CC BY
32
УДК 616.91/98:576.809.7
С.Н.Скопинская, С.П.Ярков, Е.Н.Храмов
ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ЛИПОСОМНОГО ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЯМ ТУЛЯРЕМИИ, ХОЛЕРЫ, БРЮШНОГО ТИФА, САПА И МЕЛИОИДОЗА
Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения, Москва
Разработан метод флуоресцентного липосомного иммуноанализа (ФЛИА) для обнаружения антител (АТ) к возбудителям туляремии, холеры, брюшного тифа, сапа и мелиоидоза на основе липосом, сенсибилизированных поверхностными антигенами микробных клеток, с инкапсулированными маркерами флуоресцентной природы. Проведен анализ возможностей ФЛИА и общих закономерностей построения тест-систем для детекции АТ к возбудителям инфекционных заболеваний бактериальной этиологии. Абсолютная чувствительность метода ФЛИА составляет 25-100 нг/мл иммуноглобулинов класса G. На основе оптимизации условий проведения иммунной реакции созданы тест-системы для выявления АТ, которые по своей чувствительности превосходили применяемые в практике иммунохимические реакции для выявления АТ к возбудителям: туляремии (РПГ А) в 4-160 раз, холеры (реакция агглютинации) в 30-50 раз, сапа и мелиоидоза (реакция иммунодиффузии) в 25-440 раз. Полученные данные могут свидетельствовать о полезности метода ФЛИА для серодиагностики инфекционных заболеваний и оценки эффективности вакцинации.
Ключевые слова: антитела, липосомы, комплемент, бактериальные инфекции, флуоресцентный липосомный иммуноанализ.
Инфекционные болезни, особенно особо опасные инфекции (ООИ), представляют серьезную проблему для жизни людей и животных как в развивающихся, так и в экономически развитых странах. Их наличие и распространение связано с изменившимися социально-экономическими условиями, возможностью завоза возбудителей из развивающихся стран в связи с миграцией населения и в виде зараженных продуктов питания, животных и растений. Кроме того, существует вероятность использования возбудителей ООИ в качестве средств биотерроризма. Для предупреждения инфекционных болезней у людей и животных разработана система профилактических мероприятий, включающая вакцинацию.
Выявление специфических антител (АТ) в биологических пробах может быть важно для оценки эффективности вакцинации, при изучении развития гуморального иммунитета и продолжительности его существования, для постановки диагноза при лабораторной диагностике инфекций.
Для обнаружения АТ используют различные подходы, основанные на взаимодействии антигена с АТ, среди которых наиболее распространенными являются реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и твердофазный им-муноферментный анализ (ТИФА). В основе метода комплементзависимого липосомного иммуноанализа (ЛИА) лежит реакция антигена на поверхности липосом и АТ в растворе, образование иммунных комплексов антиген-АТ с последующей активацией системы комплемента и лизисом липосом. Вытекание из липосом инкапсулированного маркера пропорционально глубине иммунной реакции и может быть использовано для оценки уровня АТ в образце. Методы комплементзависимого ЛИА разработаны для обнаружения различных аналитов: лекарствен-
ных препаратов (теофилин, антиконвульсанты), токсинов (микотоксин, латротоксин, гелонин), гормонов - тироксина Т4, С-реактивного белка и др. [3, 8]. Немногочисленные работы свидетельствуют о возможности использования ЛИА для обнаружения бактериальных АТ, например, к возбудителю сифилиса, менингита или туберкулеза у людей и животных [7, 9, 11]. Авторы отмечают, что ЛИА по своей чувствительности не уступал радиоиммуноанализу [11] и превосходил такие методы, как РПГА [1]. Нами на основе флуоресцентного ЛИА (ФЛИА) разработана тест-система для выявления АТ и поверхностного соматического О-антигена возбудителя сальмонеллеза, которая была использована для диагностики данного заболевания у детей. Проведенные исследования показали повышение эффективности выявления сальмонеллеза при одновременном обнаружении с помощью ФЛИА антигенного материала и специфических АТ [6].
Целью работы явился сравнительный анализ возможностей метода ФЛИА для обнаружения АТ к возбудителям брюшного тифа, о также таким ООИ, как туляремия, холера, сап и мелиоидоз, выявление общих закономерностей построения тест-систем на основе ФЛИА для детекции АТ к возбудителям инфекционных заболеваний бактериальной этиологии.
Материалы и методы
В работе использовали яичный фосфатидилхо-лин, холестерин, трис и дицетилфосфат «Serva», кальцеин, сульфородамин 101, сульфородамин В, дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), липополи-сахариды (ЛПС) из Vibrio cholerae Inaba 569B, Salmonella typhi, тритон Х-100 («Sigma»), сефадекс LH-20 («Pharmacia»). Для очистки кальцеина применяли хроматографию на сефадексе LH-20. Сульфородами-
ны 101 и В использовали без дополнительной очистки. ЛПС из Francisella tularensis получен из ОАО «Институт инженерной иммунологии». Аг8 и антисыворотки к возбудителям сапа и мелиоидоза получены из Волгоградского НИПЧИ. Также в работе использовали коммерческие антисыворотки: сальмо-неллезные, шигеллезные, эшерихиозные, бруцеллезные, чумные, туляремийные, полученные из Рос-НИПЧИ «Микроб» (Саратов), Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока, НИИ вакцин и сывороток (Санкт-Петербург), НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (Москва).
В качестве источника комплемента использовали лиофильно высушенную сыворотку крови морской свинки (ФГУ «Иммунопрепарат», Уфа). Остальные реактивы были отечественного производства с чистотой «хч» и «чда».
Липосомы получали по методу обращения фаз [10] из смеси липидов: яичный фосфатидилхолин -холестерин - дицетилфосфат в молярном соотношении 2:1,5:0,22. В отдельных опытах вместо яичного фосфатидилхолина к липидной смеси добавляли ДПФХ. Водная фаза при формировании липо-сом содержала кальцеин (150-175 мМ), сульфоро-дамин 101 (100 мМ) или сульфородамин В
(100 мМ). Не включившийся внутрь липосом маркер удаляли центрифугированием при 150000§ в течение 40 мин. Осадок суспендировали до концентрации 3-10 мкмоль липида/мл в трис-солевом буфере состава 0,02 М трис-НС1, 0,15 М КаС1 (pH 7,5) и хранили при +4 - +8 °С.
Постановку реакции иммунного лизиса проводили, как описано ранее [2, 4, 5]. Для оценки сохранности структур липосом во времени определяли количесство внешнего маркера, которое рассчитывали как
К
-100%' р*
где Бф - фоновая флуоресценция липосом в буфере; Боб - флуоресценция после полного разрушения липосом 1 % тритоном Х-100. Все измерения интенсивности флуоресценции проведены в единых условиях и при единых значениях усиления флуоримет-ра, как описано ранее [4].
Результаты и обсуждение
Основным компонентом тест-систем на основе ФЛИА являются иммунолипосомы с инкапсулированным флуоресцентным маркером, поверхность которых сенсибилизирована антигеном, способным реагировать со специфическими АТ. Для формирования иммунолипосом использовали поверхностные антигены липополисахаридной природы возбудителей туляремии, холеры и брюшного тифа и глико-протеидный Аг8, характерный для вирулентных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Липосо-мы получали методом обращения фаз с добавлением антигена в водную фазу. Также в водную фазу вводили флуоресцентный маркер в концентрации, обеспечивающей самотушение флуоресценции во внутреннем объеме липосом (кальцеин 150-175 мМ, сульфородамины 101 или В - по 100 мМ). Такая концентрация флуоресцентного маркера обеспечи-
Рис. 1. Зависимость иммунного лизиса липосом, сенсибилизированных ЛПС F. tularensis, от разведения антисыворотки: Инкубационная смесь содержала 10 нмоль (1) или 1,2 нмоль (2) липида липосом, комплемент и антисыворотку к F. tularensis;
10 % лизис липосом (3).
Использовали липосомы с инкапсулированным кальцеином. По оси абсцисс - разведение антисыворотки; по оси ординат - % лизиса липосом.
вала прирост сигнала флуоресценции после разрушения липосомной суспензии в 5,0-45,0 раз.
На рис. 1 представлены характерные кривые титрования антисыворотки к возбудителю туляремии в присутствии комплемента при использовании липосом, сенсибилизированных ЛПС из F. шШ^п-sis. Видно, что кривые зависимости величины иммунного лизиса липосом от разведения антисыворотки имеют колоколообразную форму с максимумом при низких разведениях антисыворотки, а уменьшение содержания АТ в пробе сопровождается снижением величины иммунного лизиса. За титр сыворотки в ФЛИА мы принимали то ее разведение, которое обеспечивало 10 % от максимального лизис липосом после их разрушения детергентом. Отсутствие лизиса в неполной реакционной смеси (без АТ или комплемента), в присутствии инактивированного препарата комплемента или с липосомами без антигена, свидетельствует о специфическом характере иммунной реакции.
Установлено, что параметры тест-систем на основе ФЛИА, в первую очередь их чувствительность, в значительной степени зависят от оптимальных условий проведения иммунолитической реакции. Для реакции комплементзависимого лизиса к таким параметрам нужно отнести получение иммунолипо-сом, эффективно участвующих в иммунной реакции, выбор препарата антигена и его сенсибилизирующей концентрации, количества липосом и препарата комплемента в пробе, а также времени и температуры проведения реакции, обеспечивающих максимальный иммунный ответ.
Для ЛПС-антигенов возбудителей холеры и брюшного тифа показано, что максимальный им-
Основные характеристики реакции иммунного лизиса липосом, сенсибилизированных бактериальными антигенами
Антиген Иммунный лизис
Возбудитель Вид Химическая обработка Концентрация антигена в липосомах, мкг/мкмоль липида Время, мин Кол-во комплемента в реакционной смеси, мкл Максимальная величина, %
Туляремии ЛПС Без обработки 300 30-б0 2,5-5 81,0±9,4
Туляремии Фрагменты внешних мембран клеточных стенок Без обработки 500 15 5 88,4±8,7
Холеры ЛПС 0.1 М №ОН, 96 °С 250 5-10 5-10 95,0±5,0
Брюшного тифа ЛПС 0.1 М №ОН, 96 °С 250 10-15 2-5 91,8±7,6
Сапа, мелиоидоза Г ликопротеин Аг8 Без обработки 100 30-45 2-10 81,4±12,3
Примечание. Использовали липосомы из яичного лецитина, холестерина и дицетилфосфата. Реакцию иммунного лизиса липосом проводили при 30 °С, общий объем реакционной смеси 100 мкл.
мунный лизис и титр АТ в ФЛИА повышаются при использовании обработанного щелочью ЛПС и увеличении его концентрации до 250 мкг/мкмоль липида липосом (таблица). ЛПС из F. tularensis был неустойчив к действию щелочи, что определило его использование в необработанном виде и максимальный ответ в ФЛИА получен с липосо-мами, для формирования которых использовали 300 мкг/мкмоль липида ЛПС. На примере возбудителя туляремии показана возможность применения ЛПС в чистом виде и в виде фрагментов внешних мембран клеточных стенок F. tularensis. В последнем случае максимальный иммунный лизис получен при сенсибилизации липосом 500 мкг/мкмоль липида, что соответствует содержанию чистого ЛПС 100-150 мкг/мкмоль липида. При разработке варианта ФЛИА для обнаружения АТ к возбудителям сапа и мелиоидоза оптимальным оказалось использование Аг8 в концентрации 100 мкг/мкмоль липида липосом (таблица).
Из данных рис. 1 видно, что снижение содержания липосом в пробе от 10 до 1,2 нмоль липида при прочих одинаковых условиях повышает титр выявляемых АТ к возбудителю туляремии от 1:1280 до 1:10240, что в 160 раз выше титра данной сыворотки в РПГА.
Для всех исследованных тест-систем установлено, что увеличение концентрации комплемента и времени инкубации способствует обнаружению АТ в более высоком титре. Наиболее «быстрой» реакцией был комплементзависимый лизис липосом, сенсибилизированных ЛПС возбудителя холеры (510 мин), а самой «медленной» - лизис липосом, полученных в присутствии Аг8 или ЛПС возбудителя туляремии (30-60 мин) (таблица). Здесь нужно отметить существенно более быструю кинетику реакции комплементзависимого лизиса липосом, сенсибилизированных фрагментами внешних мембран F. tularensis. Так, в течение первых 5 мин реакции выход кальцеина из этих препаратов липосом составил 80-87 % от максимального выхода маркера за счет иммунной реакции, по сравнению с 15-35 % в опытах с липосомами, сенсибилизированными истинным ЛПС. Для липосом, полученных в присутствии препаратов внешних мембран возбудителя туляремии, максимальный ответ зарегистрирован через 15 мин инкубации с комплементом.
Поскольку действие комплемента на мембрану опосредовано как через протекающие в растворе
ферментативные реакции, так и процессы, происходящие на (формирование комплекса АТ-антиген-СЦ) и в мембране (образование мембранных пор), конечный результат мембранолитического действия комплемента может зависеть от температуры и физического состояния мембранных липидов. Для изучения влияния температуры на эффективность обнаружения АТ методом ФЛИА использовали липосомы, сенсибилизированные ЛПС F. tularensis и приготовленные из смеси холестерина, дицетил-фосфата и фосфатидилхолинов с различной температурой фазового перехода (Тт) - фосфатидилхоли-на (Тт = 0 - -4 °С) и ДПФХ (Тт = 41,4 °С). Из данных рис. 2 видно, что повышение температуры реакционной смеси усиливает иммунный ответ с максимальным эффектом при 33-35 °С для липосом, содержащих яичный фосфатидилхолин (рис. 2, кривая 1), и 37-39 °С в опытах с липосомами с ДПФХ (рис. 2, кривая 2). Для липосом из яичного лецитина показано отсутствие иммунного лизиса при температурах <10 °С, а для липосом из ДПФХ - при более высоких температурах < 23 °С.
С целью оценки специфичности ФЛИА в реакционную смесь вместо препаратов гомологичных АТ вводили АТ, полученные к другим микроорга-
Рис. 2. Зависимость иммунного лизиса липосом, сенсибилизированных ЛПС F. tularensis, от температуры инкубационной смеси:
Инкубационная смесь содержала липосомы из холестерина, дицетилфосфата и яичного фосфатидилхолина (1) или ДПФХ (2), комплемент и антисыворотку к F. tularensis. Использовали липосомы с инкапсулированным сульфородамином 101.
По оси абсцисс - температура в °С; по оси ординат - % лизиса липосом
б9
низмам. Установлено отсутствие или слабо выраженный комплементзависимый лизис липосом с сыворотками к гетерологичным возбудителям. Для липосом с Аг8 можно выделить только иммуноглобулины против поверхностного антигена возбудителя чумы, максимальный иммунный лизис в присутствии которых составил 27,5 %, хотя значения титра были невысокими (1:30). Сенсибилизированные ЛПС S. typhi липосомы реагировали с антисыворотками, полученными к Salmonella typhimurium или Salmonella paratyphi, что обусловлено наличием у О-антигенов этих микроорганизмов общих рецепторов (рецептор 0-12).
Используемые для создания тест-систем препараты липосом должны быть стабильными при проведении реакции в присутствии других иммунных компонентов (содержащие АТ образцы, комплемент) и при хранении. Для придания мембранам жесткости в состав липидной смеси вводили холестерин в высокой концентрации (40 мол. % от суммарного содержания липидов). Дицетилфосфат обеспечивал отрицательный заряд поверхности мембран липосом, что понижало способность суспензии липосом к агрегации.
Сенсибилизированные бактериальными антигенами липосомы указанного выше липидного состава с инкапсулированными во внутренний объем флуоресцентными маркерами сохраняли свои физико-химические и иммунохимические свойства в течение 3,5-9,0 мес. в трис-солевом буфере при +4 -+8 °С. Хранение липосом в атмосфере инертного газа снижало скорость вытекания флуоресцентного маркера, что связано с замедлением перекисного окисления липидов, формирующих мембраны липо-сом. Липосомы, приготовленные из липидной смеси, содержащей ДПФХ, оказались более стабильными при хранении, чем липосомы из яичного фос-фатидилхолина. В пользу большей стабильности «жестких» мембран, содержащих ДПФХ, говорит также низкий уровень или отсутствие неспецифического разрушения мембран в процессе иммунной реакции только комплементом или специфическими АТ. Для липосом с ДПФХ доля разрушенных таким образом липосом составляет 0-5 %, в отличие от 10-40 % лизиса липосом из яичного фосфатидилхо-лина. Поскольку возможен выход маркера из липо-сом под влиянием одного из компонентов иммунной реакции (комплемента или препарата АТ), мы предлагаем проводить расчет величины иммунного лизиса (А) по формуле, которая учитывает неспецифическое действие каждого компонента:
А =Рим-[Рат+(Рк-Гф)] .1(Ю%
F06 "^ф
где: Бим - соответствует интенсивности флуоресценции образца, содержащего липосомы, АТ и комплемент; Бат и Бк - флуоресценция образца, содержащего липосомы и АТ или комплемент; Бф - фоновая флуоресценция липосом в буфере; Fo6 - флуоресценция после разрушения липосом 1 % тритоном Х-100. В отсутствие неспецифического лизиса ли-посом из ДПФХ под влиянием только комплемента или сыворотки расчет величины иммунного лизиса можно проводить по формуле
р -Б
д = ^<—Ё_.100о/о,
Роб ' Рф
что позволяет существенно упростить процедуру проведения анализа и получения результатов.
На основе липосом, поверхность которых сенсибилизирована бактериальными антигенами, разработан метод ФЛИА для выявления специфических АТ к возбудителям туляремии, холеры, брюшного тифа, сапа и мелиоидоза. Определены оптимальные условия формирования липосом с выраженной иммунохимической активностью, обеспечивающей высокую чувствительность и специфичность обнаружения АТ в отношении исследованных возбудителей. Показано, что эффективность выявления АТ в значительной степени определяется условиями, обеспечивающими максимальный иммунный лизис липосом, величина которого, среди прочих факторов, зависит от количества иммобилизованного на поверхности липосом антигена, способного реагировать с АТ. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что антигены липополисахаридной природы могут быть применены как в виде очищенного препарата, так и в виде фрагментов внешних мембран клеточных стенок бактерий. Использование фрагментов внешних мембран клеточных стенок бактерий позволяет снизить сенсибилизирующую липосомы дозу антигена и обеспечивает более быстрое протекание иммунолитической реакции. Этот факт, скорее всего, связан с тем, что в препаратах внешних мембран клеточных стенок бактерий ЛПС находится в нативном состоянии, сохранность антигенных детерминант в этих препаратах выше, по сравнению с препаратом ЛПС, выделенного водно-фенольной обработкой из бактериальной массы клеток возбудителя. Наличие сохранных антигенных детерминант безусловно влияет на эффективное взаимодействие со специфическими АТ. При использовании очищенного препарата ЛПС эффективность работы иммунолипосом повышается с ростом его сенсибилизирующей концентрации, а также после предварительного щелочного гидролиза, в результате которого происходит удаление части жирных кислот липида А. Изменение в результате щелочного гидролиза гидрофильно-липофильного баланса ЛПС улучшает его способность к включению в липидный бислой липосом.
Для гликопротеинового Аг8 возбудителей сапа и мелиоидоза впервые показана возможность его введения в поверхность липосом с сохранением иммунохимических свойств. Поскольку Аг8 является поверхностным гликопротеином, можно предположить, что важную роль в определении его связи с мембраной и ориентации играет основной полисахаридный компонент (-90-97 %) Аг8, хотя нельзя исключить и участие в заякоривании в мембране гидрофобных участков полипептидных цепей белковых компонентов Аг8.
Представленные данные свидетельствуют о том, что липидный состав влияет как на стабильность липосомных препаратов, так и на характеристики иммунной реакции (температурный диапазон, время реакции и количество комплемента), обеспечивающие максимальную величину иммунного ли-
зиса, а следовательно, и чувствительность анализа.
Липосомы, содержащие яичный фосфатидилхо-лин, пригодны для проведения ФЛИА при комнатной температуре. Липосомы из ДПФХ иммунохимически неактивны при температурах < 23 °С, что делает невозможным проведение ФЛИА при комнатной температуре. В то же время липосомы из ДПФХ стабильны при хранении и проведении анализа даже при высоких (37 °С) температурах. Для обоих типов липосом установлено, что температура инкубационной среды влияет на эффективность работы системы комплемента - ее повышение усиливает реакцию и уменьшает количество комплемента, необходимое для достижения максимального иммунного лизиса. Скорее всего, отмеченные закономерности в первую очередь отражают повышение с температурой скорости ферментативных стадий процесса активации комплемента.
Разработанные нами на основе ФЛИА лабораторные образцы тест-систем для выявления специфических АТ к антигенам возбудителей инфекционных болезней включают следующие ингредиенты: липосомный реагент, представляющий собой суспензию липосом, сенсибилизированных поверхностным антигеном соответствующего возбудителя и содержащих внутри флуоресцентный маркер, лиофильно высушенный препарат комплемента морской свинки или кролика, трис-солевой буфер, трис-солевой буфер с ионами Mg2+ и Са2+, 1 % водный раствор детергента тритон Х-100.
Метод ФЛИА является экспрессным, длительность реакции составляет 15-60 мин, относится к числу гомогенных методов, в котором отсутствуют стадии сепарации реагентов, что выгодно отличает его от ТИФА. Проведение ФЛИА предусматривает смешивание иммунных компонентов, включающих липосомы, исследуемый образец и препарат комплемента, инкубацию смеси, и регистрацию результатов анализа по нарастанию флуоресценции маркера в реакционной смеси. Метод характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов. В качестве флуоресцентных маркеров могут быть применены не только использованные в наших работах кальцеин, сульфородамин 101, сульфородамин В, но и другие флуоресцентные соединения.
Абсолютная чувствительность метода ФЛИА составляет 25-100 нг/мл иммуноглобулинов класса О. Разработанные нами тест-системы ФЛИА превосходили по титру традиционные иммунохимические реакции выявления АТ против возбудителей: туляремии (РПГА) в 4-160 раз, холеры (реакция агглютинации) в 30-50 раз, сапа и мелиоидоза (реакция
иммунодиффузии) - в 25-440 раз. Эти данные свидетельствуют о полезности метода ФЛИА для серодиагностики инфекционных заболеваний и оценки эффективности вакцинации. В то же время возможности ФЛИА для выявления АТ к возбудителю брюшного тифа, по-видимому, уступают таким методам, как ТИФА и агглютинационные тесты.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Власов Г.С., Точилин В.П., Гремякова Т.А. и др. // Журн. микробиол. - 1985. - № 8. - С. 87-91. - 2. Ско -пинская С.Н., Тамулевич Я.А., Ярков С.П. и др. // Журн. микробиол. - 1993. - № 1. - С. 77-82. - 3. Скопинская С.Н., Ярков С.П. // Иммунология. - 1996. - № 2. - С. 6-12. -4. Скопинская С.Н., Ярков С.П., Храмов Е.Н. и др. // Вестник РАМН. - 2000. - № 10. - С. 19-24. - 5. Скопинская С.Н., Ярков С.П., Храмов Е.Н. // Прикл. биохим. микробиол. - 2005. - Вып. 41 (2). - С. 228-234. - 6. Ярков С.П., Скопинская С.Н., Милютина Л.Н. // Иммунология. -1997. - № 4. - С. 59-62. - 7. Legros F., Castillo M., Praet M. et al. // J. Immunol. Meth. - 1988. - Vol. 108. - P. 223-230. -
8. Rongen H.A.H., Bult A., van Bennekom W.P. // J. Immunol. Meth. - 1997. - Vol. 204. - P. 105-133. -
9. Rosenqvist E., Vistnes A.I. // J. Immunol. Meth. - 1977. -Vol. 15. - P. 147-155. - 10. Szoka F., Papahadjopoulos D. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1978. - Vol. 75, N 9. - P. 41944198. - 11. Vistnes A.I., Rosenquist E., Froholm L.O. // J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 18, N 4. - P. 905-911.
S.N.Skopinskaya, S.P.Yarkov, E.N.Khramov
Application of the Fluorescent Liposome Immunoassay to Reveal Antibodies Against Tularemia, Cholera, Typhoid Fever, Glanders, and Melioidosis
State Scientific Research Institute of Biological Instrument Construction, Moscow
A method of fluorescent liposome immunoanalysis (FLIA) was developed for detecting antibodies (Ab) against the pathogens of tularemia, cholera, typhoid fever, glanders, and melioidosis on the basis of liposomes sensitized with surface antigens of the microbial cells containing encapsulated fluorescent markers within them. Potential capacities of FLIA were analyzed from the point of view of general laws considered in constructing test systems to detect Ab against the agents of bacterial infectious diseases. Absolute sensitivity of the FLIA techniques was 25 to 100 ng/ml of the G class immunoglobulins. The optimized conditions of the immune response served as a basis for the development of several Ab detection test-systems, surpassing in their sensibility the immunochemical reactions routinely used to demonstrate the presence of Ab against bacterial pathogens: PHAT in tularemia, 4 to 160-fold; agglutination test in cholera, 30 to 50-fold; immunodiffusion test in glanders and melioidosis, 25-440 times. The data thus obtained may be indicative of the practicability of the FLIA test when applied for serodiagnosis of infectious diseases and evaluating vaccination efficiency.
Key words: antibodies, liposomes, complement, bacterial infections, fluorescent liposome immunoassay.
nocTynn^a 09.03.07.
