CC BY
27
УДК 619:616.9:615-022.532
Ключевые слова: монтмориллонитовый препарат, сорбция эшерихий и сальмонелл, адгезия, профилактика инфекционных заболеваний
Key words: montmorillonite preparation, sorption of Escherichia and salmonella, adhesion, preventive maintenance of infectious diseases
Буханов В. Д., Везенцев А. И., Антипов А. А., Федорова М. З., Воловичева Н. А., Пономарева Н. Ф., Сафонова Н. А., Козубова Л. А.
ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВИРОВАННОЙ МОНТМОРИЛЛОНИТОВОЙ ГЛИНЫ В ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ЦЫПЛЯТАХ-БРОЙЛЕРАХ, ЗАРАЖЕННЫХ КОЛИБАКТЕРИОЗОМ И САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ
USING OF ACTIVATED MONTMORILLONITE CLAY IN ACUTE EXPERIMENT ON BROILER CHICKENS, INFECTED WITH COLIBACILLOSIS AND SALMONELLOSIS
'ФГОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ») Адрес: 308015, Белгородская обл., г. Белгород, ул. Победы, 85
'Federal state autonomous institution of higher education "Belgorodstate national research university" (NRU "BSU") Address: 308015, Russia, Belgorod region, Belgorod, Pobeda street, 85 2ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» РАСХН Адрес: 141311, Московская обл., Сергиево-Посадский район, г. Сергиев Посад, ул. Птицеградская, 10
2State Scientific Institution "All-Russian Poultry Research and Technological Institute" of the RAAS Address: 141311, Russia, Moscow region, Sergiev Posad district, Sergiev Posad, Pticegradskaya street, '0 3ЗАО «АгроБелСервис» / Адрес: 308010, Белгородская обл., г. Белгород, пр. Б. Хмельницкого, 137, к. 3, оф. 1.
E-mail: [email protected] 3Close Joint-Stock Company "AgroBelService"/Address: 308010, Russia, Belgorod region, Belgorod, B. Khmelnitsky Avenue, 137, block 3, office 1. E-mail: [email protected]
Буханов Владимир Дмитриевич, к. в. н., доцент каф. медико-биологических основ физической культуры1
Bukhanov Vladimir D., Ph.D., Associate Professor of the Dept. of Medical and Biological Bases of Physical Training' Везенцев Александр Иванович, д. т. н., проф., зав. каф. общей химии1 Vezentsev Alexander I., Doctor of Engineering Science, Professor, Head of General Chemistry Dept.' Антипов Александр Александрович, ст. науч. сотрудник лаборатории оценки кормовых средств отдела кормления сельскохозяйственной птицы2, генеральный директор3 Antipov Alexander A., Senior Research Assistant of the Fodder Means Evaluation Laboratory of the Poultry Feeding Dept.2, General Director3 Федорова Марина Зотовна, д. б. н., проф., зав. каф. анатомии и физиологии живых организмов1 Fedorova Marina Z., Doctor of Biology Science, Professor, Head of Anatomy and Physiology of Organisms Dept.' Воловичева Наталья Александровна, к. т. н., ст. преподаватель каф. общей химии1 Volovicheva Natalia A., Ph.D., Senior Lecturer of General Chemistry Dept.' Пономарева Надежда Федоровна, аспирант каф. общей химии1 Ponomareva Nadyezhda F., Postgraduate of General Chemistry Dept.' Сафонова Наталья Александровна, соискатель каф. общей химии1 Safonova Natalia A., Competitor for Science Degree of General Chemistry Dept.' Козубова Лариса Алексеевна, к. б. н., доцент каф. медико-биологических основ физической культуры1 Kozubova Larisa A., Ph.D., Associate Professor of the Dept. of Medical and Biological Bases of Physical Training'
Аннотация. Одним из перспективных методов лечения животных является применение сорбентов в сочетании с химиотерапевтическими соединениями. Разработанная литиевая форма монтмориллонитовой глины легко адсорбируется на поверхности фимбрий и клеточной стенке эшерихий, препятствуя адгезии кишечной палочки на эпителиальных клетках брюшины цыплят-бройлеров, что в свою очередь сдерживает их дальнейшее размножение.
Summary. The application of sorbents combined with chemotherapeutic compounds is one of the promising methods of animal treatment. The developed lithium form of montmorillonite clay is easily absorbed on the surface of pili and cell wall of Escherichia interfering adhesion of E.coli on epithelial cells of peritoneum of broiler chicken which in turn hinders their further multiplication.
Введение сельскохозяйственных животных, страдаю-
Длительное использование антибактери- щих бактериальными заболеваниями орга-альных препаратов при терапии молодняка нов пищеварения, часто провоцирует затяж-
ное, а в ряде случаев хроническое течение заболевания. В основе избирательного действия антибактериальных препаратов лежат два основных механизма селективного влияния: подавление активности специфических ферментов (Р-лактамы ингибируют карбок-сипептидазы, фторхинолоны - топоизоме-разы) и связывание с уникальными структурными элементами (например, макролиды соединяются с рибосомами, не являясь прямыми ферментативными ингибиторами) [4].
Однако высокая стоимость лекарственных средств, развивающаяся в некоторых случаях резистентность возбудителей, имму-нодепрессивные свойства антибактериальных препаратов, нарушения микроэкологии и возрастание этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов под влиянием терапевтических средств побуждают исследователей к поиску новых путей оптимизации лечебного процесса [2, 3].
Одним из перспективных методов санации внутренней среды организма является применение сорбентов в сочетании с химио-терапевтическими соединениями. Сорбенты осуществляют местную детоксикацию, обладают антиадгезивным действием по отношению к патогенной микрофлоре и тем самым сокращают сроки лечения больных животных [1, 2, 3].
Адсорбционная способность монтморил-лонитовых глин обусловлена их слоистой структурой. Такого рода адсорбенты обычно имеют большую удельную поверхность -до нескольких сотен м2/г. Если увеличить расстояние между элементарными структурными пакетами монтмориллонита, можно существенно повысить удельную поверхность глины и тем самым ее адсорбционные свойства. Лечебное действие монтморилло-нитсодержащих препаратов объясняется их сорбционно-адгезивными и ионоселектив-ными свойствами, а также насыщенностью разнообразными химическими элементами, часть из которых находится в биологически доступной форме. Сорбент связывает токсины, микробные клетки и продукты распада, которые далее выводятся из организма.
В связи с вышесказанным представляет интерес испытание литиевой формы сорбен-
та, разработанной группой исследователей НИУ «БелГУ» под руководством профессора А. И. Везенцева. В процессе комплексного переструктурирования минералов, слагающих монтмориллонитовые глины Белгородской области, включающего: обогащение, кислотную обработку и внедрение между слоями монтмориллонита ионов лития -была получена новая, с улучшенной адсорбционной способностью, наноструктурная форма сорбента. Это порошок со светло-зеленоватым оттенком с размером частиц до 1 мкм, с развитой мезо-, макропористой структурой, с преимущественным размером пор 10-100 нм и высокой удельной поверхностью до 300 м2/г. Вследствие низкого содержания лития сорбент не токсичен для животных, не обладает кумулятивными свойствами: эмбриотоксичность, тератоген-ность, раздражающее действие на слизистые оболочки экспериментально не установлены. Он связывает и выводит из организма токсичные вещества; оптимизирует обмен белков, липидов, жизненно важных микроэлементов; способствует всасыванию витаминов пищеварительной системой, нормализует функцию кишечника, повышает неспецифическую резистентность организма, положительно влияет на продуктивность и воспроизводительные функции животных. При этом улучшается биологическая ценность и экологическая чистота продукции животноводства.
Целью данного исследования являлось изучение возможности наноструктурной литиевой формы сорбента подавлять способность эшерихий проявлять свои болезнетворные свойства и оценка терапевтического влияния данного сорбента, включенного в комплексное лечение цыплят-бройлеров с экспериментально воспроизведенным сальмонеллезом.
Материал и методы исследований
Ранее нами in vitro было установлено, что цидное действие унифицированной литиевой формы наноструктурного монтморил-лонитсодержащего сорбента в отношении Escherichia coli и Salmonella enteritidis проявляется соответственно в концентрациях 25 и 50 мг/мл [5]. Также была определена МПК
норфлоксацина в отношении Escherichia coli и Salmonella enteritidis, которая составила 0,1 мкг/мл.
Опыты были поставлены на цыплятах-бройлерах кросса «Хаббард Ф-15». Эксперименты выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС). Исследования были выполнены в виварии Белгородского отдела Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко» Российской академии сельскохозяйственных наук.
Опыты проводили методом групп, которые формировали по принципу аналогов с учетом кросса, живой массы, возраста. Цыплята-бройлеры всех групп содержались в специально оборудованных клетках.
Кормление птицы осуществляли вволю сухими сбалансированными комбикормами с параметрами питательности, соответствующими рекомендуемым нормам кормления ГНУ «ВНИТИП» [4]. Условия проведения экспериментов (микроклимат, освещенность, вода и другие факторы) и все технологические показатели (плотность посадки птицы, фронты кормления и поения и т. д.), не являющиеся предметом изучения при проведении исследований, поддерживали в соответствии с общепринятыми и действующими на период проведения опытов рекомендациями ГНУ «ВНИТИП» [5] и нормативам для данного кросса [6].
Выяснение эффективности литиевой формы сорбента подавлять способность эшери-хий проявлять свои болезнетворные свойства проводили на трех группах цыплят-бройлеров (по 50 голов в каждой). Для заражения цыплят-бройлеров на стерильном изотоническом растворе натрия хлорида готовили соответствующие инокуляты. Первой группе вводили суспензию сорбента в концентрации 50 мг/мл, второй - сорбента и Escherichia coli в соответствующих концентрациях 50 мг/ мл и 0,5*108 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц), в третьей присутствовала только взвесь эшерихий в концентрации 0,5*108 КОЕ/мл. После тщательного суспендиро-
вания и 20-минутной экспозиции каждую суспензию фильтровали через стерильный бумажный фильтр «синяя лента». Затем цыплятам-бройлерам первой, второй и третьей групп внутрибрюшинно вводили по 1 мл соответствующих фильтратов.
Во втором опыте по оцениванию терапевтического влияния данного сорбента в сочетании с норфлоксацином использовали 250 цыплят, экспериментально зараженных суточной культурой Salmonella enteritidis. Из них было сформировано три опытные и две контрольные группы по 50 голов в каждой.
Цыплятам-бройлерам первой, второй опытных групп и четвертой (контрольной) внутрибрюшинно инъецировали по 0,5 мл культуры Salmonella enteritidis, содержащей 1,5*108 КОЕ. Цыплятам-бройлерам третьей опытной и пятой (контрольной) групп вводили в брюшную полость 0,5 мл суспензии сальмонелл и катионзамещенной формы монтмориллонитсодержащей глины.
Перед заражением на стерильном изотоническом растворе натрия хлорида готовили суспензию сальмонелл (3*108 КОЕ/мл), а также взвесь сальмонелл (3*108 КОЕ/мл) и исследуемого сорбента (50 мг/мл). Приготовленные инокуляты тщательно перемешивали и после 20-минутной экспозиции фильтровали через стерильный бумажный фильтр «синяя лента». Затем полученные фильтраты с помощью шкалы стандарта мутности McFarland подвергли исследованию на наличие количества микробных клеток в одном мл. Концентрация микробных клеток в суспензии из сальмонелл осталась прежней, а во взвеси культуры сальмонелл и сорбента, по сравнению с исходной, она существенно снизилась и составила 0,3*108 КОЕ/мл. Уменьшение числа микробных клеток связано с тем, что образовавшиеся крупные частицы сорбата -«микроорганизм-сорбент» - не смогли пройти через поры фильтровальной бумаги. После заражения опытных цыплят-бройлеров сразу подвергли лечению норфлоксацином. Цыплятам первой и третьей групп его вводили орально с помощью зонда в дозе 5 мг/ кг живой массы, а второй - в дозе 10 мг/кг живой массы. Препарат принудительно выпаивали один раз в день в течение пяти суток.
С целью выяснения взаимодействия литиевой формы монтмориллонитовой глины с поверхностью фимбрий и клеточной стенки эшерихий суспензию экспериментального препарата в концентрации 50 мг/ мл окрашивали родамином Б. Далее в этот раствор, содержащий 0,01 % родамина Б, вносили взвесь кишечной палочки из расчета 0,5*108 КОЕ/мл. После суспендирования и 20-минутного отстаивания надосадочную жидкость микроскопировали с помощью конфокального лазерного сканирующего
микроскопа Nikon Digital Eclipse Ti-E (длина волны - 488 нм, объектив 60х). Для сравнения в растворе родамина Б окрашивали культуру кишечной палочки.
Результаты исследований и обсуждение
На вторые сутки цыплята-бройлеры первой и второй групп, которым соответственно вводили суспензии чистого экспериментального препарата и в сочетании с кишечной палочкой, выглядели здоровыми, поедаемость корма соответствовала норме. В третьей
Группа, голов Культура, препарат, кратность введения Способ введения, доза, мг/кг Пало цыплят-бройлеров, голов Выжило Суммарная продолжительность жизни, критерий достоверности
сутки голов % сУток P
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Опыт
I 10 S. enteritidis однократно, норфлоксцин (0,1%-й р-р) 1 раз в день 5 суток подряд В/б, 0,5 мл 1,5^108 КОЕ Per os 5 мг/кг 10 10 30 60 340 < 0,01
II 10 S. enteritidis однократно, норфлоксцин (0,1%-й р-р) 1 раз в день 5 суток подряд В/б, 0,5 мл 1,5^108 КОЕ Per os 10 мг/кг 5 10 35 70 385 < 0,01
III 10 S. enteritidis + экспериментальный препарат однократно, норфлоксцин (0,1%-й р-р) 1 раз в день 5 суток подряд В/б, 0,5 мл 1,5^108 КОЕ Per os 5 мг/кг 50 100 500 < 0,01
Контроль
IV 10 S. enteritidis однократно В/б, 0,5 мл, 1,5^108 КОЕ 20 10 5 5 10 0 0 125
V 10 S. enteritidis + экспериментальный препарат однократно В/б, 0,5 мл, 15^108 КОЕ 5 5 5 5 30 60 415 < 0,01
Таблица 1.
Лечебная эффективность комплексного применения литиевой формы экспериментального препарата с норфлоксацином при заражении цыплят-бройлеров
Salmonella enteritidis
группе, инфицированной чистой культурой эшерихий, десять цыплят пало, а у остальных отмечалось угнетенное состояние, хромота и ухудшение аппетита. У павшего цыпленка был установлен острый колибак-териоз с множественными кровоизлияниями на серозных оболочках и во внутренних органах. Из селезенки и печени этого павшего цыпленка была выделена исходная культура кишечной палочки. В течение последующего 10-суточного наблюдения падежа цыплят-бройлеров во всех группах не наблюдали, аппетит и самочувствие соответствовали физиологическим нормам.
В связи с вышеприведенными результатами полученных исследований следует признать, что введение цыплятам-бройлерам в брюшную полость профильтрованной суспензии разработанной литиевой формы экспериментального препарата не способствует раздражению и воспалению брюшины и серозных оболочек. По истечении 10 суток, при вскрытии цыплят первой группы, в брюшной полости отсутствовали признаки воспаления.
Отсутствие клинического проявления эшерихиоза во второй группе цыплят-бройлеров объясняется способностью экспериментального препарата препятствовать адгезии кишечной палочки на эпителиальных клетках брюшной полости цыплят, что в свою очередь сдерживает их дальнейшее размножение. Подтверждением этому служит микроскопия соскобов с брюшины цыплят-бройлеров второй группы, предварительно промытой стерильным изотоническим раствором натрия хлорида, в которых Escherichia coli не обнаруживалась.
В опыте по выяснению терапевтического влияния исследуемого сорбента, включенного в комплексное лечение цыплят, в экспериментально воспроизведенном сальмонеллезе были получены результаты, представленные в таблице 1. Из представленных данных видно, что сохранность поголовья в первой, второй, третьей опытных группах и четвертой, пятой (контрольных) - соответственно составила 60, 70, 100, 0 и 60 %. Суммарная продолжительность жизни животных в опытных группах достигала соответственно 340, 385,
500 птице-дней из 500 возможных, тогда как в контроле значение надлежащего показателя было в пределах 125 и 415 суток.
За 10-суточный период наблюдения в группах, обработанных норфлоксацином в дозах 5 и 10 мг/кг живой массы, средняя продолжительность жизни цыплят-бройлеров составила 6,8 и 7,7 суток. В третьей группе, инфицированной взвесью сальмонелл с использованием экспериментального препарата, где также орально вводился норфлок-сацин в дозе 5 мг/кг живой массы, данный показатель равнялся 10 суткам. В этом случае суммарная продолжительность жизни цыплят-бройлеров от максимально возможной равнялась 100 %. Полученный результат свидетельствует о высокоактивной дозе норфлоксацина 5 мг/кг живой массы, если перед заражением лабораторных животных культуру сальмонелл соединить с литиевой формой монтмориллонитовой глины.
В то же время средняя продолжительность жизни цыплят-бройлеров в контрольных группах составила: в четвертой - 2,5; пятой - 8,3 суток.
Анализируя фотографии, подобные приведенной на рисунке 3, установлено, что используемая глина в данном эксперименте выполняет роль сорбата.
Высокий показатель средней продолжительности жизни цыплят-бройлеров тре-
Рис. 1. Активированная глина, обработанная 0,01%-м раствором родамина Б.
Рис. 2. Escherichia coli, окрашенная 0,01%-м раствором родамина Б.
Рис. 3. Адсорбция на клеточной стенке эшерихий активированной глины, окрашенной 0,01%-м раствором родамина Б.
тьей опытной и пятой контрольной групп, по-видимому, обусловлен способностью сорбента адсорбироваться на поверхности клеточной стенки сальмонелл, что, несомненно, снижает степень их патогенности. В итоге нельзя не заметить, что использование норфлоксацина в малых дозах в сочетании с унифицированной литиевой формой монт-мориллонитовой глины обладает 100%-й эффективностью при экспериментально воспроизведенной модели сальмонеллеза у цыплят-бройлеров.
Во время микроскопирования взвеси кишечной палочки с активированной глиной четко просматривалось яркое свечение вокруг образовавшихся конгломератов из бак-
терий и сорбата, являющихся результатом адсорбции на клеточной стенке эшерихий высокодисперсной активированной глины, окрашенной родамином Б (рис. 3). При микроскопии исследуемой активированной глины, суспендированной в 0,01%-м растворе родамина Б (рис. 1), отмечалось незначительное свечение твердых частичек различных размеров. Еле улавливаемое свечение наблюдалось вокруг клеточных стенок Escherichia coli, окрашенных 0,01%-м раствором родамина Б (рис. 2).
Заключение
Установлено, что разработанная литиевая форма монтмориллонитовой глины в высокодисперсном состоянии легко адсорбируется на поверхности фимбрий и клеточной стенке эшерихий, образуя конгломерат - «сорбент-микроорганизм», препятствующий адгезии кишечной палочки на эпителиальных клетках брюшины цыплят-бройлеров, что в свою очередь сдерживает их дальнейшее размножение. Идентичный механизм действия данного сорбента проявляется и к сальмонеллам. При этом явно снижается степень их патогенности. Лечение экспериментально зараженных цыплят-бройлеров взвесью сальмонелл и литиевой формой сорбента норф-локсацином в дозе 5 мг/кг живой массы по сравнению с терапией цыплят, инфицированных культурой сальмонелл, дозой 10 мг/кг, эффективнее на 30 %, а расход дорогостоящего препарата снижается в два раза.
Показано, что создание препаратов антиадгезивного действия является одним из наиболее перспективных направлений при разработке эффективных методов лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Антиадгезивное действие не синонимично понятию бактерицидность, и нарушать адгезию микроорганизмов могут соединения, не обладающие антибактериальным действием в низких концентрациях. Примером таких веществ могут служить глины на основе монтмориллонита.
Научные исследования, опубликованные в данной статье, выполнены в соответствии с государственным контрактом № 16.740.11.0168.
Список литературы
1. Гроссер, А. В. Антиадгезивное действие средств гигиены как способ профилактики стоматологических заболеваний / А. В. Гроссер, С. К. Матело, Т. В. Купец (электронный вариант www.gradusnik.ru/ rus/doctor/stomat/stomgig).
2. Любарский, М. С. Сочетанная лимфотропная и сорбционная терапия гнойных ран / М. С. Любарский, А. Ю. Летягин, В. Х. Габитов. - Бишкек-Новосибирск, 1995.
3. Обоснование местного применения сорбцион-но-детоксикационной терапии при послеоперационных гнойно-септических осложнениях у больных колоректальным раком / Л. Ю. Семченко, В. Л. Полу-эктов, С. С. Степанов и др. // Бюллетень СО РАМН. -2002. - № 2. - С. 101-104.
4. Рекомендации по кормлению сельскохозяйственной птицы / Разраб. : Ш. А. Имангулов, И. А. Егоров, Т. М. Околелова, А. Н. Тишенков и др. ; под общей ред. академика РАСХН В. И. Фисинина, докт. биол. наук Ш. А. Имангулова, член-корр. РАСХН И. А. Егорова, докт. биол. наук Т. М. Околеловой // 3-е
издание, доп. и перераб. - Сергиев Посад : ВНИТИП, 2006. - 143 с.
5. Ресурсосберегающая технология производства бройлеров : методические рекомендации // разраб.: Т. А. Столляр, Л. Ф. Самойлова, В. С. Лукашенко и др. ; под общ. ред. В. И. Фисинина, Т. А. Столяра. - Сергиев Посад : ВНИТИП, 2002. - 171 с.
6. Руководство по выращиванию бройлеров Hubbard - 2002. - 64 с.
7. Сидоренко, С. В. Механизмы устойчивости к хи-нолонам и современный уровень чувствительности клинически значимых микроорганизмов к офлоксацину / С. В. Сидоренко, С. П. Резван, А. Н. Макарова // Антибиотики и химиотерапия. - 1996. - № 41 (9). - С. 33-38.
8. Сорбционные свойства природной и активированной монтмориллонит содержащей глины / А. И. Везенцев, Н. Ф. Пономарева, В. Д. Буханов, Л. А. Козубова, С. В. Королькова, Н. А. Воловичева // Международная конференция «Окружающая среда и человек: враги или друзья?» (г. Пущино, 22-24 июня 2011 г.) [материалы]. - Пущино : Биоресурсы и экология, 2011. - С. 56-59.
