CC BY
11
С. И. НАСЛЕДЫШЕВА, П. И. ЭРУ и А. П. МИРОШНИКОВА (Харьков)
Применение мембранных фильтров для санитарного анализа воды'
Из микробиологического отдела Украинского центрального института коммунальной гигиены
Обычно применяемые методы определения coli-титра по способу Булира и Эйкмана уже давно вызывают возражения как теоретического, так и практического характера по поводу отдельных моментов методики. К недостаткам способа Булира и Эйкмана следует отнести: значительный, не менее 5 суток, промежуток времени, необходимый для производства анализа; большие количества питательных сред, которые все увеличиваются по мере повышения требований к питьевой воде; большая загрузка термостата; кроме того, при посевах в жидкие среды воды, содержащей различные микробы, всегда существует возможность конкуренции их видов, могущих в процессе жизнедеятельности препятствовать развитию и даже подавлять его у того или другого микробного вида, наконец, возражение вызывает и требование выращивать посевы при 46°, так как при этой температуре известный процент В. coli теплокровных не развивается.
Указанные недостатки уже вскоре после предложения метода Булира были отмечены рядом авторов, которые предлагали следующие модификации отдельных моментов метода:
1) для уменьшения объема засеваемого материала осаждать находящиеся в воде микроорганизмы химическими веществами с последующим посевом осадка на твердые диференциальные ^среды (Partis и др.);
2) непосредственные посевы на твердые среды небольших (до 10 'ам3) количеств исследуемой воды (Marmann);
3) изменение температуры выращивания посевов в жидкой среде (метод Vorcultur Nowork) и выращивание при 42—43,5° (Горовиц-Власова и др.).
Однако предложенные модификации до сих пор имеют ограниченное применение или по техническим соображениям (Partis, Marmann), или вследствие того, что ими не устраняются недостатки основного метода выращивания в жидких средах и возможность конкуренции отдельных микробных видов.
Большим шагом вперед в устранении ряда недостатков метода Булира является применение для санитарного анализа воды мембранных фильтров. Предложенные Zsigmoindi и Bachman в 1917—1918 гг. для химического анализа мембранные фильтры, приготовленные из растворенной в ацетоне целлюлозы, были применены в бактериологии Fiecker —1917 г., Megerind— 1922 г., Zsigmondi— 1924 г. искио-чительно с целью получения лишенных микробов фильтратов, токсинов или воды, причем совершенно не принимались во внимание задерживаемые на фильтрах микробы. Дианова и Ворошилова в 1932 г. предложили использовать мембранные фильтры для прямого У!чета задержанных на них бактерий. Изменив методику приготовления мембранных фильтров Zsigmoindi и Bachmann, они достигли возможности получения фильтров, задерживающих все микробы, находящиеся в воде; это крайне важно, так как приготовленные по оригинальному рецепту Zsigmondi и Bachmann фильтры проницаемы для бактерий, хотя и в незначительной степени (Разумов).
Барсов, применив мембранные фильтры для санитарного анализа воды (установления coli-титра, счета колоний), утверждает, что ре-
1 Доложено на научной конференции Украинского центрального института
коммунальной гигиены по санитарной охране источников водоснабжения 27.111
1935 г., Харьков.
ta
23
зультаты анализа одинаковы при параллельном проведении его на-фильтрах и по обычному методу (посев по Эйкману и счет колоний на агаре). Это подтверждают и Эпгер, и Вернике, предложившие выращивать бактерии, осевшие на фильтрах, на агаре Эндо с добавкой; 0,1% фенола (карбол Эндо), а не на обычном агаре Эндо.
Наша работа имела целью: 1) проверить пригодность применения мембранных фильтров для установления coli-титра не только в водопроводной, но и iß речной и колодезной воде и 2) изучить возможность применения для выращивания бактерий на фильтрах других диагностических сред — Либермана и Падлевского. Всего проведено 167 исследований, из них речной воды—117, колодезной — 38, водопроводной—12.
Для приготовления фильтров м'ы пользовались методикой Диановой и Ворошиловой. Ингредиенты брались в таких количествах: кинопленки — 7 см3, ацетона— 64 ом3, уксусно-этилового эфира — 36 см3, изо-амилового спирта — 48— 50 см3. Так как кинопленка не всегда имеет один и тот же состав, то перед массовым приготовлением фильтров необходимо на пробной порции установить требуемое количество изо-амилового спирта. В связи с непостоянством состава кинопленки колеблется и количество изо-амилового спирта (48 — 50 ам3). Для приготовления фильтров отработанная кинопленка намачивается в теплой воде в течение 20 — 30 минут. Вода не должна быть теплее 65°, иначе пленка мутнеет и плохо растворяется. После пребывания з теплой воде желатиновый слой пленки легко отделяется; после его отделения пленка промывается водопроводной, затем дестиллированной водой и высушивается в термостате. Для приготовления фильтров ;не следует пользоваться окрашенной (желтой, оранжевой и т. д.у пленкой.
Ацетон, изо-амиловый спирт и уксусно-этиловый эфир должны быть обезвожены перегонкой (ацетон перегоняется при 56°, изо-.амиловый спирт при 129— 130°, уксусно-этиловый эфир при 73—77°), так как при наличии воды в жидких ингредиентах фильтры получаются дырчатые. К отвешенной и помещенной в колбу с притертой или резиновой пробкой пленке добавляются необходимые количества сначала ацетона, затем уксусно-этилового эфира. Через 20 — 30 минут добавляется изо-ам'иловый спирт, после чего все тщательно омешивается и оставляется для окончательного растворения. Содержимое колбы время от времени встряхивается, в результате получается густая, похожая на глицерин масса; затем содержимое колбы фильтруется через воронку с ватой, смоченной ацетоном; чтобы избегнуть испарения, необходимо прикрыть воронку половиной чашки Петри. Полученный фильтрат оставляется до полного выделения пузырьков воздуха (иначе фильтры получатся дырчатые).
Масса для фильтров разливается на поверхность горизонтально установленной стеклянной чертежной доски, которую предварительно необходимо тщательно протереть тряпкой, смоченной ацетоном или эфиром для обезжиривания. Масса разливается градуированной пипеткой (10—20 см3), что позволяет, предварительно определив количество массы, необходимое для фильтра определенного размера, быстро произвести разливку и получить одинаковые по величине фильтры. При разливке для образования правильной формы фильтров пипетку нужно держать вертикально, прижав к поверхности стекла.
При высыхании фильтры превращаются в белые, похожие на бумагу кружки с матовой верхней и глянцевитой, обращенной к стеклу, поверхностями. Перед сниманием' верхнюю поверхность отмечают тушью, чтобы в дальнейшем легко, было отличить глянцевитую поверхность, что важно при последующих манипуляциях. Для облегчения снимания фильтров со стекла необходимо их обильно омочить дестиллированной водой. Снятые фильтры высушиваются на фильтровальной бумаге и хранятся в сухом или влажном состоянии. Стерилизуются фильтры дробно в сосуде с дестиллированной водой. Для определения coli-титра достаточно кипячения фильтров в закрытой чашке Коха, причем на достаточное пропитывание фильтров водой указывает погружение их «а дно сосуда. Недостаточно пропитанные водой фильтры плохо фильтруют, поэтому лучше их прокипятить накануне и хранить в воде, а на следующий день перед применением прокипятить еще >раз в течение 15 минут.
Каждая серия фильтров перед употреблением контролировалась. С этой целью через 2 — 3 фильтра данной серии пропускалась водопроводная вода с добавлением бульонной культуры В. coli. Фильтрат в большом количество засевался на среду Булира и простой агар. При стерильности посевов в течение 3 дней серия считалась пригодной. Для фильтрации 1мы пользовались (рис. 1) обычной колбой Бунзена, в которую вставлялась резиновая пробка с центральным отверстием, идущим по всей ее длине (рис. 2). Сверху пробки в соответствующее по размерам углубление накладывалась продырявленная фарфоровая
'пластинка (для тиглей Гуча), которая служит для поддерживания фильтра. На край фильтра накладывается плоское резиновое кольцо для более плотного соединения пробки с краем приемника для исследуемой воды. Под горлом колбы находится хомутик, к которому прикреплены резиновые тяжики. Эти тяжики после установки приемника для воды набрасываются на крючочки приемника и плотно прижимают его край к пробке, что обеспечивает правильную фильтрацию. Нижний край приемника должен быть хорошо отшлифован. Аппарат для фильтрации такого типа легко устроить в любой лаборатории. Мы работали и с фильтрами Зейца, но данный аппарат удобнее для закладывания и снимания фильтров.
Приемник стерилизуется или сухим1 жаром, или в 'автоклаве. Верхнее отверстие его предварительно закрывается ватной пробкой, весь приемник обертывается бумагой и в таком виде стерилизуется. Резиновые пробки и кольца, а также фарфоровые пластинки хранятся в • 70° спирте (так как при стерилизации
высокой температурой резина портится)
, _______________и перед употреблением обмываются
стерильным физиологически^! раствором ИаС1. Разрежается воздух в колбе при помощи водоструйного насоса, соединя-Щ емого с отводной трубкой колбы Бун-
зена или же отсасыванием ртом (2—3 вдыхания) через отводную трубку, после чего она зажимается зажимом. Для филь-\ к трации 100 см3 водопроводной воды необ-
Рис. 1
Рис. 2. 1—резиновая коль-цо-прокладка, 2—фарфоровая пластинка, ¿—резиновая пробка, 4—стеклянная трубка
ходимо 20 — 25 минут (диаметр фильтра около 4 см). При фильтрации воды другого происхождения, в особенности речной, фильтры быстро «устают» и начинают медленно фильтровать, поэтому в данном случае необходимо большое количество воды, например, 100 с!м3 фильтровать ® 3—4 ¡приема, сменяя фильтры. ^¡.цтотН, наблюдавший быстрое утомление фильтров при пропускании речной воды, объясняет это явление наличием в данной воде каких-то слизеобразных веществ, являющихся, повидим'ому, продуктам жизнедеятельности, а возможно и распада обитающих в воде растений и животных.
Для производства фильтрации, собирая аппарат, необходимо уложить фильтр глянцевитой поверхностью кверху (для .отличия поверхностей служит метка тушью), так как эта поверхность более ровна и поэтому на ней распределение микробов более равномерно.
Приготовив для определения соН-титра соответствующие разведения исследуемой воды, мы начинаем' фильтрацию с высших разведений, меняя фильтры. Этим достигается экономия в прие(мниках и пробках и ускоряется процедура фильтрования. Снятые фильтры укладываются на чашку Петри с агаром Эндо, опять-таки глянцевитой стороной кверху. При диам'етре фильтра около 4 см на обычную чашку Петри укладывается 3 фильтра. После укладки необходимо на нижней поверхности чашки под уложенным фильтром сделать отметку разведения воды, профильтрованной через данный фильтр.
Все 167 исследований проводились параллельно на фильтрах и на среде Булира. Учет колонии и соИ-титра на фильтрах производился
через 24 часа при 37°. Выделенные колонии, морфологически сходные с В. coli, идентифицировались.
Из общего числа 167 исследований проведены параллельно исследования на среде Булира при 46° и на фильтрах при 37°, на карбол Эндо — 138; результаты совпали в 128 случаях, или 92,8%. Титр выше по Булиру в 9 случаях, или 6,5%; титр выше на фильтрах в I случае, или 0,7%.
Из сказанного видно, что процент совпадений титров при исследовании по методу Булира и на фильтрах на карбол Эндо очень высок—■ 92,8; отставание титра на 1 знак на фильтрах мы получили в речных и колодезных водах в 6,5%. Титр выше на фильтрах в 1 случае—0,7%. Возможно, что при большем количестве исследований разница в цифрах сгладилась бы, так как при высоких разведениях у нас нет никогда гарантии в том, что в последнее разведение попадает обязательно какое-то количество В. coli.
При проведении параллельных исследований по методу Булира и на фильтрах при 46% на карбол Эндо процент совпадения 76,6, титр выше по методу Булира в 7 случаях, или 23,4%, что, конечно, не является неожиданным, так как заранее можно было предполагать, что на твердой среде при 46° условия существования В. coli будут гораздо хуже вследствие более быстрого высыхания среды и угнетающего действия высокой температуры.
Применение других диференциальных сред для выращивания В. coli на фильтрах дало такие результаты: при выращивании1 по методу Булира при 46° и на фильтрах на среде Падлевского при 37°, по данным 40 исследований, титры совпадали в 30 случаях, титр выше по методу Булира в 6 случаях, титр выше на фильтрах в 4 случаях.
При выращивании по методу Булира при 46° и на фильтрах на среде Либермана при 37°, по данным 57 исследований, титры совпадали в 28 случаях, титрьг выше по методу Булира в 21 случае, титр выше на фильтрах в 8 случаях.
Таким образом, наиболее подходящей средой для выращивания В. coli ,на фильтрах является карбол Эндо, так как на этой среде мы получили наиболее высокий процент совпадения титров — 92,8%, в то время как на среде Падлевского это совпадение титра равно 75%, а на среде Либермана только 49%.
Надо еще отметить, что колонии В. coli на среде Падлевского в 100% были нетипичны, бледно окрашены, без характерного блеска; такие же бледно окрашенные, без характерного блеска колонии мы получали при выращивании В. coli на карбол Эндо при 46°, в то-время как параллельные посевы на карбол Эндо при 37° были типичны.
Отмечаем, что в работе зимнего периода с колодезными и речными водами на карбол Эндо даже при 37° мы имели около 20% колоний без блеска при росте в 24 часа; в теплый период процент таких колоний был в 2,5—3. раза меньше. Повидимому, повышение процента нетипичных (в 1 сутки на карбол Эндо) колоний можно объяснить ослаблением В. coli пребыванием в воде при низкой температуре. Наблюдая такие колонии в течение 2—5 дней, мы видели в этот промежутрк времени появление типичного блеска у большинства их.
Принимая во внимание несложность техники приготовления и употребления мембранных фильтров, возможность дачи более быстрого, чем при методе Булира и в то же время достаточно точного-ответа о санитарном состоянии того или другого источника водоснабжения, мы должны признать этот метод практически пригодным. Давая громадную экономию питательных сред, он может быть про-
веден при 37 , что крайне важно для ряда периферийных лабораторий^ Исходя из практической важности применения этого метода, необходимо поставить широкую проверку санитарного анализа воды в ряде лабораторий параллельно по методу Булира и с применением мембранных фильтров, что даст возможность на большом материале подтвердить пригодность этого метода для данной цели. Для гарантии качества фильтров необходимо сосредоточить их производство в крупном центре под контролем научно-исследовательского института. Мы думаем, что данный метод определения соИ-титра должен найти широкое применение в произвЪдстве других санитарных анализов —• молока, фруктовых вод, кваса, пива и т. д.
Когда работа была приготовлена для печати, мы ознакомились о работами Михайловой и Невской, подтверждающими очень хорошие результаты, полученные при применении мембранных фильтров для санитарного анализа воды при одновременно проведенных контрольных исследованиях по обычному методу.
Проф. С. В. МОИСЕЕВ (Ленинград
Очистка питьевой воды от фтора
Из Научно-исследовательской лаборатории коммунальной гигиены ленгорздра,ва и кафедры общей и экспериментальной гигиены II Ленинградского медицинского
института
В специальной литературе имеется достаточно указаний на очень частое нахождение фторсодержащих соединений в источниках водоснабжения и на предельно допустимое количественное содержание фтора в питьевой воде (не свыше 0,5 мг в 1 л). Между тем нередко содержание фтора в питьевой воде иногда значительно превосходит указанное допустимое предельное количество. В США особенно широко изучалось количественное содержание фтора в источниках водоснабжения в связи с выявлением многих местностей, эндемически пораженных пятнистостью зубной эмали. В Боксите в штате Арканзас и в Оаклеу в штате Идахо энергично искали новые источники водоснабжения, содержащие фтористые соединения не свыше допустимого предела (по американским нормам 0,7^0,8 мг в 1 л). Но это далеко не всегда удавалось. Совершенно очевидно, насколько важно с точки зрения гигиены и санитарной техники правильное разрешение проблемы очистки питьевой воды от фтора.
В своей работе в 1935 г. я уже сообщил в общих чертах результаты экспериментальных исследований, произведенных в этом направлении в СССР и за границей до октября 1935 г. Таких исследований было произведено, к сожалению, очень мало и они до сих пор не дали существенно положительных результатов для практического разрешения этой сравнительно новой проблемы водоснабжения.
Краткую сводку об экспериментальных исследованиях по этому вопросу приводит Н. V. Smith. Он поставил опыт по проверке сообщения A. Carnot о возможности удалять фтор из воды при помощи костей. Оказалось, что 67,5 мг. кестей снизили в 1 л воды содержимое фтора от 2,5 мг до 1,7 |мг.
Willes установил, что в гористой местности Колорадо-Спрингс концентрация фтора зимой в источниках водоснабжения меньше, чем летом. Это побудило Н. V. Smith поставить опыты по использованию замораживания воды для уменьшения в ней фтора. Для этого вода, содержащая 3,4 мг фтора на 1 л, была искусственно заморожена. Исследования образовавшегося куска льда по способу J. М. Sanchis локазали, что в наружной части льда было 0,7 мг фтора на 1 л, в средней части —4,0 и 6,0 мг, а во внутренней части льда —0,4 мг фтора на
