CC BY
97
Спаечный процесс. Образование соединительной ткани.
Известно, что воспаление - это комплексная местная сосудисто-мезенхимальная реакция на повреждение ткани, вызванная действием различного рода агентов. Реакция имеет защитно-приспособительный характер, несет в себе элементы как патологии, так и физиологии [5]. Двойственный характер воспалительной реакции - важная деталь в дальнейших логических рассуждениях и разработке метода лечения спаечного процесса. При наличии чужеродных агентов, попадающих извне, например, при оперативных вмешательствах, или попадающих из инфицированных депо, например, желудочно-кишечного тракта (микробных тел или компонентов их стенок и цитозола), формируется пусковой механизм воспаления - альтерация с выбросом в биологическую паракле-точную среду биологически активных веществ - медиаторов (кининов, калликреинов, компонентов системы комплемента, факторов свертывающей системы крови). Условиями для увеличения в очаге воспаления клеточных элементов и белков плазмы служат модификации микро-циркуляторного модуля с одновременными нарушениями реологических свойств крови. Это сопровождается, как правило, ростом проницаемости микрососудов, главным образом микровенул и посткапилляров. Выход большого количества компонентов жидкой части и клеточных элементов плазмы крови является главной причиной формирования экссудативной фазы воспаления. Клетки крови как дополнительные источники эффекторных субстанций (гистамин, серотонин, цитокины, ферменты ли-зосом) поддерживают и усиливают реакцию экссудации. Образование профузных межклеточных течей является основным условием выхода в среду фибриногена - материала первичного рыхлого формирования слипчивого процесса воспаления. Поступление фибриногена в ткани приводит к его коагуляции и формированию фибрина. Гибель клеток и в связи с этим выход в интерстициальное пространство тромбопластина ускоряет процесс коагуляции фибриногена. Полимерация фибрина с выпадением его в осадок - важная матрица, на которой будет формироваться молодая грануляционная ткань. Кроме того, множественные стазы и агрегаты из тромбоцитов и эритроцитов в микровенулах и посткапиллярах при сохра-коли-
нившемся артериальном притоке в микроциркуляторный модуль затрудняют лимфо-венозный отток.
Таким образом, высокую сосудистую проницаемость сопровождают экссудация в ткани и полости жидких частей плазмы, эмиграция клеток крови с образованием воспалительного выпота и воспалительного клеточного инфильтрата. Кроме высокого околоклеточного транспорта в результате расхождения плотных межклеточных контактов (включая как сосудистый эндотелий, так и эпителий слизистой оболочки) имеет место трансклеточный поток субстанций в растворенном (пиноцитоз) и взвешенном (фагоцитоз) состоянии. Межэндотелиальный выход эритроцитов, лейкоцитов, моноцитов, трансэндотелиальный транспорт лимфоцитов и других мононуклеаров формирует межклеточный инфильтрат. Базальные мембраны при этом подвергаются феномену тиксотропии - обратимому уменьшению вязкости коллоидов и превращению их в местах клеточных контактов из геля в золь. Это позволяет проникать клеткам к очагу воспаления. Таким образом, формирование воспалительного экссудата, содержащего жидкие составные части плазмы и клетки крови, а также резидуальные клеточные элементы вместе с продуктами тканевого аутолиза является главным субстратом будущей организации соединительной ткани. Центральным звеном в стадии пролиферации и организации соединительной ткани являются камбиальные мезенхимальные клетки, которые способны дифференцироваться в фибробласты и фиброциты. Формирование истин ного (с хирургической точки зрения) спаечного процесса в брюшной полости начинается с пролиферации фиб-робластов и синтеза волокнистых структур. При формировании экссудативной стадии воспаления на брюшинном покрове фибринолитическая функция мезотелия может выпадать, и резорбция фибринозного экссудата может не происходить. Нарушение отторжения фибринозных масс с серозного покрова приводит к их организации путем прорастания грануляционной тканью. Этот процесс образует спайки между серозными поверхностями. Важно заметить, что формирование спаек связано с активацией синтеза фибробластами коллагена и гликозаминогликанОв, участвующих в построении волокнистых структур и межуточного вещества соединительной ткани.
Коллаген - самый распространенный белок организма человека. Он составляет от 25 до 33% общего
чества белка и, следовательно, около 6% массы тела. 30% его аминокислотных остатков приходится на глицин.
Пролин в совокупности с 3- и 4-оксипролином составляет 21% остатков, а на долю аланина приходится 11%. Коллаген - один из немногих белков, содержащих оксипро-лины и 5-оксилизин [69]. Коллаген характеризуется полным отсутствием токсичности и канцерогенности, способностью всасываться и утилизироваться в организме, образовывать прочные комплексы с широким кругом лекарственных веществ и стимулировать репаративные процессы в тканях. При условии освобождения коллагена при очистке от других белков обладает низкими антигенными свойствами, регулирует скорость лизиса в организме в широких пределах, образует комплексы с другими активными веществами. Высокоочищенные препараты коллагена содержат до 0,4-0,6% углеводов и 0,2% кислых гликозаминогликанов по гексозамину. Углеводы являются
■ составной частью коллагеновой молекулы, присоединяясь О-гликозидной связью к оксилизину основных поли-пептидных цепей. В коже и других тканях коллагеновые волокна существуют в виде сложной морфологическолй структуры, состоящей из пучков волокон длиной 30-150 мкм, диаметром 2-130 мкм, фибрилл диаметром 50-150 нм и более мелких субфибриллярных элементов (электронная микроскопия). Волокнистая архитектоника тканей, построенных из молекул коллагена, имеет трехспиральную структуру полипетидных цепей, свернутых в общую суперспираль. В образовании волокон тканей участвуют кислые гликозаминогликаны, гликопротеиды и другие вещества.
Аминокислотный состав коллагена характеризуется присутствием оксипролина и оксилизина (эти аминокислоты не встречаются в других белках), отсутствием триптофана, цистеина и крайне низким содержанием тирозина и метионина, наличием 23% аминокислот пролина и оксипролина и около 30% глицина [4,18,67]. Установлено, что первичная структура отдельных пептидных цепей, составляющих отдельную трехспиральную молекулу тропоколлагена, представляет собой три цепи по 1050 аминокислотных остатков каждая [12,22]. Макромолекула коллагена состоит из a-цепей двух типов, отличных по аминокислотному составу. Это цепи a1 и a2. Молекула коллагена кожи состоит из двух а1 и одной а2-цепей. Из других коллагенов выделены также а-цепи, но отличные по первичной структуре от а-цепи. Различают четыре типа а1-цепей, которые обозначают как а1 тип I, а1 тип II, а1 тип Ш, а1 тип IV (а1 (I), а1 (II), а1 (Ш), a1 (IV). В зависимости от первичной структуры отдельных цепей и соотношения их в тройной спирали выделяют четыре типа генетически различных коллагенов позвоночных [77,78]. Трехспиральная молекула коллагена (тропоколлаген) имеет длину приблизительно 300 нм, диаметр 1,5 нм и молекулярную массу 300 000. Свободные боковые цепи глицина находятся внутри общей спирали, кольца пролина и оксипролина и боковые группы других аминокислотных остатков находятся снаружи спиральной нити. Тройную спираль молекулы коллагена стабилизируют водородные связи, имеющие межспиральный характер. Кроме того, молекула стабилизирована комплексом электростатических [55] и гидрофобных связей [1, 25,63], что подтверждено расшифровкой первичной структуры отдельных цепей [13, 22]. Установлено, что в растворе коллаген находится в виде дискретных макромолекул длиной приблизительно 280-300 нм и диаметром 1,4-1,6 нм с молекулярной массой в среднем 300 000. В растворе такой коллаген может находиться в форме димерных и полимерных молекул за счет сохранения межмолекулярных связей между отдельными молекулами [65, 67]. Многочисленные исследования доказывают, что физико-химические свойства коллагена: характеристическая вязкость, константа диффузии и седиментации, удельное оптическое вращение, спектр кругового дихроизма резко изменяются в процессе денатурации молекулы. Это сопровождается разрушением асимметричной трехспиральной структуры молекулы и превращением ее в форму, характерную для желатина. Температура денатурации кислотораствори-мого коллагена составляет 38-39°С [17, 58]. При тепловой денатурации коллагена образуются а-, |3- и у-цепи с молекулярной массой, соответственно 100000, 200000 и 300000. (3- и у-цепи - это агрегаты, состоящие из двух или трех a-цепей, между которыми установлена прочная ковалентная связь. Соотношение этих компонентов различно в зависимости от вида использованных для выделения тканей. При определенных условиях возможно восстановление макромолекулы коллагена после ее денатурации и распада на а-, р- и у-компоненты (ренатурация). Это доказывает, что ведущим в организации вторичной и третичной структур коллагена является его первичная структура. Наиболее быстро и полно ренатурируют у-компоненты, содержащие три цепи [38, 39]. Молекулы в растворе устойчивы к действию протеолитических ферментов, таких как пепсин, трипсин, проназа. Коллаген является специфическим субстратом для коллагеназы. Однако после денатурации коллагена он легко может быть расщеплен на холоду большинством протеиназ [50, 58].
Роль хитозана в регуляции грубого рубцевания
Известно, что при определенных условиях происходит самосборка молекул коллагена с восстановлением надмолекулярной структуры. В основе лежит первичная структура коллагена. Из растворов коллагена могут регенерировать волокнистые структуры четырех типов:
1. Фибриллы с упорядоченной структурой с периодом поперечной исчерченности 64-70 нм - это фибриллы нативного типа, так как идентичны фибриллам коллагена различных тканей;
2. Фибриллы с неупорядоченной структурой, поперечной исчерченности не имеют;
3. Кристаллиты с большим периодом исчерченности в 260-280 нм (SLS-сегменты);
4. Фибриллы с большим периодом исчерченности в 260-280 нм (FLS-сегменты).
Поскольку фибриллогенез in vitro происходит в мягких условиях при действии слабых кислых или щелочных растворов и при 37 °С, то можно считать, что такие же процессы происходят и in vivo [23, 24]. В клетках высших организмов содержится несколько структурных генов, ответственных за синтез различных типов коллагена [2, 12, 45]. Установлено, что коллаген первоначально синтезируется в фибробластах, хондробластах, остеобластах и других клетках в виде проколлагена - молекулы больших размеров. Дальнейший протеолиз модифицирует молекулу в форму
функционирующего белка - тропоколлагена. Клетки, в которых не происходит синтез коллагена, являются эпителиальными клетками хрусталика и роговицы. Ферментативный разрыв в молекуле коллагена происходит в местах дополнительных удлинений на N- и С-концах. Между цепями проколлагена существуют прочные дисульфидные связи. Непрямые методы исследования указывают на то, что дополнительные удлинения проколлагена выполняют важные биологические функции, в том числе узнавание и самосборку трех индивидуальных а-цепей для синтеза коллагенов различного типа, ингибирование внутриклеточного фибриллогенеза и секрецию белка через мембрану клетки, самосборку молекул в фибриллы и стабилизацию их в процессах внеклеточного фибриллогенеза. Пониженная активность проколлагенпептидазы приводит к нарушению механизма превращения проколлагена в коллаген. Такой коллаген обладает плохой волокнообразующей способностью в условиях, когда полимеризация нормального коллагена происходит быстро. Про-а-цепи коллагена синтезируются в преимущественно тяжелых полисомах, состоящих из 30-40 рибосом. Матричная полицистроновая РНК для npo-а! (I) и про-а2-цепей транслируется одновременно, цепи собираются путем последовательного присоединения отдельных аминокислотных остатков к растущей цепи со скоростью 200 остатков в минуту. На растущих а1-цепях перед освобождением их с рибосом начинается гидроксилирование пролина, которое продолжается до образования тройной спирали. Только после гидроксилирования коллаген секретируется из клетки [42,46]. Убедительно показано, что оксипролин играет существенную роль в стабилизации трехспиральной конформации коллагена. Температура денатурации протоколлагена составляет всего 24 °С, что на 15 °С ниже температуры денатурации нормального растворимого коллагена. Таким образом, при температуре тела человека протоколлаген неустойчив. Только после гидроксилирования пролина трехспиральная структура молекулы коллагена становится устойчивой при 37 °С. Оксилизин является местом дальнейшей модификации коллагена. К этой аминокислоте присоединяются моно- и дисахариды. Присоединение галактозы происходит с помощью галактозилтрансферазы через О-глюкозидную связь к 8-углеродному атому оксилизина. К галактозе, в свою очередь, присоединяется глюкоза с помощью гликозилтрансферазы [64]. Эта конструкция участвует в образовании межмолекулярных поперечных связей, что является условием формирования фибрилл. Прослежено с помощью авторадиографии, что коллаген синтезируется на рибосомах в эндоплазматической сети и, минуя пластинчатый комплекс, в виде вакуолей движется к поверхности клетки, совмещается с клеточной наружной мембраной или путем эндовезикулярного транспорта выделяется в межклеточную среду. После наружной секреции от проколлагена происходит отщепление концевого удлинения с помощью нейтральной проколлагенпептидазы. Образованный таким образом коллаген начинает участвовать в образовании фибрилл и волокон [45]. Первые внеклеточные филаменты и фибриллы обнаруживаются около наружной мембраны клеток. Формируются первоначально тонкие микрофибриллы диаметром 10-15 нм с периодом исчерченности 12-17 нм, прицельное электронное микроскопирование выявляет филаменты толщиной 5-7 нм с неопределенной периодичностью. Увеличение со временем поперечных химических связей приводит к появлению фибрилл диаметром 30-80 нм с периодом 64 нм. Считается, что формирование вторичной, третичной и четвертичной структур коллагена генетически детерминировано аминокислотной последовательностью первичной структуры. Самосборка in vivo протекает аналогично самосборке in vitro. Коллагеновые фибриллы при участии гликозаминогликанов (особенно хондроитинсульфатов), гликопротеидов и неколлагеновых белков формируют коллагеновые волокна и пучки. Вновь синтезированный коллаген со временем теряет способность растворимости по мере развития тканей. Это указывает на образование прочных межмолекулярных связей. Формирование поперечных связей начинается с ферментативной обработки лизина и оксилизина. С помощью лизил- и оксилизиламинотрансфераз остатки соответствующих аминокислот переходят в альдегидные производные (аллизин и алоксилизин) [12]. Эти I альдегидные производные первоначально находятся на концах тройной спирали, но при созревании коллагена они обнаруживаются по всей длине молекулы [67]. При формировании межмолекулярных связей в коллагене образуются нативные (лабильные) и денатурированные (стабильные) связи. Первые легко разрушаются при денатурации, вторые устойчивы, не растворяются при нагревании и переходят в плотное хрящеподобное состояние. При близком расположении карбонильных групп в цепи коллагена с другими реактивными соединениями лабильные связи переходят в стабильные. Последовательность образования межмолекулярных связей следующая: альдегидные группы взаимодействуют с е-аминогруппа-ми лизина или оксилизина соседних молекул и образуются связи типа оснований Шиффа. Далее формируются более прочные поперечные связи - альдиминные. В них участвуют карбонильные группы. Если взаимодействие касается двух альдегидных групп, то формируется связь по типу альдольной конденсации с образованием прочных поперечных связей (N-концевой отдел коллагеновой молекулы). Со временем продукты альдольной конденсации исчезают и формируются новые соединения с включением гистидина. Г истидин формирует связь с аминогруппой оксилизина. К этому продукту присоединяются четыре аминокислотных остатка различных пептидных цепей. Несмотря на то, что содержание гистидина в этих реакциях составляет менее 1%, его участие весьма важно. Точное соединение в сборке коллагена достаточно редких трех аминокислотных остатков лизина, оксилизина и гистидина указывает на точное межмолекулярное построение фибрилл.
Высокая биосовместимость хитозана и его производных, чрезвычайно низкая токсичность, биодеградабельность,
антимикробные и антитоксические свойства позволили ряду исследователей использовать эти полимеры для управления стадиями раневого заживления. Известно, что внесение в дорсальные кожные раневые дефекты у кроликов капсулированной формы N-карбоксибутилхитозана приводило к правильно программированной пролиферации и организации тканей, стимулированию процесса восстановления во времени, новообразованию сосудов. В то же время процессы гиперпродукции фиброзной ткани (рубцевания) существенно подавлялись по сравнению с контрольной группой животных. Такие же закономерности установлены и при заживлении раневых дефектов у собак и кошек [47, 51]. Такая направленность раневого заживления важна не только в случаях гнойного инфицирования тканей, но и при производстве плановых пластических операций [11]. Упорядоченная организация соединительной ткани, особенно в грануляционную фазу заживления, зависит и от количества нарабатываемых окисляющих субстанций. Выделение оксида азота в раневом процессе увеличивает цитотоксичность в клеточной пролиферации при заживлении раны в течение начальной фазы воспалительной реакции. Хитин и хитозан обнаруживают существенное ингибирование продукции оксида азота активированными макрофагами. Испытание воздействием на активированные клетки N-ацетилхитотетраозы, -триозы, -диозы и мономера хитина выявляет слабый эффект по сравнению с использованием полисахарида [26].
Снижение воспалительной реакции в фазу репарации во многом зависит от активности резидуальных макрофагов. Ингибирование макрофагальной активности (контроль картины респираторного взрыва) с помощью лак-тата хитозана приводит к функционально ориентированной архитектонике коллагеновой подложки. Картину дополняет процесс стимулирования пролиферации фибробластов. При сравнении действия на воспалительную и грануляционную фазы заживления известных стандартных полисахаридов (альгината натрия или кальция, каррагинана, пектиновой кислоты, хондроитинсульфата, хитина и хитозана) подтверждается, что последний полимер имеет существенные преимущества - возможности полноценного управления процессом [62]. При процессах усиленной пролиферации фибробластов и образования рубцовой ткани комплексы, содержащие хитозан, способны подавлять излишнюю функцию клеток, регулировать резорбцию гиперпродукта и, таким образом, предупреждать грубое рубцевание [47, 59].
Организация соединительной ткани на фибриновой матрице с помощью хитозановых полимеров логично рассматривать с момента взаимодействия коллагена и хитозана. В искусственной системе бычьего коллагена и 100% деацетилированного высокомолекулярного хитозана происходят,прежде всего электростатические взаимодействия. Сила этих связей довольно слабая и зависит от плотности заряда и длины коллагеновой цепи. Чем выше доступность к активным центрам хитозана (короткие цепи полимера), чем выше плотность заряда (высокая степень деацетилирования), тем проще образование в водной среде состояния геля и получение плотного поликатионполианионового комплекса [68]. Степень миграции и пролиферации фибробластов регулируется степенью адгезии клеток к гелю хитозана. Это обеспечивает дозированный синтез коллагена в межклеточный матрикс и регулярную самосборку коллагеновой сетки [59]. Самосборка в межуточном матриксе происходит путем линейной полимеризации конец в конец и боковой агрегации. В результате боковых взаимодействий определенных аминокислот трехспиральная структура будущих тонофибрилл приобретает строгий вид каждой нити коллагена по отношению друг к другу. Параллельно происходит синтез фибробластами гликозаминогликанов. Полисахариды, окружающие в межуточном матриксе молекулы коллагена, регулируют скорость образования фибрилл (полимеризацию и боковую агрегацию). Гликозаминогликаны создают высокую концентрацию молекул коллагена на определенных участках в ране. Неизбежное возникновение слабых межмолекулярных взаимодействий в результате формирования большого числа коллагеновых фибрилл приводит к стабилизации волокнистых структур. Нарастание массы коллагеновых волокон грануляционной ткани приводит к ее уплотнению с формированием рубца. Частичная резорбция грануляций при участии гликозаминогликанов и тканевого протеолиза является необходимым условием исключения излишнего фиброза.
Сульфатирование полимера и дальнейшее образование и использование коллаген-хитозанового комплекса приводит к усилению адгезии фибробластов на этом матриксе, получению высоких показателей локомоции клеток воспалительного процесса. Таким образом, сульфо-группы полимера способны формировать сигнал к фенотипической трансформации клеток регенерации [41]. Однако, введение в искусственную систему фибробластов даже неочищенных источников хитина-хитозана, например, мицелия грибов Aspergillus oryzae, Mucor mucedo, Phycomyces blakesleeanus приводит к стимулированию пролиферации клеток. Степень пролиферации зависит от количества внесенного в систему хитозана (от слабой стимуляции к значительной и очень значительной, а также к состоянию существенного ингибирования) [14]. Цитоморфологические исследования фибробластов,
стимулированных продуктами хитозана, показывают, что клетки обладают свойствами аттрактантов. Однако такие закономерности формирования грануляционной ткани в присутствии хитозана имели бы место, если бы полимер вносился непосредственно в очаг воспаления. Но при условии создания естественного (стенка желудочнокишечного тракта) или искусственного (неприродные мембраны) барьера между воспалительным очагом и хитозаном формируется феномен перфузии (обратной резорбции) жидкой и клеточной частей воспалительного экссудата в сторону заряженного полимера. На пути обратного транспорта клеточной
массы, но, главным образом, жидкой части экссудата, может находиться кишечная стенка как разновидность биологической мембраны. Обратная резорбция продуктов воспалительной реакции в просвет кишки может стать ведущим моментом в подходе к консервативному лечению спаечного процесса в брюшной полости.
Взаимоотношения хитозана и эпителия слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
Хитозан как представитель аминированных полисахаридов (гликозаминогликанов) был испытан как средство, регулирующее спаечный процесс в брюшной полости. Использовали две модели хирургического вмешательства у крыс с целью образования в брюшной полости спаечного процесса. Были исследованы две опытные группы животных (операция на матке и модель небольшого разреза), которые получали с пищей карбоксиметилхитозан, и контрольная группа животных, которая не получала этот полимер. Авторы изучали через 10-14 дней после оперативного вмешательства количество, протяженность, величину спаек в брюшной полости. Результаты исследований показали, что карбоксиметилхитозан был более эффективен, чем гиалуроновая кислота. Точный механизм предупреждения спаечного процесса карбоксиме-тилхитозаном до конца не ясен. Есть перспективы клинического использования этого полимера [31]. Авторы исследовали воздействие карбоксиметилхитозана-геля и карбоксиметилхитозана-раствора на заживление ран брюшной стенки и аортального анастомоза у крыс Sprague-Dawley после рассечения аорты в брюшном отделе. Контроль заживления, тензиометрию раневого рубца осуществляли на 4-, 7- и 14-й дни после оперативного вмешательства. Было установлено, что добавление полимеров хитозана в послеоперационном периоде более эффективно, чем в дооперационном периоде. Эффективны как гель хитозана, так и его раствор. Применение этих полимеров приводит к сокращению сроков заживления ран и, таким образом, снижению спаечного процесса в брюшной полости [15].
Большой интерес в настоящее время представляют водорастворимые и водонерастворимые препараты хитозана, дающие вязкие растворы и гели. Проведение детоксикации организма через желудочно-кишечный тракт путем использования сеансов кишечного диализа хитозаном по сравнению с другими известными сорбентами имеет ряд преимуществ:
1. Хитозан имеет уникальную поликатионную фибриллярную структуру и обеспечивает адгезионное сродство к материалам клеточных стенок;
2. Хитозан имеет два типа реакционно-способных групп, создающих возможность проведения более разнообразной их модификации, осуществление строго направленного синтеза производных по ОН- и Ш2-группам. Этот линейный полиамин имеет высокую частоту реактивных ОН- и КН2-групп, может быть нерастворим и растворим в воде при различных рН среды. Дополнительно протонированная аминогруппа является высокоактивной. Эти свойства хитозана позволяют по-новому подойти к коррекции внутренней среды человека, ответственной за детоксикационную функцию.
3. Хитозан является полисахаридом органического происхождения и может использоваться в виде геля с высокой текучестью, обладающего низким раздражающим действием на слизистую оболочку кишки, мукоадгезивен, биосовместим [6, 62], существенно повышает биодоступность труднорастворимых веществ в крови [48, 32, 21], переносит через агрессивные биологические жидкости и выделяет регуляторные факторы роста и белки [10, 19, 28, 29, 30, 43, 44, 54, 71], биодеградирует [27,40, 53, 75,79, 82], имеет чрезвычайно низкую степень токсичности [3, 7, 9, 27, 56, 57,66].
При анализе адгезии полимеров хитозана к слизи (муцину) слизистых оболочек установлено, что сила адгезии снижается при увеличении молекулярной массы хитозана [20]. Известно, что длина полимерных цепочек хитозана влияет на его биологическую активность. Очень короткие цепочки (мономер, пентамер, гептамер) обладают слабой биологической активностью в силу небольшой плотности локальных зарядов при взаимодействии с отрицательными частицами на поверхности мембраны клетки. Точно также хитозаны большого размера обладают слабой биологической активностью при прочих равных условиях (при неизменности других характеристик). Это происходит из-за изменения конфигурации молекулы хитозана (от простой спирали до шарообразной). В этой ситуации большое число реактивных центров молекулы полимера свернуты внутри глобулы и недоступны для клеточной молекулы (клетки ткани, микроба).
Хитозан известен как усиливающий агент векторной проницаемости кишечного эпителия на примере функционирования искусственного моноклеточного слоя Са-со-2 клеток, подобных кишечному эпителию [16, 28]. Было установлено, что хитозан не влияет на проницаемость кишечного эпителия при нейтральной рН среды, а в кислой среде из-за положительного заряда взаимодействует с анионными компонентами гликопротеидов на поверхности эпителиальных клеток и вызывает проницаемость кишечного эпителия [37]. В этой ситуации меняется трасэпителиальная электрорезистентность и электроустойчивость эпителиальных клеток [34]. Присутствие хитозана на клеточной поверхности слизистой оболочки изменяет топографию этой поверхности. Полимер абсорбируется на поверхности клетки и изменяет ее рельеф по сравнению с контрольными веществами [52].
При наличии свободных аминогрупп как свободный хитозан, так и его солевые формы независимо от рН
эффективно повышают абсорбцию белков через слизистую оболочку. Гель хитозана в концентрации 0,5% вызывает слабое повреждение мембраны слизистой оболочки, на что указывают выход в среду следовых количеств лактатдегидрогеназы [69]. Объяснение факта увеличения парацеллюлярного транспорта веществ находят в реакции цитоскелета эпителия. В результате локального перераспределения F-актина изменяется структура и проницаемость апикальных сегментов клеток кишечного эпителия с сохранением изначальной проницаемости базальных мембран. В результате неравномерной и массовой контракции мембран образуются расширенные межклеточные контакты и растет около-клеточная проницаемость маркерных молекул различной молекулярной массы [60]. Дополнительно известно, что при контакте клеток с хитозановым гелем увеличивается активность этих клеток на полимерной подложке по сравнению с активностью клеток без присутствия хитозана [81]. На модели донорского реснитчатого эпителия человека установлено как ex vivo, так и in vivo, что величина транзита веществ через эпителий слизистой оболочки зависит от молекулярной массы хитозана и его количественного содержания. Высокая молекулярная масса и большое количество глутамата хитозана снижают продолжительность транспорта [8]. Карбогидратная основа хитозана взаимодействует с белками клеточных мембран. В комплексе с полифосфатом хитозан легко образует связи с гидрофильными белками клеточной поверхности. Такие взаимодействия не носят ионного характера и играют важную роль в опосредованной транспортировке веществ клетками [80]. При кормлении мышей 2% низкомолекулярными и высокомолекулярными солями хитозана в течение 6 недель установлено, что высокомолекулярные полимеры оказывают дополнительное существенное уменьшение высоты крипт, снижение клеточной пролиферации, окружности крипт эпителия тонкой и толстой кишки (р < 0,05). Молекулярный диапазон и вязкость полимеров влияют на морфологическую картину кишки [76]. Установлено с
14 14
помощью С-маннитола и С-полиэти-ленгликоля усиленное проникновение через монослой клеток кишечного эпителия этих веществ в сторону хитозана. Градиент проницаемости в сторону гидрохлорида хитозана возрос в 34 раза, глутамата хитозана - в 25 раз, N-триметилхитозан хлорида - в 11 раз. При повышении концентрации полимера проницаемость веществ увеличивается. Выявлено, что процесс проницаемости заключается в открытии плотных межклеточных контактов, что существенно усиливает параклеточный транспорт. Важными факторами являются заряд и плотность полимера, структура хитозана и его производные. Эти физикохимические свойства определяют эффективность абсорбции. При повышении степени положительного заряда в полимере усиливается проницаемость гидрофильных макромолекул, таких как полипептиды и белки [33, 36,49,73]. Использование N-триметилхитозан хлорида с разной степенью деацетилирования (20, 40 и 60%) показало, что полимер с низкой степенью деацетилирования является неэффективным абсорбентом и не изменяет величину околоклеточного транспорта, например, декстрана. Повышение степени деацетилирования до 40-60% приводит к росту транспорта мембранопроникающей флюоресцентной метки (визуализация состояния клеточных ядер с помощью красного декстрана Мм 10 KD) [74]. Усиление транспорта сопровождается открытием плотного контакта клеток кишечного эпителия. Вместе с транспортом белков и пептидов в направлении полимера обеспечивается перенос веществ, состоящих с пептидами в комплексе. Кроме того, усиление абсорбции гидрофильных веществ через эпителиальный слой кишки зависит от рН среды. При рН < 7,0 в присутствии гидрохлорида или глутамата хитозана активная трансэпителиальная абсорбция веществ происходит в верхних отделах тонкой кишки. При увеличении ионной силы среды (рН > 7,0) интенсивность абсорбции смещается в нижний отдел тонкой кишки и толстую кишку [35]. Увеличение степени деацетилирования хитозана до 85-99% еще больше усиливает околоклеточный транспорт и эффект абсорбции веществ. В этих условиях высокая абсорбция сочетается с низкой токсичностью [61]. Во всех случаях увеличение концентрации полимера в тонкой кишке приводит к повышению проницаемости эпителия [72]. Кроме того, установлено, что 1% хитозановый гель (N-триметилхитозанхлорид) при введении в 12-перстную кишку существенно повышает биодоступность пептидов в кишечном тракте крыс Wistar. Проницаемость пептидов зависит от модификации полимера, например, от степени триметилирования. Введение пептида в кишку вместе с хитозаном увеличивает его проницаемость с 0,8 до 6-13% [71]. Это может иметь важное значение в механизмах детоксикации при скоплении достаточно большой массы агрессивных ферментов и остатков белковых молекул. При этом обратный транспорт пептидов через эпителиальный покров слизистой оболочки кишки в сторону заряженного хитозана будет сопровождаться перераспределением и связыванием токсического материала. Кроме того, рост биодоступности пептидов в комплексе с хитозаном, например, активированных ферментов может проявляться по отношению к своим субстратам, а это будет приводить к падению уровня их активности.
Результаты исследований
Таким образом, предложенная версия формирования феномена обратной перфузии продуктов фибринозного экссудата от воспалительного очага полости брюшины через стенку кишки в ее просвет в присутствии хитозана была прослежена на модели неосложненного аппендикулярного инфильтрата. У крыс популяции Wistar массой 150200 г моделировался неосложненный аппендикулярный инфильтрат («модель аппендикулярного инфильтрата» -заявка на патент №2001116706/14 (017418), приоритет от 14 июня 2001 г).
Цель работы - принципиальная возможность получения картины деградации аппедикулярного инфильтрата при использовании сеансов энтеросорбции продуктом деацетилированного хитина. Плотный аппендикулярный инфильтрат (пример ограниченного перитонита) через 5 суток после оперативного вмешательства на слепой кишке занимал по объему 20-25% брюшной полости. На пятые сутки послеоперационного периода опытная группа животных (10 крыс) через желудочный зонд получала 3 раза в сутки по 2 мл 1% гелевую формы глутамата хитозана (степень деацетилирования 95%, молекулярная масса 120 KD, Божко B.C., г. Дальнегорск, ЗАО «Восток-Центр»). Контрольную группу животных составили крысы (5 особей), не получавшие какого-либо лечения. Выведение из эксперимента осуществлялось на 6-, 12- и 18-е сутки от начала моделирования. Определялись у животных наличие выпота в брюшной полости, плотность инфильтрата и его объем, наличие спаек на висцеральной и париетальной брюшине. Результаты показали, что на 13-е сутки от момента моделирования заболевания в контроле инфильтрат плотный, занимает до 25-30% объема брюшной полости, имеется наличие массивных фибринозных межкишечных наслоений, свободного выпота в брюшной полости воспалительного характера в значительном количестве, распространенного спаечного процесса по всей брюшной полости, десерозирование покрова кишечных петель при попытке их разъединения. У животных, получавших с диетой хитозан, имеет место наличие плотного инфильтрата такого же объема, как и в контроле, но конгломерат свободно расположен в брюшной полости без признаков диффузного распространения, отсутствует экссудат в полости брюшины. Макроскопическое исследование препаратов на 19-е сутки моделирования выявило, что гелевая форма глутамата хитозана способна устранять воспалительный кишечный конгломерат с наличием единичных рыхлых фибринозных наслоений без признаков абсцедирования, наличием свободно расположенной в брюшной полости слепой кишки с аппендикулярным отростком, отсутствием выпота жидкости. Гистологические срезы ткани слепой кишки представлены на рисунках 1-6 цветной вкладки.
Таким образом, применение хитозановой диеты при ограниченных воспалительных процессах в брюшной полости может быть перспективным в комплексном лечении пациентов с подобной патологией в хирургической или терапевтической клиниках
