CC BY
38
-ММЯШИ«! ющшмм -
Применение метода AlphaScreen и AlphaLisa в разработке лекарственных препаратов и фармакокинетических исследованиях
Мухаметшина Р. Т., Копеин Д. С., Симонов В. М.
Акционерное Общество "ГЕНЕРИУМ", Владимирская область, Россия
Аннотация. Разработка лекарственных препаратов нуждается в высокотехнологичных, простых и чувствительных методах. Метод AlphaLISA является универсальным методом, который подходил бы под перечисленные критерии. Однако анализ работ по фармакокинетике лекарственных препаратов, имеющих отношение к данному методу, демонстрирует незначительное количество фармакокинетических исследований при клинических испытаниях. В данной статье мы раскрываем не только положительные стороны метода Alpha, но и его недостатки. Ключевые слова: AlphaLISA; фармакокинетика; лекарственные препараты
Для цитирования:
Мухаметшина Р. Т., Копеин Д. С., Симонов В. М. Применение метода AlphaScreen и AlphaLisa в разработке лекарственных препаратов и фармакокинетических исследованиях. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2022;(1):44-54. https://doi.org/10.37489/2587-7836-2022-1-44-54 Поступила: 24 февраля 2022 г. Принята: 02 марта 2022 г. Опубликована: 30 марта 2022 г.
Application of the AlphaScreen and AlphaLISA method in drug development and pharmacokinetic studies
Mukhametshina RT, Kopein SD, Simonov VM Joint Stock Company "GENERIUM", Vladimir region, Russia Abstract. Drug development requires high-tech, simple, and sensitive methods. AlphaLISA method was announced as a universal method that would fit the listed criteria. However, research of other works on the pharmacokinetics of drugs related to this method showed a small number of pharmacokinetic studies in clinical trials. In this review, we focused on not only the positive aspects of the Alpha method, but also its disadvantages. Keywords: AlphaLISA; pharmacokinetics; medicinal products
For citations:
Mukhametshina RT, Kopein DS, Simonov VM. Application of the AlphaScreen and AlphaLISA method in drug development and pharmacokinetic studies. Farmakokinetika i farmakodinamika = Pharmacokinetics and pharmacodynamics. 2022;(1):44-54. (In Russ). https://doi.org/10.37489/2587-7836-2022-1-44-54 Received: February 24, 2021. Accepted: March 02, 2022. Published: March 30, 2022
Список сокращений / List of abbreviations
AlphaLISA Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay Гомогенный иммунолюминесцентный анализ
BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer Биолюминесцентный резонансный перенос энергии
DELPHIA Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay Иммуноанализ диссоциации с усиленной флуоресценцией лантаноидов
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Иммуноферментный анализ
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer Флуоресцентный резонансный перенос энергии
FLAG /HA/Mjc/6xHis Small tag Низкомолекулярные метки
GCH Glutation Глутатион
GCP Good clinical practice Надлежащая клиническая практика
GLP Good laboratory practice Надлежащая лабораторная практика
GST Glutathione-S-Transferase Глутатион-трансфераза
HER2 Human epidermal growth factor receptor 2 Рецептор эпидермального фактора роста 2
HTS High throughput screening Высокопроизводительный скрининг
IgG Immunoglobulin G Иммуноглобулин G
LOCI Luminescent Oxygen Channeling Assay Иммунолюминесцентный анализ, индуцируемый кислородом
MDM2/MDM4 Mouse double minute 2 homolog/mouse double minute 4 homolog Двойной мышиный гомолог
Ni-NTA/poly-His Nickel nitrilotriacetic acid/polyhistidine-tag Полигистидиновые метки
PTMSELISA ELISA sensitive to histone post-translational modifications ИФА, специфичный к пост-трансляционным модификациям гистонов
RET Resonance Energy Transfer Резонансный перенос энергии
SCD Sickle cell disease Серповидно-клеточная анемия
TR-FRET Time-resolved fluorescence energy transfer Флуоресцентный резонансный перенос энергии с временным разрешением
TRF Time — resolved fluorescence Флуоресценция с временным разрешением
VEGFA Vascular endothelial growth factor A Фактор роста (А) сосудов эндотелия
Введение / Introduction
Межмолекулярные взаимодействия биомолекул присущи каждому клеточному процессу. Любое перечисление основных тем исследований в биологии, например: репликация ДНК, транскрипция, трансляция, сплайсинг, секреция, контроль клеточного цикла, внутриклеточная передача сигнала (сигнальная трансдукция) и многое другое — также является перечислением процессов, в которых молекулярные комплексы вовлечены в качестве основных компонентов. Белки играют основную роль в таких взаимодействиях. Анализ взаимодействий белков в этих комплексах не является исключительной областью белковой биохимии. Другие области биологии, такие как генетика, клеточная биология, биология развития, и особенно молекулярная биология и биофизика практически полностью состоят из изучения и построения сетей взаимодействия биомолекул.
Разработка новых лекарственных препаратов не обходится без проведений доклинических и клинических исследований, соответственно раздел фарма-кокинетики также не остаётся без внимания. Литературные данные о том, что метод AlphaLISA является методом чувствительным/прецизионным, дают нам право предположить о его уникальности и возможном его использовании в доклинических и клинических исследованиях при разработке новых лекарственных препаратов. Соответственно, целью данного обзора является изучение возможностей и недостатков методов Alpha, а также роль данного метода и фактическое применение в фармакокинетических исследованиях.
Определения различных методик межмолекулярных взаимодействий / Definitions of various methods of intermolecular interactions
Технология захвата — методика для измерения взаимодействий между биомолекулами, включая белок-белковые взаимодействия [1], белок-нуклеиновые взаимодействия [2], пост-трасляционные модификации (фосфорилирование белков) [3], белок-лигандные взаимодействия [4] и специфичные аналиты (ци-токины, гормоны). Методом сближения в растворе изучаются биомолекулы, включая белки или нуклеиновые кислоты, а также и низкомолекулярные лиганды [5].
Для сближения донорных и акцепторных компонентов могут использоваться различные подходы. Наиболее яркими примерами являются биотин/стреп-тавидин, глутатион (GSH) / глутатион-С-трансфераза (GST), никель^ТА/полигистидин (Ni-NTA/polyHis), FLAG/anti-FLAG, HA/anti-HA, Myc/anti-Myc и антитела [6]. Многие из этих систем используют специфические последовательности — таги, которые могут быть генетически спроектированы в рекомбинантные белки (например, 6xHis, GST, FLAG, Myc), делая
пост-трансляционные химические модификации необязательными [7].
При зарождении биохимии и молекулярной биологии биологические взаимодействия изучали, используя гетерогенные подходы, когда молекулу, с которой изучается взаимодействие, можно закрепить на подложке либо специфически выделить из раствора. В таких методах происходит инкубация с раствором, где содержатся предполагаемые молекулы для связывания, и требуется отмывка от несвязавшихся молекул. К таким методам относятся имуннопреципитация, вестернблот, аффинная хроматография и пр. Такие классические подходы позволили выяснить и изучить многие фундаментальные взаимодействия, такие как строение молекулярных машин (например, рибосома или реплисома) или передачи внутри- и межклеточного сигнала в различных каскадах. Однако такие методы, где требуется изучить большое количество взаимодействий, малоприменимы. Другой подход состоит в том, чтобы изучать взаимодействия непосредственно в растворе без дополнительных манипуляций. Такие методы называют гомогенными, когда при взаимодействии между донором и акцептором возникает сигнал. Гомогенными методами сближения в растворе изучают биомолекулы, включая и макромолекулы, такие как белки или нуклеиновые кислоты, а также и низкомолекулярные лиганды [5].
Для детекции молекулярных взаимодействий в ряде систем в биологии и химии применяются техники на основе резонансного переноса энергии.
Резонансный перенос энергии (RET) — это безизлучательный перенос энергии от донора к акцептору, наблюдаемый только при их сближении на расстояние менее 10 нм. Для наблюдения RET также необходимо перекрытие спектра эмиссии донора со спектром поглощения акцептора, а также ориентация диполей донора и акцептора при этом не должна составлять угол 90°. На практике RET проявляется в изменении регистрируемого спектра испускания: уменьшении интенсивности испускания донора и появлении спектра испускания акцептора. В случае гибридизации молекулы донора с одним участником и молекулы акцептора с другим участником, появляется возможность изучения межмолекулярных, например, межбелковых взаимодействий в живых клетках. Также возможно изучение конформационных переходов в самой макромолекуле, если донор и акцептор локализованы на разных её концах, и расстояние между ними изменяется при конформационных перестройках. Соотношение интенсивности излучения акцептора к интенсивности излучения донора (RET сигнал) даёт возможность использования RET и для количественного анализа [8].
Общие типы гомогенных техник сближения c высокой пропускной способностью (HTS) включают: FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии), BRET (биолюминесцентный резонансный
перенос энергии), TR-FRET (разрешённый во времени флуоресцентный резонансный перенос энергии), Alpha (гомогенный иммунолюминесцентный анализ).
— Методика FRET
Методика FRET также известна как флуоресцентный резонансный перенос энергии. Это методика используется для изучения биомолекулярных кон-формаций и их динамики как в комплексе с другими молекулами [9], так и самостоятельно [10—13].
- Методика BRET
В работе Vickers TA [2] представлена разработка новой быстрой методики с высокой пропускной способностью. Методика основывается на биолюминис-центном резонансном переносе энергии, используя люциферазу Nanoluc (Nluc) [14, 15].
- Методика TR- FRET
Разрешённый во времени флуоресцентный резонансный перенос энергии — это техника на основе флуоресценции, которая блокирует анализ молекулярных взаимодействий в биохимических процессах. Принцип TR-FRET основывается на флуоресценции с временным разрешением (TRF) для измерения и флуоресценции резонансного переноса энергии между донорным и акцепторным частицами. Метод TR-FRET широко применяется для изучения киназной активности, белок-белковых взаимодействий, клеточных сигнализаций [16].
— Основы метода Alpha (AlphaScreen, AlphaLISA, AlphaPLEX)
В основе метода Alpha лежит хемилюминесцен-ция, где синглетный кислород, генерируемый высокоэнергетическим облучением донорных частиц, диффундирует к акцепторным частицам. Синглетный кислород чрезвычайно нестабилен и может диффундировать на ограниченное расстояние около 200 нм. При сближении частиц синглетный кислород попадает в акцепторные частицы, что приводит к возбуждению каскадной серии химических реакций, в конечном счёте вызывая генерацию хемилюминесцентного сигнала. Молекулы, между которыми изучается взаимодействие, иммобилизуются на поверхности донорных и акцепторных частиц (рис. 1). Такой подход,
Эмиссия 520-620 нм
Рис. 1. Принцип работы метода Alpha
Fig. 1. The principle of operation of the Alpha method
как технология на основе FRET, позволяет изучать взаимодействие молекул напрямую, без стадий отмывки, в отличие от многих других технологий (например, как ИФА). Благодаря этому технология Alpha использует протокол гомогенного состава, в котором время и количество операций при проведении анализа значительно уменьшаются.
Технология Alpha включает в себя методы AlphaLISA, AlphaScreen и AlphaPlex. Отличие между этими тремя технологиями состоит в различных наборах акцепторных частиц. К методу AlphaScreen относят акцепторные частицы, которые содержат красители — тиоксен, антрацен, рубрен. Рубрен излучает свет в диапазоне 520—620 нм. К методу AlphaLISA относят акцепторные частицы, содержащие хелатированный европий. Последний возбуждается светом с длиной волны 340 нм, возникающий в результате превращения тиоксена в производное дикетона после его реакции с синглетным кислородом.
Возбуждённый хелат европия генерирует интенсивный свет, обнаруживаемый в гораздо более узком диапазоне длин волн с максимумом около 615 нм. Реагенты AlphaPlex позволяют регистрировать сигнал длиной 545 нм (частица—акцептор на основе тербия) или сигнал длиной 645 нм (частица—акцептор на основе самария). AlphaPlex позволяет детектировать несколько типов взаимодействий сразу.
История появления метода Alpha / The history of the Alpha method
Развитие технологии Alpha берёт начало от известного метода Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay (LOCI), или иммунолюминесцентный анализ, индуцируемый кислородом. В основе анализа лежит взаимодействие двух типов сферических микрочастиц (битсов). Один тип частиц (донор), при облучении светом, продуцирует синглетный кислород, который в свою очередь является хромогенным субстратом для хемилюминесценции в акцепторном типе частиц [17].
Данный метод впервые был описан Эдвином Ульманом и его коллегами в 1994 году. В дальнейшем метод был запатентован и получил развитие в компании Perkin Elmer как технология Alpha.
В 2001—2003 годах были опубликованы работы, где была описана технология Alpha (Amplified Luminiscent Proximity Homogeneous Assay). В работах измеряли концентрацию cAMP [18], и фосфорилирование AMPK (5'-AMP-activated protein kinase) [19].
В дальнейшем при развитии метода технологию Alpha применяли для изучения траскрипционных факторов, киназ, однонуклеотидного полиморфизма (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) и прочее.
Таблица 1
Сравнительная таблица (преимущества/недостатки методов)
Table 1
Comparative table (advantages/disadvantages of the methods)
Параметр /Метод FP Elisa/DeШa FRET AlphaScreen/AlphaLISA
Размер белка и/или комплекс Меченый лиганд должен быть <1500 кОа и белок должен быть >10 000 Оа Без ограничений Дистанция между донором и акцептором должна составлять не менее 9 нм Дистанция между донором и акцептором должна составлять не менее 200 нм
Нижний предел чувствительности nM; определяется с помощью Kd До фемтограмм Зависит от Kd, обычно 1-100 nM До фемтограмм
Краситель В основном органика флуоресцентные красители; предпочтительно красные (Alexa Fluor) Лантаноиды ^еШа) или ферменты (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза) Донор: Al. Fluor 488 Al. Fluor 594 Европий Тербиум Акцептор: Al. Fluor 555 Al. Fluor 647 XL665 Флюо-ресцеин Донорные шарики производят синглетный кислород, который возбуждает акцепторные шарики с органическим или лантаноидным красителем
Дополнительные промывки Нет Да Нет Нет
Диапазон сигнала (высокий /низкий) 3—5 раз 4—5 порядков <10 раз 2—3 порядка
Стоимость анализа Низкая Низкая Средняя Высокая
Примечания: * — фемтограммы — единица измерения массы, дольная по отношению к единице системы СГС грамму и единице системы СИ килограмму. 1 фг = 10-15 г = 10-18 кг. Notes: * — femtograms — a unit of mass measurement, divided in relation to the unit of the СГС system gram and the unit of the СИ system kilogram. 1 фг = 10-15 г = 10-18 кг. Arkin MR, 2012.Assay Guidance Manual
Сравнение AlphaLISA с другими методиками / Comparison of AlphaLISA with other techniques
В исследованиях, проведённых учёным Prabhu L и его коллегами [20] было проведено сравнение методик AlphaLISA и TR-FRET, которое показало, что первая обладает большей чувствительностью, меньшей изменчивостью, а также способна автоматизироваться для крупномасштабного скрининга.
Для визуализации сравнительных характеристик методов ниже приведена табл. 1.
В последние годы технология Alpha стала довольно популярной в связи с универсальностью для многих методов. Она является очень чувствительной и эффективной на значительных расстояниях между донорными и акцепторными частицами (200 нм, по сравнению с TR-FRET 10—20 нм). После сравнения методов FRET, TR-FRET и AlphaScreen Glickman JF и соавт. [21] были сделаны выводы о том, что метод AlphaScreen обладает максимальной чувствительностью и динамическим диапазоном.
Этот анализ является простым, быстрым и более применимым к высокопроизводительным системам анализа, по сравнению с обычными методами для идентификации белок-белковых взаимодействий.
Применение Alpha метода при разработке лекарственных средств / Application of the Alpha method in the development of medicines
Метод Alpha используется в исследованиях таких молекулярных взаимодействий, как белок—белок, белок—лиганд, ДНК/РНК—белок. Он позволяет изучать передачу сигнала в клетках, изучать состав и работу молекулярных машин, искать перспективные лекарственные молекулы и многое другое. В таких исследованиях принципиальна высокая пропускная способность метода [22].
Высокопроизводительный скрининг (HTS) также необходим для эффективного отбора ингибиторов на основе малых молекул против специфичных мишеней. Ингибиторы, идентифицированные с помощью данной технологии, служат не только бесценным инструментом для изучения важных мишеней в канцерогенезе, но также обеспечивают перспективными кандидатами для терапии многих других болезней. Идеальный скрининг с высокой пропускной способностью должен быть легко воспроизводимым, чувствительным, масштабируемым, экономически незатратным и, самое важное, эффективным [23].
47
фшшшш и Фшщишика
Одним из примеров подавления опухолей при раковых заболеваниях являются деубиквитиназы или ДУБы. Деубиквитиназы связаны со многими болезнями человека, включая неврологические расстройства, опухолевые заболевания и вирусные инфекции, что делает их превосходными кандидатами для фармакологического вмешательства. Многие ДУБы — это мультидоменные белки, которые очень трудно получить рекомбинантным путём в достаточных количествах. В этой связи необходим метод, исключающий необходимость получения рекомбинантного белка и подбор физиологически релевантной среды. Такой метод мог бы ускорить разработку терапевтически эффективных препаратов.
Применение Alpha технологии в сочетании с активной меткой гемагглютинина (HA) деубиквитиназы обеспечивает хорошую платформу для поиска малых молекул деубиквитиназных ингибиторов в клеточном лизате. Деубиквитиназа (UCHL-1 убикви-тин С-концевая гидролаза-1) содержит С-концевую человеческую метку гемагглютинина (HA), которая позволяет ему связываться с акцепторными гранулами AlphaLISA, покрытые анти-HA антителами. В присутствии же цистеина и малых молекул в активном центре деубиквитиназы — переноса синглетного кислорода не происходит. Малые молекулы, способные ингибировать мечение деубиквитиназы — уменьшают альфа-сигнал, что подтверждает рабочую схему для разработки низкомолекулярных ингибиторов для терапевтического вмешательства [24].
Другой пример разработки новой иммунной технологии с высокопроизводительным скринингом на основе метода AlphaLISA описана в работе Muneoka S и соавт. [25]. Авторы данной работы задались целью установить платформу скрининга для выделения моноклональных антител, которые направлены напрямую против интактных мембранных белков, экспрессируемых на поверхности клеток. Была разработана клеточная система AlphaLISA для обнаружения взаимодействия между антиникотиновыми рецепторами ацетилхолина и никотиновыми рецепторами ацетилхолина, экспрессирующиеся на клетках. В принципе, разработанный формат анализа может быть дополнительно применён для оценки антител, нацеленных на любые виды интактных рецепторов клеточной поверхности, такие как GPCR и ионные каналы, любых видов с подходящей комбинацией гранул и лигандов.
Методы AlphaScreen/AlphaPlex используются в основном при поиске новых фармакологических препаратов или при изучении взаимодействий между биомолекулами. AlphaLISA использует хелат европия с гораздо более узким спектром эмиссии в 605—623 нм, что позволяет использовать метод в сложных матрицах (например сыворотка или плазма крови), где есть вещества со спектром поглощения для AlphaScreen/ AlphaPlex. Таким образом, AlphaLISA больше используется как метод для определения концентраций раз-
ных веществ, в том числе терапевтически значимых метаболитов или белков, инфекционных агентов и пр., а также для изучения различных заболеваний и фар-макокинетических исследований новых препаратов.
Применение метода AlphaLISA при изучении различных заболеваний / Application of the AlphaLISA method in the study of various diseases
На сегодняшний день метод AlphaLISA применяется при изучении заболеваний, включающих рак [26], атеросклероз [27], нейродегенеративное заболевание, характеризующееся нарушением двигательного контроля (болезнь Паркинсона) [28] и клеточную лейкемию (лимфома) [29].
Одним из направлений является изучение белков, выступающих в роли опухолевых супрессоров. Так, в статье Xiong F [30], описан метод на основе AlphaLISA для поиска ингибиторов взаимодействий между белком p53 и его негативно регулирующими лигандами, например, такими как MDM2 и MDM4. Белок р53, как хранитель генома, играет важную роль в регуляции клеточного цикла, апоптоза и репарации ДНК, защищая клетки от различных клеточных стрессов, таких как гипоксия и повреждение ДНК [31, 32]. Поэтому неудивительно, что белок р53 тесно связан с возникновением и ростом опухоли человека.
Целью работы Nakahata S и его коллег [29] было создание универсального анализа AlphaLISA для выявления взаимодействий между белком р53 и его негативно-регулирующими лигандами. Донорные и акцепторные частицы соединяли между собой с помощью иммобилизованных антител против His-тага и антител анти-р53 к белку p53-His, соответственно, на донорных и акцепторных частицах. Эти антитела через молекулу р53 формируют мостик между донорными и акцепторными частицами. Однако, если в растворе присутствуют такие белки, как MDM2, конкурирующие с анти-р53-антителом за взаимодействие с TAD-доменом р53, связь между акцепторными и донорными частицами пропадает. В качестве модельной системы были выбраны белки MDM2 и MDM4, так как данные белки являются онкогенами, вследствие негативной регуляции активности р53. При связывании ингибитора (например, нитулина) с MDM2 или MDM4, данные белки не смогут продолжать связываться с белком р53, и флуоресцентный сигнал будет восстанавливаться. Таким образом, в данном методе можно находить ингибиторы взаимодействий между онкогенными белками MDM2 или MDM4 и белком р53.
Ишемическая болезнь сердца также является одной из основной причин смертности, первопричиной которой является атеросклероз. В статье Yoshida Y и его коллег [27] было проанализировано содержание антитела bRPA2, специфичного к белку RPA2-132, в сыворотке от пациентов с ишемической болезнью/ сахарным диабетом и по сравнению с сывороткой
здоровых доноров. Метод AlphaLISA был использован в данной работе для оценки уровня антител в сыворотке и показал статистически значимый более высокий уровень. Для этого в анализе использовали акцепторные гранулы, конъюгированные с иммуноглобулинами (G) человека и донорные гранулы конъюгированные с глутатионом. В результате данного исследования методом AlphaLISA было выявлено статистически значимые более высокие уровни антител у пациентов с ишемической болезнью сердца/сахарным диабетом по сравнению со здоровыми донорами.
Возможности метода AlphaLISA / Features of the AlphaLISA method
С помощью метода AlphaLISA могут быть разработаны несколько видов анализов:
1. Детекция и количественная характеристика нескольких молекул в различных образцах (биомаркеры в сыворотке или плазме, фосфорилирование внутриклеточных белков в клеточных суспензиях и выделение белков из клеточного супернатанта).
2. Характеристика возможных белок-белковых взаимодействий, особенно в больших комплексах.
3. Измерения активности ферментов.
4. Детекция полноразмерных вирусов (прокариот/ эукариот).
5. Промышленные процессы (скрининг примесных белков в производстве), для оценки чистоты биотерапевтических препаратов (белки клеток хозяина и остаточный белок-А).
6. Анализы иммунногенности [33].
7. Характеристика специфичности терапевтических ингибиторов.
Использование технологии AlphaLISA в фармако-кинетических исследованиях / The use of AlphaLISA technology in pharmacokinetic research
Создание новых лекарственных препаратов предполагает обязательное проведение фармакокине-тических исследований. В настоящее время в ряде медицинских центров созданы специальные подразделения для проведения фармакокинетических исследований с целью решения прикладных медицинских задач. Главной задачей фармакокинетики является проведение научно-обоснованной эффективной и безопасной фармакотерапии. Фармакологические исследования проводятся на различных этапах создания лекарственных средств (рис. 2): на стадии доклинического экспериментального изучения на животных, при ограниченных и расширенных клинических испытаниях, а также после внедрения лекарственного средства в медицинскую практику.
Большое внимание при исследовании фармакокинетики новых препаратов следует уделить разработке чувствительного и специфического метода определе-
Рис. 2. Схема разработки лекарственных препаратов Fig. 2. Drug development scheme
Примечание'. https://www.nebiGlab.com/drug-discGvery-and-development-process/
Note: https://www.neHolab.com/drag-discovery-and-devek>pment-process/
ния концентрации препарата в биологических пробах. Чувствительность в идеале должна обеспечивать возможность устойчиво и достоверно определять концентрации, по крайней мере, в 20 раз меньше, чем средние максимальные уровни, наблюдаемые после приёма однократной дозы. Специфичность метода необходима для чёткого определения неизменённого препарата в присутствии его метаболитов и эндогенных соединений. Для отработки специфичности метода необходима его проверка в экспериментах на животных после установления структуры основных метаболитов, а также проверка воспроизводимости результатов анализа in vitro, когда к интактной сыворотке крови добавляют препарат в разных концентрациях [34].
Так как метод AlphaLISA зарекомендовал себя как чувствительный метод, то его использование было бы логичным в диагностике лекарственных препаратов при использовании малых доз. Однако анализ работ по фармакокинетике лекарственных препаратов (Pharmapendium, Pubmed), имеющих отношение к данному методу показал, что количество фармакокинетических исследований при клинических испытаниях не превышало 10. В табл. 2 приведены данные клинических испытаний на основе метода AlphaLISA.
В лаборатории авторов обзора были разработаны две методики на основе AlphaLISA для оценки концентрации двух разных терапевтических моноклональных антител в доклинических и клинических испытаниях. Исследователям удалось достигнуть валидированный нижний предел количественного определения (НПКО) в образцах сыворотки крови крыс, который составил 160 пг/мл, а в сыворотке крови человека — 62,5 пг/мл [неопубликованные данные].
No 1. 2022
49
ФШШОШТШ и ФАМЩШМШ
Таблица 2
Фармакокинетические исследования с использованием метода AlphaLISA
Table 2
Pharmacokinetic studies using the AlphaLISA method
Наименование / год Описание лекарства Дозировка / Способ введения / Стадии исследований Характеристики
Кризанлизумаб (Crizanlizumab) 2019 Chemistry Review 761128/S- 000 Part 04 PDF 1274k https://www.pharmapendium. com/browse/fda/Crizanlizuma b/29903dd4d5e2fbd38ba4eaf1f 8377408?query=alphalisa&inc ludeSynonyms=true Моноклональное антитело; предложено для лечения серповидно-клеточной анемии за счёт ингибирова-ния опосредованных Р-селектином клеточных адгезивных взаимодействий 100 мг/10 мл (10 мг/мл) Внутривенное введение Метод AlphaLisa был разработан для детекции анти—SelG1 в сыворотке клинических исследований А2101(ФК, PD здоровые волонтеры) и А2201 (пациенты с SCD) Метод Alphalisa в данном исследовании не был валидирован
Тепротумумаб (Teprotumumab) 2020 https://www.pharmapendium. com/browse/fda/Teprotumum ab/5b9480da06771e53cb29ff87 04e6a74d?query=alphalisa&in cludeSynonyms=true Summary Review 761143/S-000 PDF 3791k Моноклональное антитело; инсулин подобный фактор роста (IGF-1R) ингибирует развитие тиреоидной офтальмопатии 10 мг/кг начальная доза, в последующем 20 мг/кг каждые 3 недели. Рекомендуемый курс терапии 8 введений Внутривенное введение Находится на стадии валидации
Бевацизумаб (Bevacizumab) (схож с продуктом Авастин) 2017 Chemistry Review 761028/S-000 Part 01 PDF 347k Моноклональное антитело, присоединяется к изофор-мам VEGFA, которые были идентифицированы как регуляторы физиологической, патологической неоваскуляризации развития, поддерживающие рост опухоли и метастазирование 100 мг/4 мл и 400 мг/16 мл Внутривенное введение Валидирован метод для определения бевацизума-ба, не использующий клетки, такой как анти-пролиферационный метод. Это позволяет значительно ускорить анализ
Секукинумаб (Secukinumab) 2015 https://www.pharmapendium. com/browse/fda/Secukinuma b/87ddf2615188f51b1f3a3d3ee b2e5c6f?query=alphalisa&incl udeSynonyms=true Approval Package 125504/S-001 Part 06 PDF 1650k https://www.pharmapendium. com/browse/fda/Secukinuma b/2b5bc7274221783476b42d6a 86d480f2?query=alphalisa&in cludeSynonyms=true Человеческое моноклональ-ное антитело взаимодействует с Интерлейкином 17А (Ш-17А), ингибируя взаимодействия с рецепторами, в последующем с высвобождением противовоспалительных цитокинов, хемокинов и медиаторов повреждённых тканей 150 мг — доза Внутривенное введение 52 недели испытаний, из которых доступны 12 недель исследований Всего 2751 пациентов получали Секукинумаб в течение, как минимум, 6 месяцев Супернатанты культур (Человеческие фибробла-стоподобные синовиоци-ты), предварительно стимулированные TNF в комбинации с IL-17A, IL-17 A/F или IL-17 F секукинумабом,собирали после инкубации в ночь, и уровни ММР-3 определяли с помощью метода Alpha в анализе ELISA
Трастузумаб (Trastuzumab) 2019 https://www.pharmapendium. com/browse/fda/Trastuzumab /06fa09ff76ad05c720edd01378 43224f?query=alphalisa&inclu deSynonyms=true Рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, производное ДНК, относится к IgG1, содержит рамочные регионы человека и комплементарно-определяющие регионы мышиных антител р185 НЕЮ. Антитела селективно взаимодействуют с внеклеточным доменом белка-рецептора-2 к эпидермальному ростовому фактору человека (HER2) на поверхности злокачественных клеток и тормозят их пролиферацию 420 мг на флакон; Внутривенная инъекция Фаза I сравнительного фармакокинетического исследования (однократная доза в течение 8 недель); Фаза III сравнительная эффективность (54 недели активной терапии) Валидирован метод для определения трастузумаба не использующий клетки, такой как антипролифера-ционный метод. Это позволяет значительно ускорить анализ [35]
Окончание табл. 2
Наименование / год Описание лекарства Дозировка / Способ введения / Стадии исследований Характеристики
Инфликсимаб (Infliximab) 2015 Моноклональное антитело, состоящее из вариабельной (Fv) области высокоаффинных нейтрализующих мышиных моноклональных антител к фактору некроза опухоли-альфа и фрагмента молекулы IgGl человека 100 мг лиофилизата инфликсимаба восстановленный в 15 мл флаконе для инъекций Внутривенная инъекция TRPT-030698 квалификация TP-001698 FcGammaRIA присоединение с помощью метода AlphaLISA для ABP710 и инфликсимаба. Результаты подтверждают то, что метод AlphaLISA подходит для оценки диапазона привязывания (присоединения) [35]
Фаза I сравнительного фармакокинетического исследования (время исследования 12 недель); 151 Фаза III сравнительного клинического исследования (общая продолжительность исследования 78 недель); 1216
Адалимумаб (Adalimumab) 2016 Рекомбинантное моноклональное антитело, пептидная последовательность которого идентична IgG1 человека. Препарат используется для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, болезни Крона, язвенного колита, псориаза, гнойного аденита, увеита и ювенильно-го идиопатического артрита. Адлимумаб является селективным иммунодепрессантом Фармакокинетическое сходство — однократная доза (40 мг) Идентификационный номер исследования-20120262
Сравнительные клинические исследования — III фаза — каждую неделю (40 мг) Продолжительность курса — 26 недель Идентификационный номер исследования-20120262 Сравнительные клинические исследования — III фаза — первый день первой недели — 80 мг, затем 40 мг со второй недели, каждую неделю Продолжительность курса — 52 недели Идентификационный номер исследования — 20120263
В ходе исследований при разработке метода были отмечены важные аспекты, которыми являются подбор условий сорбции частиц (антигенов, антител), выбор соотношения испытуемой матрицы (сыворотки, плазмы крови и пр.) к количеству реакционной смеси (суспензии частиц). Кроме того, проведённые эксперименты показали влияние состава буфера для разведения матрицы на неспецифическую агрегацию частиц. Немаловажным фактором для получения достоверного результата является и оптимизация температуры, времени инкубации на различных стадиях реакции и пробоподготовки.
В сравнении с другими высокочувствительными иммунологическими методами чувствительность AlphaLISA достигает фемтомолярных концентраций и сравнима с чувствительной ИФА (High Sensitivity
ELISA), при этом уступая методам на основе элек-трохемилюминисценции (ECL, V-plex™) или флуоресцентным методам на отдельных частицах на 1—2 порядка (Simoa, Erenna) [36].
Дискуссия / Discussion
Методы семейства Alpha — группа методов изучения межмолекулярных взаимодействий, успешно используемых в разных областях (изучение внутриклеточных взаимодействий, медицинская диагностика, эпидемиология, разработка лекарственных средств) как более быстрая и производительная, не требующая стадии отмывки альтернатива ИФА. Главным преимуществом AlphaLISA является возможность
автоматизации и миниатюризации метода за счёт небольшого числа стадий, возможности гомогенного протокола, небольшого объёма образца и широкого аналитического диапазона. Метод используется для создания быстрых скрининговых систем, в том числе полностью роботизированных. Ниже перечислены достоинства и недостатки методов Alpha.
Положительные качества метода AlphaLISA / Positive qualities of the AlphaLISA method:
1. Малое количество образца, необходимого для анализа;
2. Широкий диапазон измеряемых концентраций;
3. Сравнимая или более высокая чувствительность, до 10 раз выше по сравнению с аналогичным методом ИФА;
4. Отсутствие стадии отмывки от несвязавшихся компонентов исключает необходимость использования промывочных станций (вошеров) и, как следствие, хорошая масштабируемость для большого количества образцов при использовании роботизированных станций.
Недостатки AlphaLISA в диагностических исследованиях и фармакокинетике / Disadvantages of AlphaLISA in diagnostic studies and pharmacokinetics:
1. Специализированное, дорогостоящее оборудование (спектрофотометр с фильтрами определённой длины волны);
2. Стоимость и доступность реактивов;
3. Временные затраты для подбора условий и ва-лидации метода;
4. Отсутствие стадии отмывки, с другой стороны, приводит к тому, что компоненты матрицы, тем не менее, могут отрицательно влиять на чувствительность метода, как в случае работы с сывороткой, что приводит к длительному подбору условий и концентраций компонентов для достижения хорошей чувствительности и воспроизводимости;
5. В фармакокинетических исследованиях клинических испытаний зачастую не приводятся характеристики использования данного метода, что указывает на существование проблем в воспроизведении данного метода;
6. Фоточувствительные компоненты.
Анализ по применению данного метода в клинических испытаниях показывает небольшое количество фармакокинетических исследований терапевтических биопрепаратов. Учитывая тот факт, что с каждым годом требования, установленные GLP / GCLP и GCP, к биоаналитическим методам становятся все строже, далеко не каждый метод, использующийся в научных исследованиях, может быть применим и валидирован в клинических исследованиях.
ИФА как классический метод используется более 40 лет в фармакокинетических исследованиях. Однако
ИФА часто требует большого количества образца, плохо масштабируем и более продолжителен по времени проведения анализа вследствие гетерогенного подхода. Несомненно, классические методы, такие как ИФА, для исследования фармакокинетики имеют преимущество т. к. метод хорошо изучен, есть инструментальная база для работы с ИФА в большом количестве лабораторий. Однако там, где существуют ограничения ИФА, следует применять более чувствительные, производительные методы или основанные на других физико-химических подходах.
Валидированные методы AlphaLISA применяются в анализе фармакодинамики различных биологических маркеров в доклинических и клинических исследованиях [37]. Для AlphaLISA разработаны методы для определения TNFa [38], CD80 [39], цитокинов (IL2, IL6, IL17) [36, 37], иммуноглобулинов G1 и G4 классов [40—42], интерферон гамма [43] и много другое. Это свидетельствует о том, что для известных аналитов метод AlphaLISA хорошо валидируется и разработанные наборы пользуются популярностью.
Заключение / Conclusion
Как и в любой технологии, в методе Alpha существуют свои преимущества и ограничения. Основными недостатками данной технологии является фоточувствительность, влияние компонентов матрицы (например, поглощение синглетного кислорода), трудности с разработкой и валидацией метода. Основные преимущества этой технологии заключаются в том, что она применима к очень широкому спектру анализируемых веществ. Методика имеет возможность использовать маленькие количества образца и применять гомогенные, быстрые и чувствительные протоколы, в отличии от классических методов имму-ноанализа. Кроме того, Alpha технологии не требуют введения больших флуоресцентных меток, которые могут стерически препятствовать биомолекулярным взаимодействиям.
Методы Alpha широко используются для обнаружения новых кандидатов для терапевтических препаратов, изучения межбелковых взаимодействий и многое другое, где требуется скринировать большое количество молекул на взаимодействие.
Несмотря на некоторые недостатки, AlphaLISA ограниченно используется в фармакокинетических исследованиях. AlphaLISA применяют для рутинных анализов в фармакодинамических исследованиях биологических и терапевтических маркеров, где разработанная методика может быть валидирована согласно требованиям регуляторов, и при наличии приборной базы стоимость одного анализа становится конкурентоспособной при сохранении высокой чувствительности количественных методов.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ ADDITIONAL INFORMATION
Участие авторов. Мухаметшина Р.Т. — написание основного текста, редактирование; Копеин Д.С. — написание части текста, редактирование; Симонов В.М. — редактирование.
Participation of authors. Mukhametshina RT — writing the main text, editing; Kopein DS — writing part of the text, editing; Simonov VM — editing.
Благодарности. Выражаем благодарность за помощь в техническом редактировании обзора — Ля-госкину И.В., Пантюшенко М.С., Лисицыной О.М., Аббасовой С.Г.
Acknowledgements. We express our gratitude for the help in the technical editing of the review — Lyagoskin IV, Pantyushenko MS, Lisitsyna OM, Abbasova SG.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ / ABOUT THE AUTHORS
Мухаметшина Регина Талгатовна Автор, ответственный за переписку
e-mail: [email protected] ORCID ID: https://orcid.org/0000-0001-6170-5221 к. б. н., м. н. с. АО «ГЕНЕРИУМ», Владимирская область, Россия
Mukhametshina Regina T. Corresponding author
e-mail: [email protected] ORCID ID: https://orcid.org/0000-0001-6170-5221 PhD Biological Sci., junior researcher, JSC «GENERIUM», Vladimir region, Russia
Копеин Дамир Сергеевич
e-mail: [email protected] ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-1176-5829 к. б. н., н. с. АО «ГЕНЕРИУМ», Владимирская область, Россия
Kopein Damir S.
e-mail: [email protected]
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-1176-5829
PhD Biological Sci., research scientist,
JSC «GENERIUM», Vladimir region, Russia
Симонов Владимир Михайлович
e-mail: [email protected] ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-0879-5595 с. н. с. АО «ГЕНЕРИУМ», Владимирская область, Россия
Simonov Vladimir M.
e-mail: [email protected]
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-0879-5595
senior researcher JSC «GENERIUM», Vladimir
region, Russia
Список литературы / References
1. Waller H, Chatterji U, Gallay P et al. The use of AlphaLISA technology to detect interaction between hepatitis C virus encoded NS5A and cyclophilin A. J Virol Methods. 2010;165(2):202—210. DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.01.020.
2. Vickers TA, Crooke ST. Development of a Quantitative BRET affinity assay for nucleic acid-protein interactions. PLoSOne. 2016;11(8):e0161930. DOI: 10.1371/journal.pone.0161930.
3. Guenat S, Rouleau N, Bielmann C et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. JBiomolScreen. 2006;11(8):1015-1026. DOI: 10.1177/1087057106294697.
4. Гильмиярова Ф.Н., Рыскина Е.А., Колотьева Н.А., Потехина В.И., Горбачева И.В. Белок-лигандные взаимодействия: влияние минорных компонентов метаболизма. Siberian Medicl Review. 2017;(6):12—21. [Gylmiyarova FN, Ryskina EA, Kolotieva NA, Potekhina VI, Gorbacheva IV. Protein-ligand interactions: the influence of minor components of metabolism. Siberian Medicl Review. 2017;(6):12-21. (In Russ).]. DOI: 10.20333/25001362017-6-12-21.
5. Coussens NP, Auld D, Roby P et al. Compound-mediated assay interferences in homogenous proximity assays. Assay Guidance Manual. Review. 2020; NBK553584.
6. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013;73:9.9.1-9.9.23. DOI: 10.1002/ 0471140864.ps.0909s73.
7. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mols Biol. 2015;1266:171-184. DOI: 10.1007/978-1-4939-2272-7_12.
8. Смирнова Д.В. Гибридные белки и конъюгаты на основе люци-феразы светляков Luciola Mingrelica и их биоаналитическое применение. Диссертация на соискание ученой степени. Хим. факультет, МГУ им. М.В. Ломоносова. — Москва; 2015. [Smirnova DV. Gibridnye belki i kon"yugaty na osnove lyutsiferazy svetlyakov Luciola Mingrelica i ikh bioanaliticheskoe primenenie. Dissertatsiya na soiskanie uchenoi stepeni. Khim. fakul'tet, MGU im. M.V. Lomonosova. Moscow; 2015. (In Russ).].
9. Mekler V, Kortkhonjia E, Mukhopadhyay J et al. Structural organization of bacterial RNA polymerase holoenzyme and the RNA polymerase-promoter open complex. Cell. 2002;108(5):599—614. DOI: 10.1016/s0092-9674(02)00667-0.
10. Ha T, Enderle T, Ogletree DF et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(13):6264—6268. DOI: 10.1073/pnas.93.13.6264.
11. Kalinin S, Peulen T, Sindbert S et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 2012;9(12):1218—1225. DOI: 10.1038/nmeth.2222.
12. Hellenkamp B, Wortmann P, Kandzia F et al. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET Networks. Nat Methods. 2017;14(2):174—180. DOI: 10.1038/nmeth.4081.
13. Hellenkamp B, Schmid S, Doroshenko O et el. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements—a multi-laboratory benchmark study. Nat Methods. 2018;15(9):669—676. DOI: 10.1038/s41592-018-0085-0.
14. Machleidt T, Woodroofe CC, Schwinn MK et al. NanoBRET— a novel BRET platform for the analysis of protein—protein interactions. ACS Chem Biol. 2015;10(8):1797—1804. DOI: 10.1021/acschembio. 5b00143.
15. Wang J, Ren J, Wu B et al. Activation of Rab8 guanine nucleotide exchange factor Rabin8 by ERK1/2 in response to EGF signaling. Proc Natl AcadSci USA. 2015;112(1):148—153. DOI: 10.1073/pnas.1412089112.
16. Ergin E, Dogan A, Parmaksiz M et al. Time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) assays for biochemical processes. CurrPharm Biotechnol. 2016;17(14):1222-1230. DOI: 10.2174/138920101 7666160809164527.
17. Ullman EF, Kirakossian H, Singh S et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: Measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91(12):5426-5430. DOI: 10.1073/pnas.91.12.5426.
18. Gabriel D, Vernier M, Pfeifer MJ et al. High throughput screening technologies for direct cyclic AMP measurement. Assay Drug Dev Technol. 2003;1(2):291-303. DOI: 10.1089/15406580360545107.
19. Li Y, Cummings RT, Cunningham BR. Homogeneous assays for adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase. Anal Biochem. 2003;321(2):151-156. DOI: 10.1016/s0003-2697(03)00397-x.
20. Prabhu L, Chen L, Wie H et al. Development of AlphaLISA high throughput technique to screen for small molecule inhibitors targeting protein arginine methyltransferases. Mol Biosyst. 2017;13(12):2509-2520. DOI: 10.1039/c7mb00391a.
21. Glickman JF, Wu X, Mercuri R et al. A comparison of ALPHAScreen, TR-FRET and TRF as assay methods for FXR nuclear receptors. J Biomol Screen. 2002;7(1):3-10. DOI: 10.1177/108705710200700102.
22. Eglen RM, Reisine T, Roby P et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Chem Genomics. 2008;1:2-10. DOI: 10.2174/1875397300801010002.
23. Prabhu L, Wei H, Chen L et al. Adapting AlphaLISA high throughput screen to discover a novel small molecule inhibitor targeting protein arginine methyltransferase 5 in pancreatic and colorectal cancers. Oncotarget. 2017;8(25):39963-39977. DOI:10.18632/oncotarget.18102.
24. Ott CA, Baljinnyam B, Zakharov AV et al. Cell lysate based AlphaLISA deubiquitinase assay platform for identification of small molecule inhibitors. ACS Chem Biol. 2017;12(9):2399-2407. DOI: 10.1021/acschembio.7b00543.
25. Muneoka S, Nakamura R, Hoshino M et al. Development of a novel immunoassay to select antibodies against intact membrane antigens by using the homogeneous AlphaLISA system. JBiosciBioeng. 2018;126(4):522-526. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.04.018.
26. Yin H, Wang L, Liu HL. ENO1 Overexpression in Pancreatic Cancer Patients and Its Clinical and Diagnostic Significance. Gastroenterol Res Pract. 2018;2018:3842198. DOI: 10.1155/2018/3842198.
27. Yoshida Y, Hiwasa T, Machida T et al. Elevation of autoantibody in patients with ischemic stroke. Neurol Med Chir (Tokyo). 2018;58(7):303-310. DOI: 10.2176/nmc.ra.2018-0022.
28. Crans AJR, Wouters E, Valle-Leon M et al. Striatal Dopamine D2-muscarinic acetylcholine M1 receptor-receptor interaction in a model of movement disorders. Front Pharmacol. 2020;11:194. DOI: 10.3389/ fphar.2020.00194.
29. Nakahata S, Syahrul C, Nakatake A. Clinical significance of soluble CADH1 as a novel marker for adult T-cell leukemia/Lymphoma. Haematologica. 2021;106(2):532-542. DOI: 10.3324/haematol.2019.234096.
30. Xiong Y, Wu Y, Luo S et al. Development of a novel immunoassay to detect interactions with the transactivation domain of p53: application to
screening of new drugs. Sci Rep. 2017;7(1):9185. DOI: 10.1038/s41598-017-09574-7.
31. Hainaut P, Hollstein M. P53 and human cancer: the first ten thousand mutations. Adv Cancer Res. 2000;77:81-137. DOI: 10.1016/s0065-230x (08)60785-x.
32. Vousden KH, Prives C. Blinded by the light: the growing complexity of p53. Cell. 2009;137(3):413-431. DOI: 10.1016/j.cell.2009.04.037.
33. Bielefeld -Sevigny M. AlphaLISA immunoassay platform - the "no wash" high-through alternative to Elisa. Assay Drug Dev Technol. 2009;7(1):90-92. DOI: 10.1089/adt.2009.9996.
34. Беленичев ИФ. Фармакокинетический мониторинг лекарственных средств. Учебное пособие для магистров специальности: 224. Технологии медицинской диагностики и лечения и для студентов специальности 7.12020101 Фармация. Бухтиярова НВ, Павлов СВ, Рыжов АА, Рыженко ВП. Запорожье. 2018; 94 с. [Belenichev IF. Farmakokineticheskii monitoring lekarstvennykh sredstv. Uchebnoe posobie dlya magistrov spetsial'nosti: 224. Tekhnologii meditsinskoi diagnostiki i lecheniya i dlya studentov spetsial'nosti 7.12020101 Farmatsiya. Bukhtiyarova NV, Pavlov SV, Ryzhov AA, Ryzhenko VP Zaporozh'e; 2018. (In Russ).].
35. Morra L, Moser R. Alpha technology: a fast and sensitive orthogonal approach to cell-based potency assays. Perkin Elmer. Доступно по: https:// www.ibr-inc.com/fileadmin/Downloads/REAGENTS_AlphaLISA_ Bevacizumab_AppNote.pdf. Ссылка активна на 17.02.2021.
36. Yeung D, Ciotti S, Purushothama S et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub pg/mL levels of cytokines in human serum. J Immunol Methods. 2016;437:53-63.
37. Modi KN, Parikh PK, Sen DJ. AlphaLISA biomarker as a tool of drug discovery and development. Drug Dev & Res. 2011;3(2):64-74. Доступно по: https://www.ijddr.in/drug-development/alphalisa-biomarker-as-a-tool-of-drug-discovery-anddevelopment.pdf. Ссылка активна на 17.02.2021.
38. Carlstrom J, Wilchek T, Kwei A. Development of pharmacokinetic (PK) asssays for detecting biosimilars targeting TNFa using AlphaLISA. PerkinElmer. Доступно по: https://www.perkinelmer.com/labsolutions/ resources/docs/APP_AlphaLISA_Pharmacokinetic_TNFa.pdf. Ссылка активна на 17.02.2021.
39. Human CD80 AlphaLISA detection kit. Perkin Elmer, product №AL3055C/F. Доступно по: https://www.perkinelmer.com/product/ alphalisa-cd80-human-kit-100pts-al3055hv. Ссылка активна на 17.02.2021.
40. Wu Q, Lee HY, Wong PY et al. Development and applications of AlphaScreen - based FcRn binding assay to characterize monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;420:31-37. DOI: 10.1016/ j.jim.2015.03.012.
41. Leary BA, Lawrence-Henderson R, Mallozzi C et al. Bioanalytical platform comparison using a generic human IgG PK assay format. J Immunol Methods. 2013;397(1-2):28-36. DOI: 10.1016/j.jim.2013.08.009.
42. Human immunoglobulin G subclass 1(IgG1) (pharmacokinetic) kit, Perkin Elmer, product № AL303 C/F. Доступно по: https://www.perkinelmer. com/lab-solutions/resources/docs/TDS_AlphaLISA_AL303.pdf . Ссылка активна на 17.02.2021.
43. IFN-y(human) AlphaLISA Detection kit. Доступно по: https:// www.perkinelmer.com/product/alphalisa-ifn-gamma-kit-500-assay-pts-al217c. Ссылка активна на 17.02.2021.
