Применение мезенхимальных стромальных клеток на фоне гидрометры и рубцовых изменений матки, оценка возможности наступления самопроизвольных родов в эксперименте

Оноприенко Наталья Валентиновна; Майбородин Игорь Валентинович; Пекарев Олег Григорьевич; Частикин Геннадий Анатольевич

№ 2 - 2014 г.

14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 611.66:618.514]:611-013.395

ПРИМЕНЕНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ФОНЕ ГИДРОМЕТРЫ И РУБЦОВЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МАТКИ, ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ НАСТУПЛЕНИЯ САМОПРОИЗВОЛЬНЫХ РОДОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Н. В. ОноприенкоИ. В. Майбородин1. О. Г. ПекаревГ. А. Частикин1

1ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН

(г. Новосибирск)

2ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава

России (г. Новосибирск)

Цель работы: изучить изменения тканей и установить возможность самопроизвольных родов у крыс после моделирования гидрометры с последующим введением аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения (АММСККП). После инъекции в рубец матки АММСККП в нем возрастает число сосудов, образованных de novo с участием введенных клеток. После применения АММСККП животные начали рожать на 2 эстральных цикла раньше, процент родивших крыс в этой группе был выше, у них было больше общее количество потомства. Материнская смертность после применения АММСККП, наоборот, была меньше. После введения АММСККП имеется уверенная тенденция к ускорению репаративных процессов в матке крыс при рубцовом сужении ее просвета.

Ключевые слова: рубец матки, гидрометра, аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костномозгового происхождения, ангиогенез.

Оноприенко Наталья Валентиновна — кандидат медицинских наук, ассистент кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 267-96-66, е-mail: [email protected]

Майбородин Игорь Валентинович — доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории стволовой клетки ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 361-51-50, е-mail: [email protected]

Пекарев Олег Григорьевич — доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 267-94-11, е-таШ [email protected]

Частикин Геннадий Анатольевич — кандидат медицинских наук, докторант лаборатории стволовой клетки ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 333-15-94, е-таП: [email protected]

На сегодняшний день воспалительные заболевания женских половых органов и, как их следствие, спаечный процесс приводят к нарушениям репродуктивной функции у женщин. Наиболее актуальным в этом плане является бесплодие. Изучение особенностей этиопатогенеза при развитии спаечного процесса и синехий в полости матки позволяет обосновать новые направления его лечения и профилактики.

Согласно современным представлениям, физиологическая регенерация тканей взрослого организма и их репарация в случае повреждения осуществляются при непосредственном участии низкодифференцированных клеток-предшественников или стволовых клеток. Костный мозг содержит два принципиальных типа стволовых клеток: гемопоэтические и мезенхимальные. Считается, что оба этих типа клеток имеют предшественников с потенциалом к трансдифференцировке в клетки различных фенотипов.

Помимо костного мозга мультипотентные стволовые клетки были обнаружены и в других тканях взрослого организма — жировой, мышечной и нервной, а также в периферической крови и крови пуповины/плаценты. Более того, установлено, что в зависимости от микроокружения стволовые клетки способны преодолевать

гемопоэтический/мезенхимальный барьер, так как обладают высокой пластичностью в плане дифференцировки и трансдифференцировки.

В связи с малой эффективностью широко применяемых методик лечения рубцов миометрия была сделана попытка коррекции данной патологии с использованием клеточных технологий.

В связи с вышеизложенным была поставлена цель исследования: изучить изменения тканей рубца и матки крыс и установить возможность самопроизвольных родов после лигирования маточных рогов с последующим введением в эти участки аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения (АММСККП).

Материал и методы исследования. В качестве модели были использованы самки крыс инбредной линии Wag весом 180-200 г возрастом 6 месяцев. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». В асептических условиях проводили нижнесрединную лапаротомию. Маточные рога выводили в рану и тщательно обкладывали стерильными салфетками. Под конец каждого рога вблизи тела матки подводили кетгутовую лигатуру и перевязывали в указанном отделе. Брюшную полость ушивали наглухо послойно [1, 2].

АММСККП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей у крыс-самцов линии Wag. Полученную суспензию клеток помещали в пластиковые

флаконы («Nunk», Дания), через 48 часов после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде а-МЕМ с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37 °С в СО2 — инкубаторе с 5 % СО2 в условиях насыщенной влажности. Смену среды производили каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рассевали в плотности 1000-5000 клеток/см2 (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), использовали стандартные растворы Версена и трипсина [1, 2]. АММСККП 2 пассажа трансфицировали ДНК плазмиды pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., USA), содержащей ген зеленого флюоресцентного белка GFP.

Более подробный протокол трансфекции и способы оценки экспрессии введенного гена GFP в АММСККП изложены в наших более ранних работах [1, 2]. Через 4 часа после трансфекции клетки разводили нетрансфицированными клетками в соотношении 1:2,5 соответственно и по 100 мкл смеси при релапаротомии и после удаления нелизированных остатков шовного материала вводили в область сформированного рубца через 2 месяца после перевязки обоих маточных рогов [1, 2]. Контролем выступали крысы с перевязанными маточными рогами без использования АММСККП и интактные животные. На каждую точку исследования было использовано 12 крыс (всего 108 животных). Фрагменты маточного рога с рубцом, удаленные через 4 суток, 1, 2 и 3 недели после введения АММСККП, фиксировали в 4 % растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 часов, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в гистопласт. Неокрашенные срезы толщиной 5-7 мкм изучали на световом микроскопе Axioimager M1 при увеличении до 1500 раз в режиме люминесценции с фильтром Alexa 488.

Сразу по истечении 3-х недель после удаления лигатур с рогов матки (с последующим применением АММСККП (26 животных) или без него (46 особей)) к оставшимся крысам подсаживали самцов. Регистрировали дату родов и количество новорожденных крысят. В связи с тем, что беременность у этого вида животных длится 22 дня, наблюдение вели в течение 10-ти недель после подсаживания самцов (3 срока наступления и завершения беременности). Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel 7.0 (Microsoft, USA). Достоверность различий определяли на основании критерия Стьюдента. Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95 % и выше. При расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному.

Результаты. Через 4 суток после удаления лигатуры с перевязанных рогов матки и введения АММСККП в рубце миометрия, тканях вокруг и в миометрии были найдены единичные небольшие сосуды, полностью построенные из светящихся клеток. Несколько реже клетки со свечением формировали только часть сосудистой стенки (рис. 1). На рис. 1-4 представлены морфологические изменения рубца маточных рогов крыс в различные сроки после инъекции АММСККП с трансфицированным геном GFP. Неокрашенные срезы в отраженном ультрафиолетовом свете с фильтром Alexa 488.

Рис. 1. Спустя 4 суток после введения АММСККП в рубце рога матки присутствуют кольцевые структуры, напоминающие сосуды. Их стенки состоят из крупных клеток, где на фоне ярко светящейся цитоплазмы заметно более темное ядро. Флюоресцирующие клеточные элементы расположены не только внутри сосуда, но и снаружи

Таким образом, уже к 4-м суткам после инъекции в рубце миометрия АММСККП собираются в группы (возможно, что такие группы светящихся клеток образованы в результате пролиферации одной клетки) и формируют кольцевые структуры, сходные с молодыми сосудами: тонкие однослойные стенки и очень широкий практически круглый просвет.

Спустя одну неделю после введения АММСККП в рубце и тканях рядом с ним присутствовало множество мелких кровеносных сосудов, все оболочки которых были построены из светящихся клеток. В таких клетках на фоне ярко флюоресцирующей цитоплазмы было видно более темное ядро. В просвете сосудов были расположены эритроциты, т. е. сосуды были функциональны. Свечение эритроцитов было намного меньше, чем флюоресценция сосудистых стенок (рис. 2). Следует отметить, что клетки красной крови обладают значительной аутофлюоресценцией [6-8].

Рис. 2. Через 1 неделю после применения АММСККП в рубце матки расположено множество мелких кровеносных сосудов, все оболочки которых построены из светящихся клеток. В этих клетках на фоне ярко флюоресцирующей цитоплазмы видно более темное

ядро

Через 2 недели после использования АММСККП было обнаружено множество сосудов различного диаметра с флюоресцирующими клеточными элементами и структурами в сосудистой стенке. Из светящихся клеток были построены целиком сосудистые стенки или их отдельные элементы. Большинство сосудов содержали разный объем форменных

элементов крови, что свидетельствует об их полноценности и активном функционировании (рис. 3).

Рис. 3. В рубце маточного рога на 2-й неделе после использования АММСККП содержатся крупные сосуды артериального типа. Эти сосуды имеют ярко флюоресцирующие эндотелиальную и адвентициальную оболочки. Большинство сосудов содержит форменные элементы крови с аутофлюоресценцией

Количество сосудов со светящимися стенками было максимально к 3-й неделе после введения АММСККП. Такие сосуды присутствовали в рубце, окружающей клетчатке и в тканях матки. Однако интенсивность флюоресценции заметно уменьшилась. Особенно хорошо это заметно в крупных сосудах (рис. 4).

уф -* г^ Зр^, ь АЛЫ ' М 5

КЛ| А > 1" *. .г

& Ш Ш

1 ргп |

Рис. 4. На сроке в 3 недели после инъекции АММСККП в рубце рога матки отмечено свечение всех оболочек склерозированных сосудов. Их стенка не гомогенная, на фоне яркого свечения внутренней и наружной оболочек флюоресцируют, но менее интенсивно,

остальные структуры

По-видимому, из-за мобилизации собственного пула плюрипотентных стромальных клеток костного мозга к этому сроку начинается постепенное вытеснение введенных АММСККП с трансфицированной чужеродной ДНК светящегося белка GFP из сформированных с их участием структур. Такие АММСККП замещаются собственными клетками и подвергаются деструкции и утилизации где-то в других органах и тканях вдали от места

применения. Животные после применения АММСККП начали рожать раньше крыс без использования клеточных технологий, т. е. после инъекции АММСККП крысы начали рожать на 7 дней раньше, чем в группе сравнения. С учетом длительности эстрального цикла у крыс в 4 дня можно заключить, что у этих животных беременность наступает (восстанавливается проходимость маточных рогов) после введения АММСККП на 7 дней или 2 эстральных цикла раньше, чем у таких же крыс без введения клеток.

Меньшая материнская смертность, даже на 1 %, после введения АММСККП является хорошим результатом и указывает как на более быстрое восстановление просвета рога матки, так и на большую прочность оставшихся рубцовых тканей, способных выдержать полноценную родовую деятельность.

Выводы. Можно заключить, что после инъекции в рубец матки АММСККП с трансфицированным геном GFP в нем возрастает число сосудов, образованных de novo с участием введенных клеток. Из светящихся АММСККП были построены целиком сосудистые стенки или их отдельные элементы. Такие сосуды присутствовали в рубце, окружающей клетчатке и в тканях матки. После применения АММСККП животные начали рожать на 2 эстральных цикла раньше, процент родивших крыс в этой группе был выше, у них было больше как общее количество потомства, так и максимальное число крысят. Материнская смертность в этой группе, наоборот, была меньше. Таким образом, после использования АММСККП имеется статистически недостоверная, но уверенная тенденция к ускорению репаративных процессов в матке крыс при рубцовом сужении ее просвета.

Список литературы

1. Ангиогенез в рубце матки крыс после введения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения / И. В. Майбородин, Н. В. Якимова, В. А. Матвеева [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2010. — Т. 150 (12).

— С. 705-711.

2. Морфологический анализ результатов введения аутологичных стволовых стромальных клеток костномозгового происхождения в рубец матки крыс / И. В. Майбородин,

Н. В. Якимова, В. А. Матвеева [и др.] // Морфология. — 2010. — Т. 138 (6). — С. 47-55.

3. Ultraviolet irradiation induces autofluorescence enhancement via production of reactive oxygen species and photodecomposition in erythrocytes / X. Wu, L. Pan, Z. Wang [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2010. — Vol. 396 (4). — Р. 999-1005.

4. Feasibility of flow cytometry for measurements of Plasmodium falciparum parasite burden in studies in areas of malaria endemicity by use of bidimensional assessment of YOYO-1 and autofluorescence / J. J. Campo, J. J. Aponte, A. J. Nhabomba [et al.] // J. Clin. Microbiol.

— 2011. — Vol. 49 (3). — Р. 968-974.

5. Watson J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes / J. Watson // Biotech. Histochem.

— 2011. — Vol. 86 (3). — Р. 207.

6. Tsuji T. Elastic fibers in striae distensae / Т. Tsuji, М. Sawabe // J. Cutan. Pathol. — 1988.

— Vol. 15 (4). — Р. 215-222.

7. Морфологические результаты применения клеточных технологий для коррекции линейной атрофии кожи / И. В. Майбородин, А. И. Шевела, А. Н. Бабко [и др.] // Рос. журн. кожных и венерических болезней. — 2010. — N 1. — Р. 57-62.

APPLICATION OF MESENCHYMAL

STROMAL CELLS AGAINST HYDROMETERS AND CICATRICIAL CHANGES OF UTERUS, ASSESSMENT OF POSSIBILITY OF SPONTANEOUS CHILDBIRTH IN EXPERIMENT

N. V. Onopriyenko1. V. Mayborodin1. O. G. Pekarev2. G. A. Chastikin1

1FSBSE «Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the SB RAMS»

(Novosibirsk c.)

2SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.)

The objective of research is to study changes of fabrics and to estabish possibility of spontaneous childbirth at rats after modeling hydrometers with the subsequent introduction the autologous multipotent mesenchymal stromal cells of marrowy origin (AMMSCMO). The number of vessels formed de novo with participation of entered cells increases in it after injection to cicatricial tissue of a uterus of AMMSCMO. After AMMSCMO application Animals started giving birth on 2 estrous cycles earlier, the percent of born rats in this group was higher, they had posterity more than a total. Maternal mortality after AMMSCMO application, on the contrary, was less. After introduction of AMMSCMO there is a sure tendency to acceleration the repair processes in uterus of rats at cicatricial narrowing of its gleam.

Keywords: cicatricial tissue of uterus, hydrometer, autologous multipotent mesenchymal stromal cells of marrowy origin, angiogenesis.

About authors:

Onopriyenko Natalia Valentinovna — candidate of medical science, assistant of obstetrics and gynecology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 267 96 66, e-mail: [email protected]

Mayborodin Igor Valentinovich — doctor of medical science, professor, leading researcher of stem cell laboratory at FSBSE «Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the SB RAMS», office phone: 8 (383) 361-51-50, e-mail: [email protected]

Pekarev Oleg Grigorevich — doctor of medical science, professor of obstetrics and gynecology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phones: 8 (383) 267 94 11, e-mail: [email protected]

Chastikin Gennady Anatolyevich — candidate of medical science, doctoral candidate of stem cell laboratory at FSBSE «Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the SB RAMS», office phone: 8 (383) 333-15-94, e-mail: [email protected]

List of the Literature:

1. Angiogenesis in cicatricial tissue of uterus at rats after introduction the autologous

of mesenchymal stem cells of a marrowy origin / I. V. Mayborodin, N. V. Yakimova, V. A. Matveeva [etc.] // Bulletin of experim. biology and medicine. — 2010. — V. 150 (12). — P. 705-711.

2. The morphological analysis of results of introduction autologous stem stromal cages

of marrowy origin in cicatricial tissue of uterus at rats / I. V. Mayborodin, N. V. Yakimova, V. A. Matveeva [etc.] // Morphology. — 2010. — V. 138 (6). — P. 47-55.