CC BY
11© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
В.И.Кукушкин3, Е.В.Сатушева1, М.Т.Александров1'2, О.А.Морозова1, Е.П.Пашков1, О.А.Амбарцумян1, В.А.Амосова1
ПРИМЕНЕНИЕ ЛАЗЕРНЫХ РАМАН-ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ИХ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ
1Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова, 2ООО Научно-клинический центр реабилитации женского здоровья, Москва; 3Институт физики твердого тела, Черноголовка, Московская обл.
Цель. Определение влияния микроорганизмов на порчу мясных продуктов при различных температурных режимах хранения по интегральным показателям люминесцентных линий в их спектрах и разработка алгоритма индикации микроорганизмов экспресс-методом с помощью лазерной раман-люминесцентной спектроскопии. Материалы и методы. Использовали фарш из говядины и свинины. Определение количества мезофиль-ных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов осуществляли методом серийных 10-кратных разведений с последующим параллельным высевом на подложки Rida count total 24 и чашки Петри с 5% кровяным агаром. Исследование образцов проводили на люминесцентном программно-аппаратном комплексе Enspectr L405 (разновидность программно-аппаратных комплексов Enspectr М). Результаты. Установлено, что порча мяса в значительной степени вызывается ростом бактерий рода Pseudomonas (P. fluorescens, P.putida, P. fragi и др.). Были измерены и записаны в базу данных раман-люминесцентные спектры бактерий, составляющих микрофлору, характеризующую и сопутствующую порче говядины и свинины. Заключение. Полученные результаты позволят в дальнейшем использовать данную методику как для экспресс-индикации и дифференциации микроорганизмов, так и для экспресс-оценки качества мясных продуктов на всех этапах их изготовления, хранения, транспортировки и реализации.
Журн. микробиол., 2015, № 5, С. 70—75
Ключевые слова: мясные продукты, микроорганизмы, гниение, бактерии рода Pseudomonas, раман-люминесцентная спектроскопия, Enspectr, SERS
V.I.Kukushkin3, E.V.Satusheva1, M.T.Aleksandrov1,2, O.A.Morozova1, E.P.Pashkov1, O.A.Ambartsumyan1, V.A.Amosova1
USE OF LASER RAMAN-LUMINESCENT TECHNOLOGIES FOR EVALUATION OF QUALITY OF MEAT PRODUCTS AND DETERMINATION OF THE DEGREE OF THEIR BACTERIAL CONTAMINATION
1Sechenov First Moscow State Medical University, 2Scientific-Clinical Centre of Woman Health Rehabilitation, Moscow; 3Institute of Solid State Physics, Chernogolovka, Moscow Region, Russia
Aim. Determination of the effect of microorganisms on spoilage of meat products during various temperature regimes of storage by integral indexes of luminescent lines in their spectra and development of an algorithm ofmicroorganism indication by an express method using laser Raman-luminescent spectroscopy. Materials and methods. Minced meat from beef and pork was used. Determination of quantity of mesophilic aerobic and opportunistic-anaerobic microorganisms was carried out by serial 10-fold dilutions with subsequent parallel seeding into Rida count total 24 plates and Petri dishes with 5% blood agar. Sample study was carried out in luminescent softwarehardware complex Enspectr L405 (a variant ofEnspectr М software-hardware complexes). Results. Meat spoilage was established to be caused to a large degree by Pseudomonas genus (P. fluorescens, P. putida, P. fragi et al.) bacterial growth. Raman-luminescent spectra of bacteria that compose microflora, characterizing and accompanying beef and pork spoilage, were measured and recorded into a database. Conclusion. The results obtained will allow to use this technique in the
future for both express-indication and differentiation of microorganisms and express-evaluation of quality of meat products at all stages of their manufacturing, storage, transport and realization.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 5, P. 70-75
Key words: meat products, microorganisms, putrefaction, Pseudomonas genus bacteria, Raman-luminescent spectroscopy, Enspectr, SERS
ВВЕДЕНИЕ
Как известно, пищевые продукты достаточно сильно обсеменены различными микроорганизмами. Принято дифференцировать микрофлору, обсеменяющую продукты питания, на специфическую и неспецифическую [5]. К первой относятся микроорганизмы, искусственно вносимые в продукт для придания ему определенных свойств. К неспецифической микрофлоре относятся микроорганизмы, прижизненно обсеменяющие органы и ткани животных в случае заболевания или нарушения барьерных функций кишечника, при травмах, голодании, перегревании или при переохлаждении организма животных. При несоблюдении санитарных условий получения продуктов питания на этапах заготовки, переработки, транспортировки и хранения также возможно вторичное загрязнение их микроорганизмами. Неспецифическая микрофлора может быть представлена сапрофитами, микробами, вызывающими порчу и гниение пищевых продуктов, условно патогенными и патогенными микроорганизмами. Микроорганизмы, вызывающие порчу и гниение пищевых продуктов, чаще всего обладают выраженной протеолитической активностью. Их попадание в продукты нежелательно, так как они снижают биологическую и пищевую ценность, а в некоторых случаях делают невозможным использование продуктов. Наряду с изменениями органолептических свойств продукта микроорганизмы способствуют накоплению токсических компонентов, которые могут привести к пищевому отравлению.
По составу микрофлоры и особенностям ее развития различают 2 формы гниения мясных продуктов: аэробную и анаэробную [2]. Аэробное гниение развивается на поверхности и постепенно переходит внутрь мяса. Микроорганизмы вызывают гнилостный распад белков, соединительная ткань разрыхляется. Возбудителями являются бактерии группы кишечной палочки, картофельная палочка (Bacillus mesentericus), сенная палочка (Bacillus subtilis), синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Анаэробное гниение вызывают бактерии, проникающие в глубину мяса из кишечника животного. Возбудителями являются бактерии рода Clostridium. Аэробное и анаэробное гниение в большей части происходят одновременно. В начальной стадии участвует, в основном, аэробная микрофлора, затем ее вытесняют палочковидные гнилостные бактерии.
При обычном общепринятом температурно-влажностном режиме на мясе растут главным образом аэробные неспоровые грамотрицательные бактерии родов Pseudomonas и Achromobacter [4]. Из этой группы наиболее активно размножаются бактерии рода Pseudomonas, которые при совместном размножении с бактериями рода Achromobacter подавляют рост последних. Поэтому при хранении мяса в обычных (аэробных) условиях сверх допустимого срока наиболее часто возбудителями порчи и гниения мяса являются бактерии рода Pseudomonas. Чем ниже температура хранения и меньше относительная влажность воздуха, тем больше длительность сохранения мяса без признаков порчи. При одной и той же температуре и относительной влажности воздуха скорость порчи зависит от степени исходной обсемененности мяса микроорганизмами. В практике контроля качества пищевых продуктов флюоресцирующие Pseudomonas известны как индикаторы на зараженность. Интенсивное раз-
множение этих бактерий на мясных продуктах питания сопровождается выделением флюоресцирующих пигментов. Этот признак может применяться при отбраковке пищевых продуктов и для определения их срока и режима хранения, а также для количественной оценки микробной обсемененности.
На сегодняшний день не существует быстрого и надежного способа для оценки качества мясных продуктов и определения степени их бактериальной обсемененности. Для определения числа и идентификации микроорганизмов в мясных продуктах используется длительный и дорогостоящий микробиологический метод. Таким образом, поиск и разработка современных чувствительных и специфичных экспресс-методов индикации и идентификации микроорганизмов, а также задачи по оценке качества мясных продуктов, являются очень актуальными.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На первом этапе исследования были изучены два вида мясного фарша из свинины и говядины, хранившихся при -4°С, +4°С, +22°С на определение количества мезо-фильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ). Было исследовано 26 проб, из которых 2 были объектами сравнения. Органолепти-чески объекты сравнения свинины и говядины имели цвет, запах и консистенцию свежего мяса в соответствии с ГОСТ 9959-91. Определение КМАФАнМ осуществляли методом серийных 10-кратных разведений с последующим параллельным высевом на подложки Rida count total 24 и чашки Петри с 5% кровяным агаром. Для исследования на люминесцентном программно-аппаратном комплексе Enspectr L405 (разновидность программно-аппаратных комплексов Enspectr М) использовали стеклянные виалы, наполненные мясным фаршем тех же проб. В установке Enspectr L405 используется синий лазер с длиной волны 405 нм, которая возбуждает люминесцентное свечение исследуемых образцов мяса; все измерения проводились при постоянной мощности излучения 10мВт и времени экспозиции 200 мс. Во время измерения стеклянная виала с объектом исследования постоянно вращалась для получения воспроизводимых усредненных результатов, не зависящих от точки измерения. Записанные спектры люминесценции программно обрабатывались и в нормированном виде представлялись в виде графиков.
На втором этапе исследования параллельно с определением КМАФАнМ проводилась индикация и дифференциация выделенных микроорганизмов. Было исследовано 18 проб мясного фарша из свинины и говядины, хранившихся при двух температурных режимах +4°С и +22°С. Определение КМАФАнМ и дифференциация микроорганизмов осуществлялись методом серийных 10-кратных разведений с последующим параллельным высевом на подложки Rida count total 24, Rida count Staph. aureus, Rida count E.coli/Coliform, Rida count Salmonella/Enterobacteriaceae, Rida count Yeast&mold rapid и чашки с 5% кровяным агаром, солевым агаром с манитолом, SS-агаром, TSN агаром, агаром Шедлера, средой Сабуро, средой Эндо. Для исследования на Enspectr L405 использовалась та же методика, что и на первом этапе исследования. Для дифференциации микроорганизмов применяли масс-спектрометр Maldi-tof. В клинической микробиологии этот прибор позволяет с высокой точностью определить количественный и качественный состав вещества, его структуру, физико-химические реакции.
Одновременно с этим проводилась индикация микроорганизмов при помощи методов раман-люминесцентной спектроскопии. Для исследования на Enspectr L405 и параллельных исследованиях на SERS подложках [1] на приборе Enspectr R532 (разновидность программно-аппаратных комплексов Enspectr М) использовали культу-ральные суспензии в разной концентрации по стандарту мутности МакФарланда. Концентрация микроорганизмов в суспензии контролировалась посевом серийных разведений. Готовые суспензии в объеме 1,5 мл вносили в стеклянные виалы, после чего проводилась запись люминесцентных спектров исследуемых микроорганизмов
и параллельно с этим снимались спектры рамановского рассеяния с капли объемом 2 мкл этих же микроорганизмов на SERS подложках.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе работы было проведено микробиологическое исследование: на протяжении 5 дней (1 раз в день) определяли КМАФАнМ в пробах фарша свинины и говядины при -4°С, +4°С, +22°С.
В результате было установлено, что увеличение КМАФАнМ наблюдается в течение первых 3 дней в пробе фарша свинины и первых 4 дней в пробе фарша говядины при их хранении при +22°С, а затем происходит остановка роста КМАФАнМ. Динамика роста КМАФАнМ при хранении проб фарша свинины и говядины при -4°С и +4°С на протяжение 5 дней существенно не меняется.
На этом же этапе работы был проведен люминесцентный количественный анализ мясных продуктов на Enspectr L405. На протяжении 5 дней с интервалом в 5 часов записывались спектры люминесценции фарша говядины и свинины при хранении их при -4°С, +4°С, +22°С. Наиболее быстрый процесс (рост люминесцентных линий) происходит при температуре хранения +22°С.
При изучении изменения спектров люминесценции свинины и говядины с течением времени при +22°С установлено, что на протяжении первых 80 часов наблюдается быстрый рост люминесцентных линий, затем наступает насыщение и рост прекращается. После длительного времени (порядка 200 часов) наступает период уменьшения интенсивности люминесцентных линий.
Эта зависимость (на твердой питательной среде — на мясе) практически полностью соответствует общепринятым классическим графикам роста числа колоний микроорганизмов в жидкой питательной среде в зависимости от времени.
Как известно, при изучении процесса размножения микробов необходимо учитывать, что они всегда существуют в виде более или менее многочисленных популяций, и развитие их популяции в питательной среде, содержащей компоненты и метаболиты мясных продуктов питания, можно рассматривать как замкнутую систему.
На втором этапе работы проводили сравнительную оценку данных индикации и дифференциации выделенных микроорганизмов из проб фарша свинины и говядины
при хранении их при температурах +4°С и +22°С как на масс-спектрометре Maldi-tof (общепринятая микробиологическая технология), так и на разработанном нами высокочувствительном аппаратно-программном комплексе Enspectr M [3].
Из полученных нами результатов следует, что на начальных этапах хранения при +22°С в пробах фарша свинины и говядины обнаруживаются кокковые микроорганизмы и грамотри-цательные палочки (род Pseudomonas, семейство En-terobacteriaceae), кроме то-
Рис. 1. Спектры люминесценции монокультур микроорганизмов, го в фарше из свинины — выявленных в мясе (концентрации всех микробов 5х106 КОЕ/ аэробные спороносные па-мл). лочки. При дальнейшем
хранении происходит увеличение количества этой микрофлоры и появляются дрожжевые грибы, что приводит к изменению качества мясного продукта и его порче — появлению пут-ридного запаха, изменению консистенции, гниению и ослизнению. В фарше из говядины дополнительно на 5 сутки выявлен протей, что также сопутствовало гниению мяса.
При хранении мясного фарша из говядины и свинины при +4°С обсеменение микроорганизмами происходит значительно
более медленнее, чем при
' ^ Рис. 2. Спектры рамановского рассеяния на SERS подложках
+22 С, поэтому процессы микроорганизмов, выявленных в мясе (спектры получены со
гниения и порчи мясных временем экспозиции 1 сек, концентрации всех микробов 106
продуктов при 4°С слабо КОЕ/мл).
выражены.
Параллельно с микробиологическими исследованиями проводились измерения люминесцентных спектров чистых культур микроорганизмов, обнаруженных в мясном фарше из свинины и говядины, на приборе Enspectr L405 (рис. 1), а также записывались рамановские спектры на SERS подложках на приборе Enspectr R532 (рис. 2) этих же культур с целью создания базы данных раман-люминесцентных спектров микроорганизмов и для дальнейшего процесса их экспресс-индикации в мясных продуктах питания.
Определено, что наиболее выраженными по интенсивности линиями люминесценции при порче мясных продуктов являются линии Pseudomonas aeruginosa (эти линии соответствуют спектральным показателям музейного штамма).
Установлено, что люминесцентные линии (590 нм и 635 нм), обнаруженные на мясе, присущи пигментообразующим бактериям рода Pseudomonas, которые являются индикаторами процессов гниения и порчи мяса. Связав нормированную интегральную интенсивность этих люминесцентных линий с концентрацией бактерий рода Pseudomonas и временем хранения исследуемого образца мяса можно осуществлять экспресс-методику оценки качества мясных продуктов питания и степени их порчи и бактериальной обсемененности. Для идентификации конкретных видов микроорганизмов, выделенных из мяса, возможно использование раман-люминесцентной спектроскопии [1]. С ее помощью проводилась запись спектров микроорганизмов: Pseudomonas monteillii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia liquefaciens, Macrococcus caseolyticus и Staphylococcus vitulinus. Были обнаружены индивидуальные рамановские линии для каждого исследуемого микроорганизма — это позволяет записывать эти спектры в общую базу данных рамановского рассеяния микробов на SERS подложках и в дальнейшем путем сравнивания со спектрами базы данных проводить идентификацию всех микроорганизмов, выявленных в мясных продуктах.
В настоящее время наиболее распространен микробиологический метод для определения качества мясных продуктов и степени их бактериальной обсемененности. При этом от момента покупки мяса до доставки в лабораторию и получения резуль-
тата исследования проходит очень длительный промежуток времени. В данной работе предложен новый быстрый и точный метод оценки качества мясных продуктов. В ходе нашей работы были исследованы спектральные характеристики мясных продуктов питания при разных режимах и на разных этапах хранения и найдены все информативные люминесцентные линии, соответствующие бактериям рода Pseudomonas, которые являются достоверным индикатором процесса порчи мясных продуктов. Портативность прибора (вес 2 — 2,5 кг в зависимости от комплектации) и время измерения (1 — 2 сек) позволяют использовать его в мобильных (передвижных) лабораториях. Разработанная аппаратура метрологически сертифицирована. Аналогов разработанной технологии в доступной нам литературе не выявлено.
Полученные результаты показывают, что в зависимости от режима и условий хранения мясных продуктов происходят изменения количественного и качественного состава их микрофлоры. При нарушении условий транспортировки, хранения и реализации происходит преждевременная порча продуктов. Повышается уровень начального обсеменения, что в дальнейшем может стать причиной пищевых отравлений. Порча мяса в значительной степени вызывается ростом бактерий рода Pseudomonas (P. fluorescens, P. putida, P. fragi и др.). Нами предложена программная методика, которая позволяет в экспресс-режиме оценивать качество мясных продуктов и степень их бактериальной обсемененности. Дополнительно в результате проведенной работы были измерены и записаны в базу данных раман-люминесцентные спектры бактерий, составляющих микрофлору, характеризующую и сопутствующую порче говядины и свинины. Полученные результаты позволят в дальнейшем использовать данную методику как для экспресс-индикации и дифференциации микроорганизмов, так и для экспресс-оценки качества мясных продуктов на всех этапах их изготовления, хранения, транспортировки и реализации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Александров М.Т., Кукушкин В.И., Амбарцумян О.А., Пашков Е.П., Буданова Е.В., Зуев В.М., Калиничук А.С., Хомерики Т.А., Лабазанов А.А. Идентификация микроорганизмов на основе эффекта гигантского рамановского рассеяния. Журн. микро-биол. 2013, 5:97-100.
2. Киселева Т.Ф. Теоретические основы консервирования. Учебное пособие. Кемерово, КемТИПП, 2008.
3. Патент № 144665 от 10.12.2013. Устройство раман-флюоресцентной диагностики состояния тканей человека в норме и при патологии.
4. Санитарный контроль в пищевой промышленности. http://smikro.ru/.
5. Шустрова Н.М., Снегирева А.Е. Микробиологическая экспертиза качества продукции. Красовский П.А. (ред.). МУ МВШЭ.МР-016-2002.
Поступила 17.02.15
Контактная информация: Пашков Евгений Петрович, д.м.н., проф., 125009, Москва, ул. Моховая, 11, стр. 10, р.т. (495)628-00-89
