CC BY
7
диагностики основных биоритмологических типов работоспособности человека. Дальнейшее изучение ритмических колебаний работоспособности позволит более корректно оценивать работоготовность и работоспособность, истолковывая неоднозначно динамику психофизиологических показателей, особенно в тех случаях, когда налицо феномен Wilder.
Выявление биоритмологических особенностей человека должно дать и ощутимый практический эффект, например когда речь идет о профессиональной ориентации, о формировании групп для длительно функционирующих закрытых систем, при распределении видов деятельности во время •бодрствования и т. п.
ЛИТЕРАТУРА. Алякринский Б. С. Космическая биол., 1971, № 2, с. 53.— Бабаджанян М. Г., M у к с и н о в а Л. А. Гиг. труда, 1966, № 9, с. 3.— Васильев И. Г. и др. Физиол. ж. СССР, 1967. № 9, с. 817.— В е й н А. М. Бодрствование и сон. М., 1970.— В е й н А. М. и др. Сов. мед., 1971, № 2, с. 114.— Загрядский В. П., Егоров А. С. Гиг. труда, 1971, № 4, с. 21.— 3 а г р я д -с к и й В. П., Егоров А. С., Я к о в е ц Б. Н. Воен.-мед. ж., 1971, № 9, с. 59.— Ковальский В. В. Ж- общей биол., 1965, в. 1, с. 14.— Л и ц о в А. Н. Экспериментальное изучение суточной динамики некоторых физиологических функций и работоспособности человека в условиях обычных и измененных режимов деятельности. Автореф. дисс. канд. Л., 1967.— Парим В. В. и др. В кн.: Проблемы биоклиматолегии и кли-матофизиологии. 'Новосибирск, 1970, с. 273.— Aschoff J., Science, 1965, v. 148, p. 1927,— Dubois F. S., Am. J. Psychiat., 1959, v. 116, p. 114.— Globus G. G., Phoebus E. С., Bovd R., Aerospace Med., 1972, v. 43, p. 266.—G о 1 q u h о-um W. P., Ergonomics, 1970, v. 13, p. 558.— Halberg F., Reinberg A.. J. Physiol. (Paris), 1967, v. 59, p. 117.— H a m p p H., Arch. Psychiat. Nervenkr., 1961, Bd 201, S. 355. — H e 11 b r u gge Th., Pechstein J., Uliner R. et al. Fort-schr. Med., 1967, Bd 85T S. 289.— KJ e i n K- E., В r u n e r H., Holtmann H. et al. Aerospace Med., 1970, v. 41, p. Г25Г- Mills I. N.. Trans. Soc. Occup. Med., 1967, v. 17, p. 5.— P i e г a с h A., Acta med. scand., 1955, v. 152, Suppl. 307, p. 159. — 5 с h m i d В., Arbeitsmed. Sozialmed. Arbeitshyg., 1971, Bd 6, S. 263.— V о i с u I e s -с u M., Viata med., J972, v. 19, p. 289.— Wilder J., J. nerv. ment. Dis., 1957, v. 125, p. 73.
Поступила 1C/I 1973 r.
УДК 613-073.811.3(047)
Доктор мед. наук Ю. В. Новиков
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЭЛЕКТРОННОГО ПАРАМАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА В ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Одним из физических методов, нашедших широкое применение не только в физике, но и в химии, биохимии и биологии, является метод электронного парамагнитного резонанса. Строение сложных молекул, жидкостей, кристаллов, исследования химических реакций и радикалов, структура полимеров и биологических объектов — вот далеко не полный перечень задач, которые решаются сейчас этим методом. С каждым годом техническое применение его расширяется. Японская фирма, выпускающая приборы для этой цели, выбрала в качестве своей эмблемы ключ, вокруг которого по орбите двигается электрон. И действительно, для многих исследователей метод электронного парамагнитного резонанса стал тем «ключом», с помощью которого открываются двери в такие области исследования, куда еще совсем недавно ученые не могли проникнуть. Этот метод является весьма перспективным как средство познания природы канцерогенеза, лучевого поражения, ферментативного катализа, фотосинтеза.
Ценность метода состоит в том, что он позволяет обнаружить неспарен-ные электроны даже при очень низкой их концентрации в любом веществе, не разрушая и не видоизменяя его, и при этом характеризовать их энергетические состояния или локализацию. Неспаренные электроны играют очень важную роль в любой химической или биологической системе бла-
годаря тому, что обычно обладают высокой энергией и, следовательно, активностью. Поэтому изучение их свойств дает возможность познать свойства молекулярной системы, в состав которой они входят.
Вещества, содержащие неспаренные электроны, можно разделить на 2 группы. В веществах 1-й группы неспаренные электроны связаны либо со всей молекулой, либо с ее частью. Эти электроны перемещаются по сильно делокализованным молекулярным орбиталям и обусловливают разнообразную активность атомных группировок, входящих в состав молекулы. В этом и состоит специфика свободнорадикальных реакций. Поэтому изучение делокализованных неспаренных электронов важно для понимания механизмов таких процессов, как радиационное повреждение биологической ткани или образование различных промежуточных молекулярных форм в ферментативном или каком-либо другом каталитическом процессе.
Ко 2-й группе веществ, содержащих неспаренные электроны, относятся те, в которых неспаренный электрон связан только с каким-либо атомом, а не перемещается по делокализованной молекулярной орбитали, охватывающей многие атомы. Такие неспаренные электроны обычно связаны с атомами переходной группы — железом, кобальтом или никелем, и их число в атоме, равно как и энергия, широко изменяется с изменением валентности того атома, которому он принадлежит. Изучение электронного парамагнитного резонанса в биологических и биохимических системах, содержащих атомы таких металлов или их ионов, часто дает полезные сведения о характере связей исследуемого атома и степени его окисления. Изменения валентности можно прослеживать непрерывно в ходе ферментативных или каких-либо других реакций и, следовательно, изучать их параллельно с кинетикой содержания свободных радикалов.
Многие широко исследуемые в настоящее время биологические и биохимические процессы интересны именно благодаря участию в них неспаренных электронов. Эти электроны играют исключительную роль в кинетике биологических процессов и помогают раскрыть самые интимные механизмы реакций на молекулярном и клеточном уровне. Ведущая роль в возникновении и развитии биологических процессов, протекающих на этом уровне, принадлежит нуклеиновым кислотам, ферментам и другим биологически активным веществам. С помощью метода электронного парамагнитного резонанса можно изучать характер изменений в различных средах при воздействии ионизирующего излучения, выявить роль свободных радикалов и кинетику парамагнитных колебаний в процессе развития опухолей, а также во внутриклеточных изменениях, ведущих к генетическим нарушениям, и др. Мы не знаем еще точных механизмов, обусловливающих возбуждение или гибель свободных радикалов. Можно полагать, что причин для перехода электронов в возбужденное состояние очень много. Сюда относят влияние температуры, УФ- и ионизирующего облучений, соударение с электрическим зарядом, действие химических агентов и т. п. Для возбуждения электронов от введения в организм различных химических веществ необходимо, чтобы энергетические уровни вводимых веществ были расположены ниже электронных уровней основного вещества, отдающего свою энергию примесным молекулам. Это открывает перспективы для использования метода в практике гигиенического нормирования.
Изменчивость сигналов спектра электронного парамагнитного резонанса связана с количественной и качественной перестройкой обменных процессов и соответствующим изменением функционального состояния внутренних органов. Избирательная физико-химическая реакция отдельных органов и тканей на действие вводимых веществ, выражающаяся в соответствующем усилении или уменьшении сигналов спектра электронного парамагнитного резонанса, позволяет заключить, что этот метод можно использовать для суждения о реактивности организма в целом и об избирательной реакции и вовлечении в процесс различных органов и си-
во
стем организма. Это важно при изучении новых токсических веществ.
Метод электронного парамагнитного резонанса позволяет обнаружить и характеризовать неспаренные электроны благодаря тому, что электрон обладает магнитным моментом, связанным со спином, который обладает собственным моментом количества движений (или угловым моментом).
Если к веществу, содержащему неспаренные электроны, приложить внешнее магнитное поле, то электроны разбиваются на 2 группы, обладающие разными энергиями, т. е. происходит расщепление энергетических уровней. На этом и основан метод электронного парамагнитного резонанса. Он состоит в том, что изучаемый образец помещают в сильное однородное-магнитное поле и одновременно подают электромагнитное излучение такой частоты, чтобы квант энергии излучения был равен разности между энергетическими уровнями обеих групп (резонансная частота). За счет энергии излучения неспаренные электроны, находящиеся.на более низком энергетическом уровне, переходят на верхний уровень с одновременным изменением направления спина. Поглощение энергии электронами при их переходе на верхний уровень может быть обнаружено по уменьшению мощности электромагнитного излучения, проходящего через систему, и зарегистрировано на экране осциллографа или каким-либо другим способом, принятым в абсорбционной спектроскопии.
Под действием излучения электроны, находящиеся на нижнем уровне,, поглощают энергию и переходят на верхний уровень; электроны, находящиеся на верхнем уровне, переходят на нижний и излучают квант электромагнитной энергии. Этот второй процесс называется индуцированной эмиссией, и его можно рассматривать как процесс, прямо противоположный процессу поглощения. В обычных условиях на нижнем энергетическом уровне всегда находится несколько больше неспаренных электронов, чем на верхнем, в связи с чем поглощение обычно перевешивает индуцированную эмиссию. Таким образом, разница в заселенности этих 2 уровней определяет интенсивность реально наблюдаемого сигнала электронного парамагнитного резонанса и, следовательно, является одним из самых важных параметров, определяющих рабочую чувствительность ЭПР-спектрометра.
На практике ЭПР-спектрометры работают либо на частоте 9000 мгц, соответствующей длине волны 3,2 см (Х-диапазон), либо на частоте 36 ООО мгц, соответствующей длине волны 8 мм (С2-диапазон). Использование этих волновых диапазонов имеет то преимущество, что они применяются в радиолакации, и соответствующая микроволновая техника хорошо разработана. Напряженность магнитного поля, соответствующая значению g — 2 для свободного электрона, на этих 2 частотах будет равна соответственно 3300 и 13 000 эрстед. Для создания сверхпроводящих магнитов напряженность 13 000 эрстед близка к пределу, которого можно было достичь при сохранении достаточной однородности поля. Поэтому спектрометры (^-диапазона считаются самыми высокочастотными из доступных приборов.
ЭПР-спектрометр состоит из 4 основных узлов — мощного электромагнита, обеспечивающего получение постоянного регулируемого магнитного поля в достаточно большом объеме; генератора, излучающего электромагнитные волны необходимой длины волны; «поглощающей ячейки» (чаще ее называют резонатором), где помещается образец исследуемого вещества; детекторной части, позволяющей регистрировать поглощение энергии элетромагнитной волны с веществом. Сантиметровые радиоволны поступают по волноводу (медная труба, поперечные размеры которой сравнимы с длиной волны) в резонатор. Обычно резонатор представляет собой отрезок волновода, отделенный тонкими медными перегородками с отверстиями для входа и выхода радиоволн. В резонаторе возникает стоячая электромагнитная волна, в пучности магнитного поля которой устанавли-
вается образец исследуемого вещества. Сам резонатор помещается между полюсами электромагнита. Регулируя силу тока в обмотках последнего, изменяют напряженность действующего на исследуемый образец постоянного магнитного поля. Для обнаружения электронного парамагнитного резонанса измеряют ряд значений напряженности магнитного поля и соответствующие им значения тока, получающегося после детектирования прошедшей через образец радиоволны. Кривая поглощения регистрируется либо с помощью осциллографа, либо автоматическим записывающим устройством.
Наиболее важным параметром ЭПР-спектрометра является его чувствительность, измеряемая минимальным количеством неспаренных электронов, которую можно обнаружить в виде линии электронного парамагнитного резонанса.
В гигиенических исследованиях этот метод впервые был использован М. М. Петяевым и соавт. При воздействии на людей фенолов в условиях производства они обнаружили изменения интенсивности сигнала электронного парамагнитного резонанса. Однозначные результаты получены в эксперименте на животных. Механизм изменений обусловлен тем, что фенолы и некоторые их производные являются ингибиторами, способными подавлять активность свободнорадикальных процессов, имеющих место при окислительно-восстановительных реакциях в живой клетке. Действие этих ингибиторов может отчетливо проявляться при содержании их в крови в очень малых, нетоксических концентрациях. Вместе с тем фенолы и их производные сами способны к образованию свободных радикалов, которые, адсорбнруясь на белковую подложку, например эритроциты, могут давать эффект увеличения интенсивности сигнала электронного парамагнитного резонанса от этих объектов. Следует подчеркнуть, что при поликлиническом • обследовании состояния здоровья сотрудниками профпатологическогоотдела института у рабочих наблюдаемых групп признаки интоксикации фенолами не обнаружены. Следовательно, применение электронного парамагнитного резонанса позволяет вскрыть ранние изменения в организме.
В заключение авторы подчеркивают, что одним из перспективных путей применения этого метода в профпатологии и токсикологии является изучение коэффициентов содержания свободных радикалов в тканях внутренних органов, что важно для понимания молекулярных механизмов патогенеза.
Т. М. Каменецкая и соавт. использовали метод электронного парамагнитного резонанса для изучения действия УФ-лучей. Они показали, что в коже белых крыс непосредственно после УФ-облучения животных снижается концентрация свободных радикалов, через 24—48 часов она приходит в норму, а через 72 часа, к моменту максимального развития эритемы, снова повышается. При облучении ртутной лампой ДРШ-ЮОО .лиофилизованных и замороженных тканей при температуре жидкого азота наблюдается повышение содержания свободных радикалов в тканях в зависимости от длительности облучения. Наибольшей чувствительностью к УФ-излучению из исследованных тканей обладают ткани головного мозга, кожи и почек, наименьшей — селезенка. Полученные данные указывают, что в механизме действия УФ-излучения в живом объекте при облучении изолированных тканей и интактных животных определенную роль играют свободные радикалы.
Л. А. Пирузян и соавт. изучили воздействие постоянного магнитного поля напряженностью 5000 эрстед при экспозициях 4, 24 и 72 часа на концентрацию свободных радикалов в органах и тканях белых беспородных мышей. Наиболее общим результатом воздействия постоянного магнитного поля является снижение их количества во всех тканях и органах, кроме мозговой ткани. Максимальное снижение количества свободных радикалов в разных органах достигает 28—55% по сравнению с контролем и достигается в интервале 2—7 суток после выключения постоянного магнит-
ного поля. В последующие дни концентрация свободных радикалов возвращается к норме. В течение первых суток величина максимального отклонения линейна корню квадратному из времени экспозиции. Время достижения максимального отклонения вплоть до экспозиции 3 суток пропорционально корню квадратному из времени экспозиции. При трехсуточной экспозиции заметно увеличение веса селезенки. Гистологические исследования органов показали белковую дистрофию, нарушение цитоплазматиче-ской структуры и перераспределение цитоплазмы.
А. Ф. Ванин и соавт. изучали спектры электронного парамагнитного резонанса печени мышей, которых подвергали воздействию борной кислотой в дозе 1,5 г/кг и бора в дозе 3 г/кг в течение нескольких часов и 16 суток. У экспериментальных животных обнаружена интенсивность сигналов электронного парамагнитного резонанса. Первые 3 сигнала обусловлены геминовым железом в составе фермента цепи свободного окисления, преимущественно локализованного в микросомах, а четвертый — восстановленным комплексом негемового железа в дыхательной цепи митохондрий. Наряду с изменением величины сигналов или их исчезновением в опытах сборной кислотой отмечено появление узкого сигнала и сложного сигнала электронного парамагнитного резонанса с компонентами, характеризующимися триплет-ной структурой и расщеплением. В опытах с борной кислотой в большей мере изменены сигналы электронного парамагнитного резонанса, отражающие состояние пигмента, и в меньшей — комплекс негемового железа в дыхательной цепи митохондрий. В сравнении с бором сдвиги возникали в ранние сроки, но уже через 12 часов происходила нормализация спектров. Это объясняется хорошей растворимостью, быстрым всасыванием и выделением борной кислоты. Тот факт, что элементарный бор вызывал аналогичные изменения, но в более поздние сроки, указывает на специфичность выявленных изменений.
При введении борной кислоты в ранний срок (через 2—6 часов) наблюдались новые сигналы в спектре электронного парамагнитного резонанса печени — узкий и сложный сигнал триплетной структуры, исчезавшие позднее. Эти сигналы возникают в результате значительного отклонения метаболических процессов от нормы, отражая летальные нарушения в состоянии клеток. Сравнительно быстрое исчезновение сигналов в печени животных, затравленных борной кислотой, может быть объяснено либо удалением погибших клеток путем аутолнза, либо быстрым восстановлением центров, ответственных за эти сигналы, вследствие хорошего выделения борной кислоты. Результаты исследований показывают, что при интоксикации соединениями бора изменяется активность ферментов цепей свободного дыхания в митохондриях и микросомах. Авторами показана доступность и плодотворность изучения состояния дыхательных цепей при гигиенических исследованиях.
Таким образом, метод электронного парамагнитного резонанса дает в руки гигиенисту важный инструмент для выявления тонких биохимических сдвигов, происходящих под влиянием факторов внешней среды.
ЛИТЕРАТУРА. Ванин А. Ф., Каспаров А. А., Матха-нов Э. И. Биофизика, 1971, в. 3, с. 472.— К а м е н е ц к а я Т. М., Л и вен-сон А. Р., Обросов А. Н. и др. Труды Центрального научно-исслед. нн-та курортологии и физиотерапии. М., 1970, т. 15, с. 157.— Пирузян Л. А., Барсе-л я н Л. X., М у х о р т о в а О. М. и др. Изв. АН СССР. Серия бнол., 1971, № 1, с. 128.— П е т я е в М. М., Хлебникова М. И., Малышева В. В. и др. Гиг. и сан., 1966, № 10, с. 17.
; Поступила гэ/! 1973 г.
