CC BY
69
В.И. Казей1, К.В. Балакин1, С.Е. Ткаченко2
ОТКРЫТИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ PI3K СИГНАЛЬНЫХ КАСКАДОВ: НОВЫЕ ТЕНДЕНЦИИ В РАЗРАБОТКЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ
1ЦВТХИМРАР, го Химки 2ChemDiv, Inc., США
В рамках оригинальной концепции «химическое разнообразие с точки зрения биологического эффекта» в компании КемДив разработан ряд фокусированных библиотек химических соединений, предназначенных для эффективного первичного поиска низкомолекулярных модуляторов специфических мишеней или клеточных каскадов. В настоящей презентации представлены результаты скрининга библиотеки соединений (5000 соединений/650 структурных хемотипов), «ортогонально» аннотированной по отношению к ряду мишеней. Аннотация включала в себя как «традиционные» (киназы, рецепторы, сопряженные с G-белками, ядерные рецепторы, ионные каналы и протеазы), так и «специальные» биологические мишени (сигнальные каскады и модуляторы динамики микротубулярных белков). С использованием концепции Focused Diversity™ удалось идентифицировать серии эффективных ингибиторов киназы PI3Ka специфического и двойного действия. Были получены два структурных хемотипа с высокой патентоспособностью, в ряду которых были обнаружены эффективные ингибиторы в клеточных и ферментных тестах (100-2000 нМ), с функциональной активность в диапазоне 4-5 нМ при ингибировании киназы _pAkt (ELISA). Селективность этих агентов по отношению к различным киназам составила: PI3KP > 50х; PI3K5, PI3Ky> 10х; PKA и 20 других киназ > 100х. Были также получены важные экспериментальные in vivo показатели, относящиеся к фармакокинетике, токсичности, эффективности по отношению к клеточным линиям рака прямой кишки и опухолей груди.
Е.Л. Водовозова, Е.В. Моисеева, Г.П. Гаенко, Н.В. Бовин, Ю.Г. Молотковский
ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ В ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМАХ - МЕТОД УСИЛЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА ЛЕКАРСТВ
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Введение
Применяемые сегодня в клинике химиотерапевтические препараты обладают высокой общей токсичностью, что существенно ограничивает эффективность лечения онкологических больных. Включение лекарства в состав носителей-наночастиц, в том числе липосом, позволяет уменьшить его токсическое действие на организм в целом, в первую очередь, за счет уменьшения концентрации свободного препарата в кровотоке [1,2]. Кроме того, липосомы диаметра не более 100-150 нм способны накапливаться в опухолях и очагах воспаления благодаря эффекту пассивного транспорта, связанному с повышенной проницаемостью дефектных стенок капилляров [3,4]. Интерес к липосомам как системам доставки лекарств в последние годы возрос в связи с разработкой методов полу-
чения частиц, защищенных от опсонизации и преждевременного вывода из кровотока клетками ретикуло-эндотелиальной системы. Это достигается с помощью экранирования поверхности липосомы высокогидрофильными остатками полиэтиленгликоля (ПЭГ), которые ковалентно связаны с молекулами липидов, составляющих мембрану [5]. В результате получаются так называемые Б1еакЬ®-липосомы, то есть липосо-мы, невидимые для клеток иммунной системы. Показано улучшение лечебного эффекта некоторых противоопухолевых антибиотиков, включенных в водный объем Б1еакЬ®-липосом [6]. К применению в клиниках США и стран ЕС допущен ряд препаратов; в производстве их используется метод активной загрузки (против градиента концентрации сульфата аммония) внутрь готовых липосом лекарств, имеющих катион-
ную липофильную структуру молекулы. Такая технология пригодна только для ограниченного числа лекарств, например, антрациклиновых антибиотиков. В первую очередь, это доксорубицин, на основе которого производится препарат Doxil® [6]. Альтернативный лабораторный способ - формирование липосом в водно-солевом растворе препарата с последующим отделением от невключившегося лекарства - нетехнологичен.
Мы предлагаем встраивать в липидный бислой липосом биодеградируемые липидные конъюгаты (липидные пролекарства, lipophilic prodrugs) широко применяемых в клинике препаратов [7,8], как правило, водорастворимых низкомолекулярных веществ, которые сами по себе удерживаться в мембране не могут. Включение пролекарств в мембрану липосом упрощает и делает универсальной технологию их приготовления. После вхождения в клетку липофиль-ный остаток отщепляется внутриклеточными ферментами, высвобождая активный агент. Доставка цито-токсических препаратов в опухолевые клетки в виде липидных производных в составе липидного бислоя липосом дает ряд преимуществ: уменьшаются потери лекарства в кровотоке и при взаимодействии липосо-мы с клеткой; липидные производные способны к прямому трансмембранному переносу, который может кардинально изменить механизм эндоцитоза и внутриклеточного трафика препарата и облегчить разгрузку липосом. Для ускорения высвобождения лекарства из внутреннего объема Stealth®-липосом после их попадания в эндосомы клетки-мишени разработаны специальные молекулярные триггеры, например, пептидные [9]. Показано, что липидные произ-
водные ряда лекарств (Ага-С, фторурацила, цисплати-на и др.), примененные в мицеллярной форме, обладают улучшенной фармакокинетикой [10]. Однако мицеллы безусловно проигрывают липосомам по таким параметрам как стабильность и фармакокинетика. Получен целый ряд К-ацильных и К-алкильных производных Ага-С [11-13], 5-фторуридина [14] и гемци-табина [15], которые в липосомальных формах превзошли по фармакокинетическим и противоопухолевым свойствам исходные препараты.
Липофильные производные противоопухолевых препаратов
Мы синтезировали диглицеридные конъюгаты сарколизина, или D,L-мелфалана [7] (Mгph-DG), мел-фалана (Mlph-DG), метотрексата (MTX-DG) [16,17] и рубомицина [8] на основе природного или синтетического гас-1,2-диолеоилглицерина (Рис.1). Конъюгаты предназначены для встраивания в липидный бислой липосом. Отметим, что только небольшая молекула типа сарколизина может надежно удерживаться в мембране липосомы с помощью моноалкильного липидного якоря. При разработке молекулярных структур было учтено, что связь между остатком лекарства и остальной частью молекулы должна легко гидролизоваться внутри клетки-мишени. Поскольку эстеразы менее специфичны, чем пептидазы, предпочтительна сложноэфирная связь, а не амидная.
Мелфалан и его рацемат сарколизин — цитоток-сические агенты алкилирующего типа, обладающие широким спектром противоопухолевого действия. Низкая стабильность при физиологических значениях рН и быстрое выведение из кровотока обуславливают
Нерфалан ( Mrph f синонимы: саркояизинг DfL-мелфаланг Д/-алкеран)
Н. лт. ЦН, in vitro
^-ОчЛсоо ™ т „го
Mrph-DG
— в _
с
т vitro in vivo
9 9й но?
Рубомииин М®°
да
‘uU
Jnvttn
Чз
Рис. 1.
необходимость введения высоких концентраций этих агентов, что сопровождается множеством побочных эффектов. Описаны 1,3-дипальмитоилглицеридное [18] и 1,2-димиристоиглицеридное [19] производные мелфалана (L-сарколизина); в мицеллярной форме они показали пролонгированное действие и меньшую токсичность in vivo.
Цитостатик метотрексат (МТХ, антиметаболит фолиевой кислоты) широко используется в клинике для лечения опухолей и аутоиммунных патологий, таких как ревматоидный артрит, где по сей день он остается «лекарством номер один» [20]. В настоящее время интенсивно исследуются возможности улучшения биораспределения МТХ за счет применения наноносителей лекарств, в том числе конъюгатов МТХ с полиамидными дендримерами [21], декстра-ном [22], желатином [23]. Эффективность лечения МТХ ограничивается не только его системной токсичностью, но и частым развитием клеточной устойчивости (например, при острой лимфобластной лейкемии - до 30% случаев [24]), связанной, главным образом, с нарушением транспорта в клетку за счет мутаций и понижения активности белка, переносящего в клетку восстановленный фолат и аналоги-антифолаты (reduced folate carrier, RFC) [20]. Пассивный трансмембранный перенос молекулы МТХ затруднен. Поэтому предложен целый ряд липо-фильных антифолатов, лишенных глутаматного остатка, которые способны диффундировать в клетку, минуя активный транспорт ([25] и цит. лит.); некоторые из этих препаратов нашли применение в клинике. Другой подход - липофильная модификация глу-таматных карбоксилов МТХ, позволяющая сохранить сродство к ферменту-мишени дигидрофолатре-дуктазе: в мицеллярных формах алифатические сложные эфиры [26] и амиды липоаминокислот [27] MTX были активны в культуре клеток лейкемии CEM/MTX, резистентных к МТХ из-за дефектного RFC. Описан конъюгат МТХ с фосфатидилэтанола-мином (амидная связь по y-СООН), который в липо-сомальной форме эффективно ингибировал колла-ген-индуцированный артрит in vitro и in vivo [28].
Нами разработан синтез липофильного сложноэфирного производного МТХ по y-СООН (МТХ-DG) [16,17]. Объемистый остаток МТХ отделен от дигли-церидного якоря короткой полярной вставкой, которая в липидном бислое располагается в зоне полярных головок фосфолипидов, что позволяет меньше нарушать упаковку бислоя и включать в липосомы больше лекарства. В составе липосом МТХ-DG обнаружил цитотоксическую активность (в культуре клеток меланомы М3) [17]; очевидно, он высвобождает МТХ за счет гидролиза внутриклеточными эстеразами, являясь пролекарством, либо непосредственно ингибирует дигидрофолатредуктазу.
Углеводные лиганды как молекулярные адреса для доставки липосом
Активный транспорт лекарств в опухоли достигается при включении в состав липосом молекулярных адресов, обладающих повышенным сродством к клеткам опухолевой ткани. Исследования проводятся по нескольким направлениям, в том числе: прививка на окончания ПЭГ-цепей на поверхности липосом фрагментов молекул гуманизированных моноклональных антител, которые селективно связываются с интернализуемыми рецепторами на опухолевых клетках, т.е. получение иммунолипосом; оснащение липосом остатком фолата и пр. [9]. Один из подходов основан на явлении повышенной экспрессии лектинов (специфических углевод-связывающих белков) на поверхности клеток опухолей [29]. Исследования по адресной доставке лекарств с помощью полимерных или липосомальных носителей, оснащенных углеводными лигандами (обзор [30]), связаны, в основном, с транспортом в опухолевые клетки печени: хорошо изученные галактозо- и маннозоспеци-фические лектины гепатоцитов и купферовских клеток использованы как мишени для доставки in vivo лекарств и генов, заключенных в соответствующие адресные липосомы [31,32]. В качестве углеводных лигандов в мембрану липосом встраивали конъюгаты галактозы с аналогом холестерина [31] и холесте-рильные производные тиогалактозидов с полярными вставками (спейсерами) различной длины [32]. Исследуется ингибирование адгезии опухолевых клеток к сосудистому эндотелию (первый этап при метаста-зировании) с помощью липосом, несущих на своей поверхности тетрасахарид Sialyl Lewis X [33]. Возможная иммуногенность липосом, оснащенных низкомолекулярными лигандами, не подтверждается: липосомы, несущие липофильные конъюгаты манно-зил-пептидов вызывали иммунный ответ in vivo только в присутствии адъюванта [34].
Оригинальность наших разработок состоит в том, что адресами липосом служат самые разнообразные углеводные структуры. Специфичность лектинов опухолей определяется путем скрининга связывания клеток с широким набором углеводных флуоресцентных зондов, представляющих собой конъюгаты на основе полиакриламида. Гибкая полимерная цепь позволяет углеводным остаткам подстраиваться для взаимодействия с множественными копиями лектинов на поверхности опухолевой клетки. Такие многоточечные, иначе называемые поливалентные, контакты необходимы для осуществления эффективного углевод-белкового взаимодействия. Нами проведены экспресс-анализы специфичности лектинов ряда опухолей человека и мыши: аденокарциномы легких человека и промиелоидных клеток HL-60 [35], мышиной карциномы молочной железы [36], меланомы М3 [37]. Связывание зондов in vitro с клетками указанных опухолей в культурах оценивали, в основном, с помощью флуоресцентной микроскопии на качественном уровне, что более доступно при скрининге; иногда использовали цитофлуориметрию. Углеводные специфичности этих опухолевых клеток различны.
Конструирование адресных лекарственных липосом
Липосома является идеальным носителем углеводных лигандов, так как за счет латеральной диффузии в плоскости ее мембраны происходит концентрирование молекул гликоконъюгатов в зоне контакта с рецептором на поверхности клетки-мишени. Связывание с рецептором обеспечивается за счет экспонирования углеводных детерминант на достаточном расстоянии от мембраны с помощью полярных гибких вставок ПЭГ в молекуле гликоконъюгата между ли-пофильным мембранным якорем и остатком углевода [38]. Показано in vitro, что при увеличении длины ПЭГ-вставки между остатком маннозы и алкильным мембранным якорем от 1 до 8 оксиэтильных звеньев интенсивность фагоцитоза купферовскими клетками липосом, оснащенных алкил-ПЭГ-маннозильным конъюгатом, резко возрастает [39]. В то же время, при дальнейшем наращивании остатка ПЭГ возрастает вероятность его изгиба в направлении поверхности липосомы [40]. Нами разработан оригинальный метод получения липофильных гликоконъюгатов: после выявления активных детерминант флуоресцентным зондированием, конъюгаты для встраивания в липосомы синтезируются на основе широкого набора аминопро-пилгликозидов и модифицированного коммерческого детергента Луброла РХ, представляющего собой простой эфир С18-алкила и остатка ПЭГ степени полимеризации 9-10 [8].
Основу липидного бислоя липосом составляют фосфолипиды, выделенные из природных источников — фосфатидилхолин из яичного желтка и фосфатидилино-зит из пекарских дрожжей. Известно, что полярные группы фосфатидилинозита, введенного в состав мембраны в достаточном количестве (не менее 10 мол %), подобно ПЭГ-цепям создают высокогидратированную оболочку на поверхности липосомы и таким образом защищают ее от опсонизации и преждевременного вывода из кровотока клетками РЭС [41,42]. Мы полагаем, что такие липосомы не будут вызывать нежелательные побочные эффекты, в первую очередь, гиперемию, аллергические реакции, мукозит, которые сопутствуют применению StealthS-липосом, несущих остатки ПЭГ-2000 (степень полимеризации 45-48) [43-45].
Метод получения липосом экструзией через поли-карбонатные мембранные фильтры с калиброванными порами [46] — один из самых технологичных, именно он используется при производстве Stealth®-липосом. Гидратированная в забуференном физрастворе липидная пленка, приготовленная из смеси всех компонентов, подвергается 5-6 циклам замораживания (жидкий азот) — оттаивания (выше температуры фазового перехода липидного бислоя), а затем суспензия многократно (10-20 раз) продавливается через фильтры с порами диаметром 100 нм. При этом образуются готовые к использованию моноламеллярные (с единичным липидным бислоем) липосомы требуемого размера, несущие пролекарство (10 мол. %) и углеводный лиганд (2 мол. %). Дисперсии липосом содержат реле-
вантные для внутривенного введения животным концентрации лекарственного начала (~4 мМ).
Липидный бислой Stealth®-липосом формируется из фосфолипидов, содержащих насыщенные ацильные остатки (обычно дистеароилфосфатидилхолин или гидрогенизированный соевый лецитин), и холестерина (до 30%) с целью получения жестких мембран, которые меньше подвержены разрушению в кровотоке и утечке препарата из внутреннего объема [4-6]. Поэтому в ходе экструзии и активной загрузки лекарства (доксорубицина) образцы нагревают до 60оС. В нашем случае липидные конъюгаты лекарств и углеводов сами являются компонентами мембраны и даже при ее повреждении не покидают липосому. Легкоплавкий (с низкой температурой фазового перехода) липидный бислой способен включить больше амфифильных молекул, не-компонентов матрицы бислоя. Кроме того, мембраны опухолевых клеток легче сливаются с жидкими липидными бислоями
[47]. Поэтому основой наших липосом служат фосфолипиды, содержащие примерно половину насыщенных ацильных остатков (в основном, пальмитоильных и стеароильных), а остальные - ненасыщенные олео-ильные и немного линолеоильных. Для приготовления малых объемов (< 1 мл) дисперсий липосомаль-ных препаратов мы используем мини-экструдер Avanti (Канада). При проведении испытаний на животных, образцы препаратов (до 10 мл) удобно получать на установке фирмы Lipex (Канада), проводя экструзию под давлением азота (до 50 атм).
Электронные микрофотографии поверхностей скола лекарственных липосом, полученные через сутки после приготовления дисперсий, показывают, что частицы представляют собой моноламеллярные (то есть с одним липидным бислоем) везикулы размером 50-100 нм (Рис. 2).
Взаимодействие адресных липосом с опухолевыми клетками in vitro
Нами в опытах in vitro показано, что цитотоксиче-ская активность адресных липосом с диглицеридными конъюгатами сарколизина и метотрексата примерно в 2-4 раза выше, чем лекарственных липосом без углеводных лигандов [35,17]. Так, для клеток меланомы М3 в среде, содержащей липосомы с МТХ-DG и неактивным контрольным пентаолом, выживаемость выше, чем в случае лекарственных липосом, оснащенных А-трисахаридом (Atri) или тетрасахаридом Sialyl Lewis X (SiaLeX): значения IC50 для контрольных, Atri-и SiaLeX-липосом составили 1.2±0.4, 0.8±0.2 и 0.4±0.1 мкМ, соответственно (цитотоксическую активность определяли стандартным для антифолатов тестом с трипановым синим [25-27]).
Механизм внутриклеточного транспорта и метаболизма липофильных пролекарств нами пока не изучен. Вероятнее всего, сначала эстеразы отщепляют диглицеридные остатки и только после этого лекарства осуществляют свое специфическое цитотоксиче-ское действие, что вносит вклад в увеличение зна-
А, а — липосомы с МТХ-DG Б, б — липосомы с Mrph-DG
Рис.2. Электронные микрофотографии реплик с поверхностей скола замороженных дисперсий лекарственных липосом (1тее/е-1тас1иге)
чения IC50 для МТХ-DG в липосомальных формах, по сравнению с исходным лекарством (для МТХ IC50 ~
0.08 мкМ). В экспериментах in vitro значительное ослабление цитотоксичности препаратов при включении их в разнообразные наночастицы связано как с изменением механизма эндоцитоза, так и с необходимостью разгрузки носителя внутри клетки. При системном введении в организм включается множество других факторов, влияющих на экспозицию опухолевых клеток для действия лекарств. Среди них принципиально важными являются время циркуляции в кровотоке и возможность накопления в опухолевой ткани.
Внутриклеточный транспорт и метаболизм лекарства зависят от механизма эндоцитоза носителя. По данным конфокальной микроспектрофлуориметрии (confocal spectral imaging technique), эндоцитоз адресных липосом происходит примерно в 1.5 раза быстрее, чем контрольных [37].
Через 30 мин инкубации клеток меланомы М3 с ли-посомами, меченными по липидному бислою флуоресцентным фосфолипидным зондом, в случае контрольных липосом метка распределена, в основном, в мембране и прилегающей к ней части цитоплазмы, а в случае адресных она проникает в цитоплазму и околоядерное пространство существенно сильнее. Видна диффузная флуоресценция. Возможно, адресные липосомы попадают в клетку за счет так называемого адсорбционного эндоци-тоза, когда сродство обеспечивается множественными взаимодействиями с лектинами. При этом молекулы связанных везикул становятся компонентами плазматической мембраны и подвергаются метаболизму как ее часть. Обычно неспециализированные клетки каждый час ин-тернализуют эквивалент собственной поверхности. Мы полагаем, что наши адресные липосомы минуют эндосо-малитический путь интернализации, и проблема внутриклеточной разгрузки отсутствует.
Испытания противоопухолевой активности адресных липосом
Таким образом, в экспериментах in vitro при оснащение лекарственных липосом углеводными адресами наблюдались умеренные эффекты усиления ци-
тотоксической активности. При этом существенное улучшение противоопухолевого действия показано на нескольких моделях экспериментальных животных. Пока нами не выяснено, действуют ли адресные липо-сомы непосредственно на злокачественные клетки или влияют на какие-то другие компоненты опухолевой ткани. Приведем кратко результаты испытаний противоопухолевой активности in vivo.
Лейкоз Р-388. При лечении мышей с экспериментальным лейкозом Р-388 липосомами, несущими диг-лицеридный конъюгат сарколизина (DG-Mrph), увеличение продолжительность жизни (УПЖ) по сравнению с применением интактного сарколизина состави-
Рис. 3. Взаимодействие липосом с опухолевыми клетками in vitro:
Распределение флюоресценции родамина в клетках меланомы М3 после 30-мин инкубации с контрольными (a), A-трисахаридными (b), или SiaLeX-липосомами (c).
ла 1.4 раза; добавление в липосомы углеводных лигандов увеличило этот показатель до значений 1.9 (альфа^-фукоза) и 2.2 (бета-№ацетилгалактозамин)
[48]. Мышам BDF1 (n = 6 в каждой группе) через 48 ч после трансплантации клеток лейкоза и повторно через 72 ч вводили внутрибрюшинно тестируемые вещества в дозах (в пересчете на сарколизин) 7.0 (~1 мл), 3.5 и 0.7 мг/кг. Контрольные животные получали по 1 мл забуференного фосфатами физраствора (PBS, рН 7.0).
Экспериментальный рак молочных желез. В
качестве модели рака молочных желез нами были использованы мыши линии BLRB-Rb(8.17)1Iem, характеризующейся высокой частотой (более 95%) спонтанного возникновения опухоли молочных желез с последующим неизбежным метастазированием в легкие. Были сконструированы липосомы, нагруженные октадецильным производным мерфалана и несущие липофильный конъюгат тетрасахарида SiaLeX [36].
Для первичных испытаний препаратов спонтанные опухоли не подходят вследствие крайней неоднородности материала (многопараметровые различия между самками-реципиентами). Регулярно перевиваемые стандартные опухолевые штаммы мало отражают реалии ракового процесса, возникшего естественным путем (высокая скорость роста и неадекватность кровоснабжения). Рациональной является модель первой перевивки опухолевых клеток из быстрорастущей спонтанной мышиной карциномы молочных желез самки BLRB самцам BLRB. Это дает возможность зафиксировать минимальное влияние исследуемого препарата, как на процесс проявления пальпируемых опухолевых узелков, так и на последующий рост видимых глазом опухолей. Для перевивки были использованы реципиенты-самцы линии BLRB в возрасте 4.5+0.5 мес. У самок в возрасте 4-6 месяцев могут спонтанно возникать карциномы, которые трудно отличить от перевитых опухолей.
Оценивали влияние препаратов на рост карциномы молочных желез и продолжительность жизни мышей (n = 10 в каждой группе) после i.v. введения в хвостовую вену в дозе (в пересчете на интактный сар-колизин) 7.0 мг/кг на 3-й и повторно на 7-й день после подкожной инокуляции клеток карциномы. Контрольные животные получали по 0.5 мл PBS вместо сарколизина или липосомальных препаратов. Эффективность подавления роста опухоли резко возрастала при включении производного мерфалана в липосомы, оснащенные SiaLeX .
Лечебный эффект адресных липосом ярко виден на графике динамики выживания (Рис.4). Мыши, получавшие пустые липосомы или оснащенные SiaLeX, жили примерно столько же, сколько и контрольные (черная линия). Небольшое увеличение выживания показал интактный мерфалан (красная линия). Лекарственные липосомы без SiaLeX дали существенное улучшение выживания (голубая линия), но самыми эффективными оказались адресные липосомы (зеленая линия) [36].
Рис. 4. Динамика роста среднего размера опухоли у мышей линии BLRB-Rb(8.17)1Iem с имплантированной карциномой молочных желез в различных экспериментальных группах
Спонтанный рак молочных желез. Нами проведены испытания противоопухолевой активности ли-посомальных препаратов диглицеридного производного мерфалана (Mrph-DG) на мышах BLRB со спонтанными карциномами молочной железы. Липосомы нагружали Mrph-DG и использовали SiaLeX -конъюгаты, имеющие различные мембранные якори: одноцепочечный (Conjugate I) и новый, диглицерид-ный (Conjugate II), который надежнее удерживает конъюгат в мембране (Рис. 5).
При создании базы данных по росту спонтанных опухолей и выживанию самок BLRB (116 особей) было установлено, что животных можно разделить минимум на две категории: I - с быстрорастущими опухолями, ~72 % популяции, диаметр опухоли ~20 мм перед смертью, средняя продолжительность жизни 53+3 дня; II - с медленнорастущими опухолями, ~28 % популяции, опухоли сохраняют диаметр не более 4-5 мм в течение 2-х недель и более (лаг-период) с последующим скачкообразным ускорением роста, но меньшим конечным размером в сравнении с опухолями I группы, средняя продолжительность жизни 77±5 дней.
Поскольку не представлялось возможным готовить и вводить липосомальные препараты отдельно для каждой особи после определения, к какой категории она относится, для адекватной интерпретации данных в экспериментальных группах оба изучаемых параметра (динамика роста опухоли и продолжительность жизни для каждой особи) отсчитывались от момента визуального обнаружения, когда опухоль достигала 4-5 мм. В этот день начиналось лечение: препараты (по 0.2 мл, 7 мг/кг по мерфалану) вводили в хвостовую вену 2 раза с интервалом в 3 дня.
Анализ кривых среднего роста опухолей с 3-й по 5-ю неделю после их визуального обнаружения показал, что лучше всего замедляли рост опухолей лекарственные липосомы с одноцепочечным SiaLeX-
Рис. 5. Структуры SiaLeX-конъюгатов (I) и (II), и липидного производного мерфалана
конъюгатом (8 самок). Возможно, такой результат обусловлен большей стабильностью данного гликоконъюгата (Conjugate I) in vivo, так как простая эфирная связь между мембранным якорем и остальной частью молекулы не подвержена гидролизу.
В группе 3 наблюдалось также улучшение выживаемости на отдаленных сроках: к 20 неделе эксперимента выжило большее число животных. Отметим, что мыши, получавшие интактный мерфалан выживали существенно хуже и на более ранних сроках, возможно, из-за большей токсичности свободного лекарства.
Вскрытие особей с долгим выживанием выявило следующие закономерности: 1) в контроле количество видимых опухолевых узелков в легких возрастало по мере увеличения продолжительности жизни; 2) у животных, леченных липосомами с конъюгатами SiaLeX, легкие практически не содержали видимых опухолевых узелков. Можно предположить, что улучшение выживания в этих случаях вызвано не только и не столько отторжением первичной опухоли, сколько предупреждением метастазирования.
Т-лимфолейкоз. Недавно нами проведена первая серия испытаний противоопухолевых свойств липо-сом, нагруженных МТХ-DG, на перевиваемой модели Т-лимфолейкоза мышей A/Sn. Для получения адресных липосом вновь был использован лиганд SiaLeX (в виде одноцепочечного липофильного конъюгата I). Этот углевод является лигандом селектинов, семейства лектинов, которые повышенно экспрессируются на поверхности лейкоцитов и клеток эндотелия в ходе ангиогенеза в опухолях. Высокое сродство к SiaLeX проявляют селектины всех трех типов: Е- (экспрессирован на эндотелиальных клетках), L- (на лейкоцитах) и Р- (на тромбоцитах). Наличие селектинов на поверхности клеток лимфомы было подтверждено с помощью цитофлуориметрии. Противоопухолевый эф-
фект оценивали по ингибированию роста опухоли и увеличению продолжительности жизни (УПЖ) реципиентов с подкожной лимфомой и системным лейкозом. Препараты вводили i.v. в хвостовую вену на 3, 5, 10 и 12 сутки после подкожной перевивки опухоли. Во всех леченных группах наблюдалось достоверное ингибирование подкожного роста опухоли.
По сравнению с нелеченной контрольной группой (п = 3) лечение метотрексатом (п = 5) дало УПЖ на 23%, липосомами с MTX-DG (п = 6) - на 29%, а адресными липосомами с MTX-DG (п=6) - на 43 %, причем все различия достоверны. Таким образом, лечение мышей МТХ-липосомами уже показало УПЖ на 6% по сравнению с интактным метотрексатом, а при лечении адресными липосомами этот показатель увеличился до 17%. Интересно отметить, что лечение адресными липосомами при сходном уровне ингибирования подкожного роста опухоли мышей, леченных простыми МТХ-липосомами, привело к выраженному улучшению выживания. Мы полагаем, что усиление противоопухолевого эффекта адресных липосом, несущих лиганды к селектинам, произошло вследствие их действия не только на рост подкожной лимфомы, но и на лейкемическую составляющую, собственно и приводящую к гибели реципиентов. Очевидно также, что путем подбора режимов введения липосомальных препаратов (дозы, кратность) можно существенно улучшить результаты лечения.
Преодоление лекарственной устойчивости опухолевых клеток путем липофильной модификации препаратов
Как отмечалось выше, эффективность применения метотрексата ограничивается быстрым развитием устойчивости, связанной, в первую очередь, с нарушением трансмембранного переноса. Мы проверили,
позволяет ли липофильная модификация преодолевать такую устойчивость опухолевых клеток. С этой целью было проведено сравнительное определение цитотоксической активности липосом с MTX-DG in vitro в культурах клеток лейкемии человека с различной чувствительностью к МТХ: Т-лимфобластной линии CEM-CCRF и сублинии CEM/MTX, устойчивой к МТХ из-за дефицита RFC. Для интактного МТХ IC50 составила 16.4 ± 4.9 и 0.075 ± 0.005 мкМ в культурах CEM/MTX и СЕМ-CCRF, соответственно; для липосом с MTX-DG - 1.68 ± 0.05 и 0.88 ± 0.07 мкМ (приведены средние данные трех независимых экспериментов, каждый в двух повторах). Следовательно, резистентность (отношение IC5o CEM/MTX к IC50 CEM-CCRF) уменьшилась от значения 218 для МТХ до 1.9 для липосомальной формы MTX-DG (в 114 раз), при этом цитотоксическая активность мало отличается от таковой в среде чувствительных клеток родительской линии.
Получение липосомальных препаратов длительного хранения
Что касается устойчивости липосомальных препаратов, то дисперсии могут храниться без существенной агрегации липосом несколько дней. Однако сами лекарства, в особенности, сарколизин, в физиологическом растворе постепенно деградируют. С целью получения препаратов длительного хранения, мы исследовали с помощью электронной микроскопии (метод негативного контрастирования) размеры и степень агрегации липосом в ходе замораживания (жидкий азот)/хранения при -70°С/размораживания. Липосомы, содержащие производное Mlph, после размораживания частично агрегируют с образованием крупных плотных конгломератов, которые диспергируются до исходных частиц кратковременной обработкой на ультразвуковой бане. Напротив, MTX-липосомы, при размораживании не образуют плотных агрегатов, что может объясняться наличием отрицательного заряда а-карбоксила метотрексата на поверхности липосом.
Очевидно, что липидные производные лекарств и углеводов при замораживании/размораживании не могут покинуть липидный бислой, в отличие от растворенных во внутреннем объеме лекарств. Состав липосом до и после замораживания/ размораживания и ультразвуковой обработки определяли с помощью гель-хроматографии с последующим анализом фракций после разрушения липосом этанолом: фосфолипиды определяли элементным анализом на фосфор с помощью колориметрического метода
[49], конъюгаты Mlph и МТХ - спектрофотометрически (MTX-DG: Хмакс. =302 нм, е ~25000; Mlph-DG: ^макс. =258 нм, е —19700). Показано, что выделения MTX-DG из липидного бислоя липосом в отдельные агрегаты не происходит. Аналогичные данные получены и для Mlph-DG (график не приведен). Таким образом, состав и размер липосом, нагруженных липидными производными лекарств, не менялся при хранении липосом (после заморажива-
ния в жидком азоте) в замороженном виде при -70°С с последующим размораживанием и обработкой на ультразвуковой бане. Следовательно, такой метод может применяться для длительного хранения липосомальных препаратов.
Заключение
Показано, что включение известных химиотерапевтических средств -мелфалана/сарколизина и метотрексата - в виде липофильных пролекарств в мембрану липосом-носителей позволяет существенно улучшить их противоопухолевые свойства. Добавление в конструкцию липосом специфических липо-фильных гликоконъюгатов приводит к усилению эффекта. Предложен вариант получения липосомальных препаратов длительного хранения. В дальнейшем необходимо исследовать фармакокинетику и биораспределение липосомальных препаратов, а также механизм их противоопухолевого действия.
Исследования проведены при поддержке грантами РФФИ № 97-04-48421, № 00-04-48922, № 03-0448396, № 06-04-49432, МНТЦ№ 1781, ФЦП Миннауки РФ: государственный контракт № 02.513.11.3089, лот 2007-3-1.3-22-01-584.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lasic D.D., Papahadjopoulos D. Liposomes revisited // Science. — 1995. — Vol. 267, № 5202. — P. 1275-6.
2. Couvreur P., Vauthier C. Nanotechnology: intelligent design to treat complex disease // Pharm. Res. — 2006. — Vol. 23, №7. — Р. 1417-50.
3. Yuan F., Dellian M., Fukumura D.F., Leunig M., Berk D.A., Torchilin V.P., Jain R.K. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size // Cancer Res. — 1995. — Vol. 55, № 17. — P. 3752-6.
4. Straubinger R.M., Arnold R.D., Zhou R., Mazur-chuk R., Slack J.E. Antivascular and antitumor activities of liposome-associated drugs // Anticancer Res. — 2004.
— Vol. 24, № 2А. — P. 397-404.
5. Woodle M.C., Lasic D.D. Sterically stabilized liposomes // Biochim. Biophys. Acta. — 1992. — Vol. 1113, № 2. — P. 171-99.
6. Gabizon A., Schmeeda H., Barenholz Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal doxorubicin: a review of animal and human studies // Clin. Pharmacokinet. —
2003. — Vol. 42, № 5. — P. 419-36.
7. Водовозова Е.Л., Никольский П.Ю., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г. Липидные производные сарколизина, метотрексата и рубомицина // Биоорган. химия. — 1996. — Т. 22, № 7. — С. 548-56.
8. Водовозова Е.Л., Хайдуков С.В., Гаенко Г.П., Бондарчук Т.И., Михалев И.И., Гречишникова И.В., Молотковский Юл.Г. Транспортировка цитотоксиче-ских липосом к злокачественным клеткам с помощью углеводных детерминант // Биоорган. химия. — 1998.
— Т. 24, № 10. — С. 760-7.
9. Sapra P., Allen T.M. Ligand-targeted liposomal anticancer drugs // Prog. Lipid Res. — 2003. — V. 42, №
5. — P. 439-62.
10. Wong A., Toth I. Lipid, sugar and liposaccharide based delivery systems // Curr. Med. Chem. — 2001. — V. 8, № 9. — P. 1123-36.
11. Rubas W., Supersaxo A., Weder H.G., Hartmann H.R., Hengartner H., Schott H., Schwendener R. Treatment of murine L1210 lymphoid leukemia and melanoma B16 with lipophilic cytosine arabinoside prodrugs incorporated into unilamellar liposomes // Int. J. Cancer. — 1986. — Vol. 37, № 1. — P. 149-54.
12. Tokunaga Y., Iwasa T., Fujisaki J., Sawai S., Ka-gayama A. Liposomal sustained-release delivery systems for intravenous injection. IV. Antitumor activity of newly synthesized lipophilic 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine prodrug-bearing liposomes // Chem. Pharm. Bull. — 1988. —Vol. 36, № 9. — P. 3574-83.
13. Schwendener R.A., Schott H.J. Lipophilic 1-beta-D-arabinofuranosyl cytosine derivatives in liposomal formulations for oral and parenteral antileukemic therapy in the murine L1210 leukemia model // Cancer Res. Clin. Oncol. — 1996. — Vol. 122, № 12. — P. 723-6.
14. Crosasso P., Brusa P., Dosio F., Arpicco S., Pacchioni D., Schuber F., Cattel L. Antitumoral activity of liposomes and immunoliposomes containing 5-fluorouridine prodrugs // J. Pharm. Sci. — 1997. — Vol. 86, № 7. — P. 832-9.
15. Immordino M.L., Brusa P., Rocco F., Arpicco S., Ceruti M., Cattel L. Preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing lipophilic gemcitabine prodrugs // J. Control. Release. —
2004. — Vol. 100. — P. 331-46.
16. Водовозова Е.Л., Евдокимов Д.В., Молотков-ский Юл.Г. Синтез липидного производного противоопухолевого препарата метотрексата // Биоорган. химия. — 2004. — Т. 30, № 6. — C. 663-5.
17. Водовозова Е.Л., Гаенко Г.П., Бобрикова Е.С., Пазынина Г.В., Молотковский Юл.Г. Диглицеридное производное метотрексата: синтез и цитотоксическая активность в составе адресных липосом // Хим.-Фарм. журн. — 2007. — Т. 41, № 6. — С. 10-4.
18. Loiseau P.M., Deverre J.R., el Kihel L., Gayral P., Letourneux Y. Study of lymphotropic targeting and macrofilaricidal activity of a melphalan prodrug on the Molinema dessetae model // J. Chemother. — 1994. — Vol. 6, № 4. — P. 230-7.
19. Morris A.D., Atassi G., Guilbuad N., Cordi A.A. The synthesis of novel melphalan derivatives as potential antineoplastic agents // Eur. J. Med. Chem. — 1997. — V.
32, № 3 — P. 343-9.
20. McGuire J.J. Anticancer antifolates: current status and future directions // Curr. Pharm. Design. —
2003. — Vol. 9, № 31. — P. 2593-613.
21. Gurdag S., Khandare J., Stapels S., Matherly L.H., Kannan R.M. Activity of dendrimer-methotrexate conjugates on methotrexate-sensitive and -resistant cell lines // Bioconjugate Chem. — 2006. — Vol. 17, № 2. — P. 275-83.
22. Chau Y., Dang N.M., Tan F.E., Langer R. Investigation of targeting mechanism of new dextran-peptide-methotrexate conjugates using biodistribution study in matrix-metalloproteinase-overexpressing tumor xenograft model // J. Pharm. Sci. — 2006. — Vol. 95, № 3. — P. 542-51.
23. Ofner C.M., Pica K., Bowman B.J., Chen C.S. Growth inhibition, drug load, and degradation studies of gelatin/methotrexate conjugates // Int. J. Pharm. — 2006.
— Vol. 308, № 1-2. — P. 90-9.
24. Pui C.-H. Childhood leukemias // N. Engl. J. Med. — 1995. — Vol. 332, № 24. — P. 1618-30.
25. Bram E., Ifergan I., Shafran A., Berman B., Jansen G.,-Assaraf Y.G. Mutant Gly482 and Thr482 ABCG2 mediate high-level resistance to lipophilic antifolates // Cancer Chemother. Pharmacol. — 2006. — Vol. 58, № 6. — P. 826-34.
26. Rosowsky A., Forsch R.A., Yu C.-S., Lazarus H., Beardsley G.P. Methotrexate analogues. 21. Divergent influence of alkyl chain length on the dihydrofolate reductase affinity and cytotoxicity of methotrexate monoesters // J. Med. Chem. — 1984. — Vol. 27, № 5. — P. 605-9.
27. Pignatello R., Spampinato G., Sorrenti V., Di Giacomo C., Vicari L., McGuire J.J., Russell C.A., Puglisi G., Toth I. Lipophilic methotrexate conjugates with antitumor activity // Eur. J. Pharm. Sci. — 2000. — Vol. 10, № 3. — P. 237-45.
28. Williams A., Goodfellow R., Topley N. Amos N., Williams B. The suppression of rat collagen-induced arthritis and inhibition of macrophage derived mediator release by liposomal methotrexate formulations // Inflam. Res. — 2000. — Vol. 49, № 4. — P. 155-61.
29. Gabius H.J. Tumor lectinology: at the intersection of carbohydrate chemistry, biochemistry, cell biology, and oncology // Angew. Chem. Int. Ed. Eng. — 1988. — Vol. 27, № 10. — P. 1267-76.
30. Bies C., Lehr C.-M., Woodley J.F. Lectin-mediated drug targeting: history and applications // Adv. Drug Deliv. Revs. — 2004. — Vol. 56, № 4. — P. 425-35.
31. Managit C., Kawakami S., Nishikawa M., Yamashita F., Hashida M. Targeted and sustained drug delivery using PEGylated galactosylated liposomes // Int. J. Pharm. — 2003. — Vol. 266, №1-2. — P. 77-84.
32. Sun X., Hai L., Wu Y., Hu H.Y., Zhang Z.R. Targeted gene delivery to hepatoma cells using galactosy-lated liposome-polycation-DNA complexes (LPD) // J. Drug Targeting. — 2005. — Vol. 13, № 2. — P. 121-8.
33. Zeisig R., Stahn R., Wenzel K., Behrens D., Fichtner I. Effect of sialyl Lewis X-glycoliposomes on the inhibition of E-selectin-mediated tumour cell adhesion in vitro // Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes. —
2004. — Vol. 1660, № 1-2. — P. 31-40.
34. White K., Rades T., Kearns P., Toth I., Hook S. Immunogenicity of liposomes containing lipid core peptides and the adjuvant Quil A // Pharm. Res. — 2006. — Vol. 23, № 7. — P. 1473-81.
35. Vodovozova E.L., Gayenko G.P., Razinkov V.I., Korchagina E.Y., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Saccharide-assisted delivery of cytotoxic liposomes to human
malignant cells // Biochem. Mol. Biol. Int. — 1998. — Vol. 44, №3. — P. 543-53.
36. Vodovozova E.L., Moiseeva E.V., Grechko G.K., Gayenko G.P., Nifant’ev N.E., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Antitumour activity of cytotoxic liposomes equipped with selectin ligand SiaLeX, in a mouse mammary adenocarcinoma model // Eur. J. Cancer. — 2000. — Vol. 36, № 7. — P. 942-49.
37. Водовозова Е.Л., Назарова А.И., Феофанов А.В., Холоденко Р.В., Пазынина Г.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г. Взаимодействие липо-сом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы // Биол. Мембраны. — 2004. — Т. 21, №1.
— С. 53-64.
38. Shimada K, Kamps JA, Regts J, Ikeda K, Shio-zawa T, Hirota S, Scherphof GL. Biodistribution of liposomes containing synthetic galactose-terminated diacyl-glyceryl-poly(ethyleneglycol)s // Biochim Biophys Acta.
— 1997. — Vol. 1326, № 2. — P. 329-41.
39. Engel A., Chatterjee S.K., Alarifi A. Influence of spacer length on interaction of mannosylated liposomes with human phagocytic cells // Pharm. Res. — 2003. — Vol. 20, № 1. — P. 51-7.
40. Engel A., Chatterjee S. K., Alarifi A., Nuhn P. Influence of spacer length on the agglutination of glycolipid-incorporated liposomes by ConA as model membrane // J. Pharm. Sci. — 2003. — Vol. 92, № 11. — P. 2229-35.
41. Gabizon A., Papahadjopoulos D. Liposome formulations with prolonged circulation time in blood and enhanced uptake by tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
— 1988. — Vol. 85, № 18. — Р. 6949-53.
42. Muller M., Zschornig O., Ohki S., Arnold K. Fusion, leakage and surface hydrophobicity of vesicles containing phosphoinositides: influence of steric and electrostatic effects // J. Membrane Biol. — 2003. — Vol. 192, №1. — P. 33-43.
43. Laverman P, Boerman OC, Oyen WJG, Corstens FHM , Storm G. In vivo applications of PEG liposomes: unexpected observations // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. —2001. — Vol. 18, № 6. — P. 551-66.
44. Moghimi S.M., Hamad I., Andresen T.L., Jorgensen K., Szebeni J. Methylation of the phosphate oxygenmoiety of phospholipids-methoxy (Polyethylene glycol) conjugate prevents PEGylated liposome-mediated complement activation and anaphylatoxin production // Faseb J. — 2006. — Vol. 14. — P. U293-U303.
45. Romberg B., Metselaar J.M., Baranyi L., Snel C.J., Bunger R., Hennink W.E., Szebeni J., Storm G. Poly(amino acid)s: promising enzymatically degradable stealth coatings for liposomes // Int. J. Pharm. — 2007. — Vol. 331, № 2. — P. 186-9.
46. Olson F., Hunt C.A., Szoka F.C., Vail W.J., Pa-pahadjopoulos D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes // Biochim. Biophys. Acta. — 1979. — Vol. 557, № 1. — Р. 9-23.
47. Funaki N.O., Tanaka J., Kohmoto M., Sugiyama T., Ohshio G., Nonaka A., Yotsumoto F., Takeda Y., Ima-mura M. Membrane fluidity correlates with liver cancer cell proliferation and infiltration potential // Oncol. Rep.
— 2001. — Vol. 8, № 3. — P. 527-32.
48. Козлов А.М., Корчагина Е.Ю., Водовозова Е.Л., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г., Сыркин А.Б. Усиление противоопухолевой активности сарколизи-на путем превращения его в липидное производное и включения в мембрану липосом, содержащих углеводный вектор // Бюлл. экспер. биол. мед. — 1997. — Т. 123, № 4. — С. 439-41.
49. Bartlett G.R. Phosphorus assay in column chromatography // J. Biol. Chem. — 1959. — Vol. 234, № 3.
— P. 466-8.
