск
E-mail: nanolabniti@gmail. com Костишко Борис Борисович мл. науч. сотр. лаборатории зондовой и электронной микроскопии Научно-исследовательского технологического инстититута Ульяновского государственного университета, РФ, г. Ульяновск
E-mail: nanolabniti@gmail. com Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна д-р мед. наук, профессор кафедры общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии Ульяновского государственного университета, РФ, г. Ульяновск
E-mail: kfarm@ulsu.ru
APPLICATION OF YOUNG S MODULUS FOR THE DEFORMATION CHARACTERISTICS OF RHIZOBACTERIA
Artamonova Marina Nikolaevna
assistant of Department of General and Clinical Pharmacology with the course of Microbiology of Ulyanovsk State University, Russia Ulyanovsk
Pchelintseva Yekaterina Sergeevna candidate of science, Head of Laboratory scanning probe and electron microscopy of Research Technology institute of Ulyanovsk State University, Russia Ulyanovsk
Kostishko Boris Borisovich junior research fellow of Laboratory scanning probe and electron microscopy of Research Technology institute of Ulyanovsk State University, Russia Ulyanovsk
Potaturkina- Nesterova Natalia Iosifovna doctor of Medicine, professor of Department of General and Clinical Pharmacology with the course of Microbiology of Ulyanovsk State University, Russia Ulyanovsk
АННОТАЦИЯ
Целью работы явилось изучение упруго-механических свойств мембраны ризобактерий методом атомно-силовой спектроскопии в режиме силовой спектроскопии. В ходе исследования было установлено, что модуль упругости бактериальных клеток изменяется в зависимости от режима культивирования. Модуль Юнга изменялся обратно пропорционально относительно температуры.
Показатели модуля Юнга ризобактерий 1 группы (культивируемых при +50С) составил 3,6±0,1 Мпа, 2 группы (00С) — 5,1±0,7 Мпа, 3 группы (-50С) — 6,0±1,1 Мпа. При снижении температуры культивирования происходило уменьшение размеров бактериальных клеток. Установлено, что сила адгезии также зависит от температурного фактора и достоверно увеличивалась при снижении температуры.
ABSTRACT
The purpose of the research was studying the elastic and mechanical properties of the rhizobacteria membrane with atomic force spectroscopy in mode force spectroscopy. It has been found that the elastic modulus of the bacterial cells dependend on temperature. Young's modulus was inversely proportional to temperature. Е^ elastic modulus of rhizobacteria in group №1 ( cultured at 500 C) was 3,6 ± 0,1 MPa, in group № 2 (0 0C ) — 5,1 ± 0,7 MPa, in group №3 (-50 0C ) — 6,0 ± 1, 1 Mpa. It has been reducing the size of the bacterial cells when the temperature of cultivation decreased. It has been established that the adhesion force was also dependent on the temperature factor , and it increased when the temperature decreased.
Ключевые слова: модуль Юнга; упруго-механические свойства бактерий; ризобакетрии; сила адгезии.
Keywords: Young's modulus; elasto-mechanical properties of the bacteria; rhizobacteria; adhesion force.
Одним из наиболее общих интегральных показателей структурно-функционального состояния бактерий и их мембран являются вязко-эластические свойства, изучение которых стало возможным благодаря использованию атомно-силовой микроскопии [5, 6]. Упругость и вязкость являются фундаментальными механическими свойствами микроорганизмов, определяющими их функциональность [2, c. 14]. Известно, что структурные
трансформации в мембране приводят к изменению её упругости с последующей деформацией клетки [3, с. 54].
Упруго-эластические свойства бактерий обеспечивают их устойчивость к действию абиотических факторов окружающей среды [3, с. 55]. Среди физико-химических факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов, наибольшее значение имеет температура. Большинство ризосферных микроорганизмов являются мезофилами с оптимумом роста при 26—30 °С. При температуре ниже оптимальной на 5—10 °С бактерии не погибают, однако, происходит изменение структуры бактерий и задержка их размножения.
Известны такие методы измерения вязкоупругих характеристик клеток микроорганизмов, как прямой метод с применением микроманипуляционной техники, оптический, основанный на регистрации изменений светорассеяния микробных суспензий, и метод инородных включений [2, с. 73]. Однако все они имеют ряд недостатков, ограничивающих их применение в работе с микроорганизмами. Имеются единичные сообщения о применении для характеристики механических свойств бактериальных мембран атомно-силовой спектроскопии, основанный на измерении степени деформации поверхности при её взаимодействии с вершиной зонда атомно-силового микроскопа [1, с. 68]. Данный метод позволяет проводить измерение модуля упругости (модуля Юнга) и на основе этого производить расчет степени деформации микроорганизмов.
Целью работы явилась характеристика степени деформации мембраны ризобактерий Cucurbita pepo L. на основе определения модуля Юнга при атомно-силовой микроскопии.
Материалы и методы исследования
В работе было изучено 24 штамма бактерий, выделенных из ризосферы Cucurbita pepo L. Штаммы ризобактерий культивировали в жидкой питательной среде LB (Danies, Россия), содержащей агар до 2,25 % и выдерживали при температуре 37 0 С в течение 10 ч [10].
Упруго-механические свойства ризобактерий изучали в стационарной фазе роста (10—18 ч культивирования) при различных температурных показателях: +50 С (1 группа), 00 С (2 группа), -50 С (3 группа).
Исследования проводили с использованием сканирующего зондового микроскопа Solver P47-PRO (NT-MDT, Россия) при помощи зондов с золотым напылением серии NSG10 (NT-MDT, Россия) размером 95х30 мкм, с жесткостью балки 17 Н/м, радиусом закругления иглы 10 нм. Анализ морфометрических показателей полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа Debug Nova 1.1.0.1847.
При определении упругих свойств бактериальных клеток происходит снятие зависимостей прогиба кантилевера от расстояния между концом иглы и поверхностью образца. Получаемые в процессе измерений так называемые «кривые подвода» представляют собой графическое отображение зависимости отклонения кантилевера от его перемещения по вертикальной оси Z. Алгоритм исследования включал в себя предварительное получение кривых подвода с объекта, упругость которого превышает константу упругости кантилевера (kc).
Предполагается, что движение сканера по оси Z (Az) сопровождается пропорциональным отклонением кантилевера (Ad). В свою очередь в случае «мягкого» образца (ko<kc) отклонение кантилевера оказывается несимметричным движению сканера (Az>Ad), поскольку поверхность объекта «продавливается» зондом. Зарегистрированные показатели в дальнейшем используются для вычисления глубины продавливания как ö=Az-Ad с последующим расчетом модуля Юнга по модели Герца, описывающей контактную деформацию двух тел. При этом исходная формула(1) выражала зависимость между действующей на объект силой (F) и глубиной его продавливания (5):
F = 53
3 1-V ,(1)
где: F — приложенная сила,
E — модуль Юнга, характеризующий упруго-эластические свойства ЦПМ бактерий,
V — коэффициент Пуассона,
5 — продавливание,
R — радиус иглы. Коэффициент Пуассона для бактериальных клеток равен
0,5.
Статистическую обработку данных производили с использованием программ "Microsoft Excel" и "Statistika 6.0". Оценку статистической значимости полученных результатов осуществляли с помощью t- критерия Стьюдента.
Результаты исследования.
В ходе исследования было установлено, что структурно-механические свойства ризобактерий изменялись в зависимости от температуры их культивирования.
Бактериальные клетки 1 группы оказывались менее упругими по сравнению с ризобактериями 2 и 3 группы. Показатели модуля Юнга ризобактерий 1 группы составил 3,6±0,1 Мпа, 2 группы — 5,1±0,7 Мпа, 3 группы — 6,0±1,1 Мпа (рис. 1).
+ 5 С ОС -5 С
Температура культивирования, С
Рисунок 1. Показатели модуля Юнга при различных температурных
режимах культивирования
В ходе исследования было также установлено, что в зависимости от температуры изменяются морфометрические параметры ризобактерий.
В процессе культивирования ризобактерий при снижении температуры бактериальные клетки уменьшались в размерах. В 1 группе линейные размеры бактериальных клеток составляли 1,86х0,92 нм, во 2 группе — 1,38х0,59 нм и в 3 группе — 0,94х0,45 нм (рис. 2).
Изменение морфометрических параметров ризобактерий при снижении температуры сопровождалось изменением силы адгезивного взаимодействия.
Динамика адгезивной активности оказалась обратно пропорциональной изменению температурного фактора. Сила адгезии бактерий 1 группы составила 544,0±59,8 нН. При снижением температуры адгезивное взаимодействие достоверно увеличивалось, и во 2 и 3 группах сила адгезии составила 2250,8±51,3 нН (р<0,05) и 5849,0±73,4 нН (р<0,05) соответственно (рис. 2).
7000 6000 » 5000 1 4000
СО
% 3000
га
£ 2000 ° 1000 о
Рисунок 2. Изменение показателей силы адгезивного взаимодействия
ризобактерий от температуры
Таким образом, установлено, что снижение температуры в процессе культивирования влияет на структурно-механические и морфологические свойства ризобактерий. Показатель Юнга изменялся обратно пропорционально относительно температуры. Уровень модуля упругости ризобактерий возрастал в 1, 2 и 3 группах как 1<1,4<1,7 соответственно. При снижении температуры культивирования происходило достоверное уменьшение размеров бактериальных клеток (р<0,05).
Снижение температуры сопровождалось повышением показателей силы адгезии. Так, при +5 0С адгезивная сила ризобактерий составила 544,0 нН; при 0 0С и -50С — показатели силы адгезии увеличились в 4,1 и 10,7 раза соответственно.
Список литературы:
1. Васильченко А.С., Яруллина Д.Р., Никиян А.Н., Тесля А.В. Морфофункициональные характеристики Bacillus cereus на различных этапах жизненного цикла//Вестник ОГУ. — 2012. — № 10. — С. 66—71.
2. Кобелев А.В., Смолюк Л.Т., Кобелева Р.М., Проценко Ю.Л. Нелинейные вязкоупругие свойства биологических тканей. Екатеринбург: УрО РАН, 2011. — 244 с.
3. Лебедев Д.В., Чукланов А.П., Бухараев А.А., Дружинина О.С. Измерение модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа//Письма в ЖТФ. — 2009.
— Т. 35. — Вып. 8. — С. 54—61.
4. Яминский И.В., Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Семенов А.Э., Филонов А.С. Визуализация прокариотических клеток с помощью атомно-силовой микроскопии// Зондовая микроскопия-97: Всероссийское совещание по зондовой микроскопии. 1997. — С. 124—127.
5. Deng Z., Lulevich V., Liu F.-t., Liu G.-y. Applications of Atomic Force Microscopy in Biophysical of Cells // J. Phys. Chem. B. — 2011. — Vol. 114.
— № 18. — P. 5971—5982.
6. Francis L.W, Lewis P.D., Wright C.J., Conlan R.S. Atomic force microscopy comes of age // Biol.Cell. — 2010. — Vol. 102, — № 2. — P. 133—143.
7. Heinz W.F. and Hoh J.H. Spatially resolved forse spectroscopy of biological surfices using the atomic force microscope. Trends Biotechnol., — 1999a, — v. 17, — p. 143—150.
