CC BY
11
богатого стрептококком, происходит с помощью 0,5% раствора через 6 минут.
Белье из хлопчатобумажной ткани обеззараживается 1,5% раствором через 30 минут, а тряпки — через 40 минут.
Л. Е. РОХЛИНА (Москва)
Применение модифицированной среды Климмера—среды агар-бромтимолблау для бактериологического исследования сточной воды
Из Московского дезинфекционного института
До сих пор нет точного подсчета числа колоний кишечной па-, лочки. Поиски таких способов продолжаются давно, но пока не дали вполне удовлетворительных результатов.
Еще в 1909 г. Марман предложил метод непосредственного счета колоний В. coli на среде Эндо. Этот метод проверялся на Рублевской опытной станции в течение нескольких лет и показал, что посевы на плотной среде дают более точное число колоний кишечной палочки, чем на жидких средах (Булира, Эйкмана).
На Рублевской опытной станции была модифицирована среда Эндо (эндоглюкоза+фенол) с заменой лактозы глюкозой и добавлением 0,1% фенола для более успешного выделения палочек В, рага-соИ и coli и для угнетения споровых палочек. Кроме того, там же был введен способ фильтрации определенного объема воды через мембранный фильтр нитроцеллюлозы, который накладывается на среду Эндо. На поверхности фильтра развиваются красные колонии кишечной палочки, которые соответствуют числу колоний В. coli в пропущенном через фильтр объеме воды. Этот метод считается удачным для питьевых вод, но для сточных и других загрязненных жидкостей является неприемлемым в силу того, что густой рост колоний трудно поддается подсчету.
Вопросам перехода на твердые среды при санитарном исследовании молочных продуктов уделяли и уделяют много внимания в ряде стран. Климмер, Гейпт и Борхерс предложили определять титр coli aerogenes в молоке на агаре с лактозой, бромтимолблау и триптофла-вином (эмпирическая формулабромтимолблау: C27H28OriBr2S). Рюмкорф тоже использовал среду Климмера для определения титра coli aero-geines в молоке. Он увеличил концентрацию водного раствора трипо-«флавина для задержки роста молочнокислых бактерий и получил весьма хорошие результаты. Деметер для определения титра coli aerogenes ßi /молоке пользовался несколькими твердыми средами, в том числе средой агар-бромтимолблау с трилтофлавином, причем получил наибольшой эффект на среде Климмера. Бурке Гафней провел интересную работу с водой на определение В. coli и< coli aerogenes на рекомендованной им среде — глюкозофосфатный агар с бромтимолбау и получил хорошие результаты.
У нас в СССР среда агар-бромтимолблау проверялась Н. И. Каю-ковой во Всесоюзном научно-исследовательском холодильном институте в Москве на мороженых продуктах. Одновременно с этим велась работа и на других твердых средах. Наиболее подходящей оказалась модифицированная среда Климмера. Каюкова провела второе исследование работы на этой же среде с молочными продуктами в лабо-
ратори,и молочной промышленности. Обе эти работы нам были представлены автором в рукописи.
Надо указать, что при производстве указанных опытов среда Клим мер а была видоизменена. За отсутствием трипофлавина, который задерживает развитие грамположительных и споровых палочек, была введена желчь, не уступающая в этом отношении трипофлавину. Кроме того, был взят другой состав некоторых ингредиентов среды (см. ниже рецепт).
В своей работе мы поставили целью проверить модифицированную среду Климмера (среду агар-бромтимолблау) для исследования сточной воды на титр coli и сой-индекс, чтобы выяснить преимущество этой среды, дающей возможность получения более высокого coli-титра в короткий срок и более точного числа колоний В. colli в определенном объеме воды.
Агар-бромтимолблау является элективной средой для всей кишечной группы. Эта среда подавляет рост грамположительных стрепто-и стафилококков, и споровых палочек. На ней легко и быстро выделяется кишечная палочка, улавливается более высокий титр ее, чем на жидкой среде Эйкмана, и можно точнее учесть число колоний кишечной палочки. Среда агар-бромтимолблау может быть легко применима для сточной воды еще и потому, что посевной материал засевается от 0,1 и ,не более 1 см3. Кроме того, эта среда дает возможность через 24 — 48 часов дифференцировать фекальную группу В. coli от почвенной coli aerogenes. Приводим рецепты оригинальной и модифицированной сред Климмера.
Состав среды Климмера (оригинальная)
Мясной экстракт................3 г
Пептон . ;...................5 »
Лактоза.....................10 »
Агар......................25 »
1% водный раствор трипофлавина на 1 л
среды.................. 5 см3
1,594 спиртовый раствор бромтимолблау ... 10 »
Дестиллированная вода............1 ООО »
рН среды.................. 6,8
Состав модифицированной среды Климмера (среды агар-бромтимолблау)
Пептон........................................10 г
Желчь......................................50 см8
Лактоза......................................10 г
Агар . • ................25 »
1,5% спиртовый раствор бромтимолблау ... 10 см3
Дестиллированная вода........... 1 000 »
рН среды ...................................6,8
Приготовление среды. 10 г пептона растворяется в 1 ООО см* дестиллированной воды, прибавляется 50 см3 желчи и устанавливается рН=6,8. Прибавляется и растворяется обычно способом 25 г мурманского или заграничного агара. После фильтрования прибавляется 10 г лактозы и 10 см3 1,5% спиртового раствора бромтимолблау. Приготовленная среда разливается по пробиркам или колбочкам и стерилизуется в автоклаве 20 минут при 120°. Среда приобретает бутылочнозеленый цвет, переходящий при окислении в желтый, а при ощелачивании — в синий. Изменение окраски среды зависит от индикатора бромтимолблау, рН которого колеблется от 6 до 7,6.
Среда имеет нормально бутылочнозеленый цвет при почти нейтральной реакции рН=6,8. Кишечная палочка как кислотообразователь меняет окраску среды на желтую, приближая ее к рН = 6,8, паратифы, дизентерия и другие щелочнообразователи окрашивают ее в синий цвет, приближая реакцию среды к рН = 7,6.
Мы вели работу, с одной стороны, на питательной жидкой ореде Эйкмана и параллельно с этим на твердой агар-бромтимолблау, для чего пользовались следующей методикой.
На 1 см3 пробы сточной воды приготовлялись разведения в убывающей геометрической прогрессии до 0,000001. Из каждого разведения, начиная от 0,01 до 0,000001, производились посевы на питательную среду Эйкмана по 1 см3 на каждые две пробирки. Параллельно с этим делались высевы по 0,1 см3 каждого разведения на среду агар-бромтимолблау, причем посевы в данном случае проводились по поверхности пластинки агара, предварительно просушенной. В тех случаях, когда требовалось сеять 1 см3, посевы проводились методом заливки.
Посевной материал растирался по поверхности агара петлей или шпаделем Дригальского, приготовленным из пастеровских пипеток, всегда одного ,и того же размера. Посевы Эйкмана ставились в термостат на 24 часа при температуре 43°. Посеянные чашки с агар-бромтимолблау тоже оставлялись в термостате на такой же срок, но при температуре 37°. Через сутки забродившие и мутные пробирки со средой Эйкмана высевались на элективную среду Эндо. В лучшем случае (т. е. когда мы получали везде муть и газ или муть) можно было только через 48 часов приступить к дальнейшей идентификации кишечной палочки, тогда как на среде агар-бромтимолблау мы уже через 24 часа получили типичные колонии В. coli, которые позволяли тут же приступить к дальнейшей идентификации кишечной палочки.
Описание колоний. Колонии кишечной палочки получаются плоские, оранжевого цвета, которые при проходящем свете на обратной стороне в центре более интенсивно окрашены. С течением времени окраска темнеет. Цвет среды, как уже было сказано выше, переходит из зеленого в желтый.
На среде агар-бромтимолблау выделяются также колонии В. coli aerogenes, отличающиеся от В. coli тем, что не просвечиваются и имеют крупные колонии слизистой консистенции с более светлой желтой окраской. С течением времени она тоже темнеет. На этой ореде были испытаны культуры паратифа и дизентерии Шига, которые развиваются в виде мелких голубовато-зеленых колоний. Колонии окружает среда синего' цвета.
В результате сравнительных 'исследований сточной воды на жидкой среде Эйкмана и Эндо, с одной стороны, и твердой агар-бро!мти-молблау — с другой мы получили следующие данные по титру coli ((табл. 1).
Таблица 1
Сравнительные данные титра coli в 1 см3 сточной воды на средах Эйкмана—Эндо и агар-бромтимолблау
Число опытов Разведения Количество положительных результатов
среда Эйкмана агар-бромтимол-блау
в абсолютных числах В о/о в абсолютных числах в %
64 0,00001 48 75 64 100
0,000001 12 19 35 55
0,0000001 0 0 5 6
Таким образом, через сутки на среде агар-бромтимолблау мы почти всегда получали более высокий титр кишечной палочки. Следовательно, титр coli на испытуемой среде выше стандартного.
Особенное внимание надо обратить на эффективность среды агар-бромтимолблау для получения более точного числа колоний кишечных палочек в определенном объеме воды. До сих пор coli-индеке вычисляется по общепринятому методу (теоретически) из титра coli. Даже внесенная поправка на соИ-индекс по теории вероятности дает далеко не то количество колоний кишечной палочки, которые мы в действительности получали в наших опытах. Сравнительные данные приведены в табл. 2.
Таблица 2
Сравнительные данные по числу колоний В. coli
Число опытов Разведения Число колоний кишечной палочки по Эндо Число колоний кишечной палочки на агар-бромтимолблау Среда Эндо Агар-бром минимум тимолблау максимум
10 10 64 64 64 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001 10 000 100 000 4 800 000 12000 000 0 95 100 576 000 18 120 000 45 345 000 66 000 000 1 000 10 000 100 000 1 000 000 0 30 000 10 000 100 ОСО 1 020 000 10 000 000 149 000 2 960 000 2 460 000 3 700 000 20 000 000
Если возьмем среднее арифметическое из каждого разведения,, учитывая общее количество опытов, то получаем такое соотношение:
в 0,001 разведения соИ-индекс возрос в 9,5 раза » 0,0001 » » » » » 5,75 »
» 0,00001 » » » » »3,8 »
» 0,000001 » » » » » 3,8 »
» 0,0000001 разведения ^ на среде Эндо 0, на агар-бромтимолблау— 5 случаев из 64 опытов.
Таблица 3
Среднее число колоний кишечной палочки в 1 смд сточной воды на среде Эндо и агар-бромтимолблау
CQ Среднее число колоний На число
Месяцы О Н- 3 опытов
о
о ч U s среда Эйкмана-Эндо агар-бромтимолблау
Декабрь 1936 г....... Январь 1937 г....... Февраль » » ..... Март » »...... Апрель » » ...... Май » » ...... Июнь » »...... Июль » »...... Сентябрь » » ...... Октябрь » »...... 4 8 6 6 8 9 9 3 4 7 100 000 100 000 55 000 250 000 188 700 200 000 500 000 400 000 550 000 614 285 522 500 546 875 352 500 1 550 000 700 000 1 366 700 1 928 000 1 633 000 2 860 000 3 336 657
64 2 957 985 14 796232
В среднем . . . j 295 728, 1 419 272
Сравнение максимумов дает следующую картину. При- средних по-максимуму разведениях 0,0001 и 0,00001 особенно ярко видно увеличение числа колоний (до 27 раз). Что касается минимумов, то мы здесь тоже имели большое увеличение, хотя получили одно совпадение из 10 опытов в 0,'0001 разведении и 3 совладения из 64 опытов в 0,00001 разведении, чем легко можно пренебречь.
Далее, выводя среднее число положительных результатов 64 опытов по месяцам (табл. 3), мы видим, что в 1 см3 сточной воды число колоний В. coli почти в 5 раз больше на среде агар-бромтимолблау по сравнению со средой Эйкмана.
Выводы
1. Твердая среда агар-бромтимолблау имеет следующие преимущества перед жидкой средой Эйкмана:
а) она является элективной средой для кишечной палочки; ,
б) она исключает возможность Ложных индексов, которые иногда встречаются в бродильной пробе;
в) ускоряет на сутки типичный рост кишечной палочки, которую можно использовать для дальнейшей идентификации, и, таким образом, сокращает на сутки же срок получения ответа;
г) улавливает более высокий титр по сравнению со средой Эйкмана-Эндо; , 1
д) дает более точное число колоний кишечной палочки по сравнению с расчетами по типру coli;
е) отличается чрезвычайной простотой и удобством, благодаря чему экономит среды, рабочее время и рабочую силу; она портативна и поэтому легко может быть использована для посевов на 'местах при взятии проб.
2. Среду агар-бромтимолблау надо испытать для исследования питьевой воды с применением мембранных фильтров.
3. Среда представляет большой интерес для бактериологической диагностики всей кишечной группы. Данную среду надо исследовать с целью выявления pH для различных представителей кишечной группы.
§
7.4
