Прилад для експрес-діагностики вірусних інфекцій на базі біосенсорів Spreeta Текст научной статьи по специальности «Химические технологии»

УДК 621.3.551

Стародуб М.Ф. д. бюл. н. професор1) [email protected], Романов В.О. ©д.т.н. професор2) [email protected], Кочан О.В. [email protected] 4) , Кочан Р.В. к. т.н. доцент3), [email protected].

1) 1нститут бюхгмп ¡м. А.В. Палладгна Нацгонально!АкадемИ Наук Украти, Knie

2) 1нститут кибернетики M. ВМ. Глушкова Национально!Академ! Наук Украти, Ки!е

3) Наукоео-дослгдний ¡нститут ¡нтелектуальних комп 'ютерних систем

Тернотльського нацюнального економгчного утеерситету, Тернотль

4) Льегеський нацюнальний уюеерситет еетеринарноiмедицини та бютехнологгй

¡м. С. З. Гжицького

Владимир Романов <[email protected]>, Starodub M.F. <[email protected]>

ПРИЛАД ДЛЯ ЕКСПРЕС-Д1АГНОСТИКИ В1РУСНИХ 1НФЕКЦ1Й НА БАЗ1 Б1ОСЕНСОР1В SPREETA

Для експрес-дгагностики гострих егрусних ¡нфекцш та мжотоксикозге запропоноеано структуру приладу, який еключае оптико-електронн сенсори на осноег поеерхнееого плазмонного резонансу, та еикористоеуе ансамбль нейронних мереж для обробки зареестроеаного сигналу, що дозволило тдеищити достоегртсть дгагностики при одночасному збыьшеннг ресурсу розробленого аналтичного пристрою. Використання особлиеостей структури сенсорге для зберггання еласних параметрге дозеолило стеорити егрус-незалежний еимгрюеальний перетеорюеач.

Ключовi слова: бюсенсори, експрес-дгагностика.

Вступ. На сьогодш використання анаттичних методiв дiагностики вимагае значного часу для проведення аналiзу, складного обладнання, коштовно! реагентно! бази, лабораторних мов та персоналу з високою квалiфiкацiею [1]. Ц обмеження призводять до того, що даагностичш лаборатори е достатньо "рщкими" i тому вимагаються додатковi затрати часу на доставку зразюв для аналiзу, що створюе чергу та iншi проблеми обслуговування, i як наслщок час дiагностики складае вiд деюлькох д1б i бiльше. В цей самий час гос^ вiруснi шфекци (ГВ1) характеризуются швидкими темпами протжання захворювання та малим iнкубацiйним перiодом. Тому використання аналггичних методiв дiагностики ГВ1 не забезпечуе можливост !х ефективного лкування на раннiх стадiях захворювання. Отже актуальною е задача створення методiв та iнструментальних засобiв, призначених для експрес-щагностики ГВ1.

В пристро! експрес^агностики пропонуеться використовувати реакцiю "антиген-антитiло" для виявлення носив ГВ1 та явища поверхневого плазмонного резонансу (ППР) для побудови чутливого елементу. В 1нститут бюх1мп НАНУ розроблено iмунний бюсенсор та методики для визначення ряду низькомолекулярних токсинiв i дiагностики деяких ГВ1, наприклад коров'ячого лейкозу [2, 3]. Основною перевагою цього приладу е низький час проведення

© Стародуб М.Ф., Романов В.О., Кочан О.В., Кочан Р.В., Владимир Романов, Starodub M.F., 2008

180

дiагностики - 10-30 хв. Основним недолшом цього приладу е велик масо-габаритнi po3Mipa

Тому основне завдання aBTopiB полягало у покращеннi техшко-eкономiчниx показниюв iснуючого приладу. Зменшення габаритних розмiрiв пропонуеться досягти за рахунок використання оптико-електронних сeнсорiв типу Spreeta [4], яю базуються на явищi ППР. Спрощення обчислювально! частини пропонуеться забезпечити використанням мшроконтролера з великою стелшню штеграци нeобxiдниx компонeнтiв (аналого-цифрового перетворювача (АЦП), aрифмeтико-логiчного пристрою (АЛП), постшного запам'ятовуючого пристрою (ROM), оперативного запам'ятовуючого пристрою (RAM), i.т.д.).

Опис сенсор1в Spreeta

Сенсори Spreeta виробництва Texas Instruments побудоваш на бaзi явища ППР та рeaлiзовaнi в мжроелектронному виконaннi. Сенсори забезпечують високу чутливють та швидкодiю, що дозволяе в реальному час виявляти нaявнiсть патогенних вiрусiв, контролювати присутнiсть рiзномaнiтниx домшок в рiдинax та газах. Чутливим елементом сенсора е мeтaлiчнa плiвкa з нанесеною на не! бюлопчною структурою, тобто рецептором, який е селективним до молекул дослщжувано! речовини, концентращю яко! визначають. Коли молекули дослщжувано1 речовини зв'язуються з рецептором, мшмум на кривiй ППР змщуеться пропорцiйно до концентрацп дослщжувано1 речовини [5] рис. 1.

Number of pixel (photodiode)

Рис.1. Приклади залежностей напруги фотод1од1в

Алгоритм роботи з таким бюсенсором включае нaступнi кроки:

- тдготовка мeтaлiчноl плiвки до нанесення рецептора;

- нанесення зазначено1 структури на мeтaлiчну плiвку;

- забезпечення контакту дослщжувано1 проби з поверхнею бюсенсора;

- вимiрювaння напруги на фотодюд нiй мaтрицi;

- розрахунок мiнiмуму криво1 ППР;

- видалення рецептора з мeтaлiчноl плiвки.

Ресурс бiосeнсорa визначаеться стiйкiстю мeтaлiчноl плiвки до процeсiв нанесення та видалення рецептора. Положення мшмуму криво1 ППР визначаеться концeнтрaцiею молекул дослщжувано1 речовини зв'язаних з

181

рецептором. У випадку малих концентрацш дослщжувано1 речовини залишаеться велика кшьюсть "незв'язаних" молекул рецептора, яю можуть бути використaнi при дослщженш наступних проб, тому пропонуеться запам'ятовувати положення мiнiмуму та вимiрювaти тiльки його змiщeння. Очевидно, що кiлькiсть дослiджeнь при використaннi рецептора е обмеженою i визначаеться концентращями дослiджувaниx речовин при попeрeднix вимiрax. Тому нeобxiдно пiсля кожного вимiру визначати ресурс рецептора i проводити його оновлення тсля повного використання. Таким чином, можна в декшька рaзiв збiльшити ресурс бiосeнсорa та зменшити трудомiсткiсть проведення дослiджeнь.

Використання вiрус-, або токсин спeцифiчниx рeцeпторiв забезпечуе сeлeктивнiсть бiосeнсорa. Методики отримання нeобxiдниx рeцeпторiв (aнтигeнiв, або ж спeцифiчниx aнтитiл) добре вiдомi, загально прийнятi i вони можуть бути використаш для широкого спектру вiрусiв та мiкотоксинiв [3, 6, 7].

Метод обробки сигналу сенсора

Вихщним сигналом сенсора Spreeta е напруга, яка генеруеться на фотодюдах лшшки з 128-ми фотодiодiв. Ця напруга залежить вiд концентрацп рeцeпторiв (антитш), якi вступили в спeцифiчну реакцш i може змiнювaтися в межах вщ 100 мВ до 3 В. Типовi грaфiки функцп залежност генеровано1 напруги вiд номера фотодюда прeдстaвлeнi на рис. 1.

Обробку сигнaлiв бiосeнсорa пропонуеться проводити в декшька етатв:

- визначення концентрацп "зв'язаних" молекул рецептора;

- визначення концентрацп дослщжувано1 речовини з врахуванням рeзультaтiв попeрeднix дослiджeнь з допомогою цього ж самого рецептора;

- прогнозування ресурсу рецептора для наступних вимiрiв;

- прогнозування ресурсу металево1 плiвки сенсора з врахуванням кiлькостi використаних ци^в нанесення та видалення рецептора.

Для визначення концентрацп "зв'язаних" молекул рецептора пропонуеться використати навчену штучну нейронну мережу в виглядi трирiвнeвого персептрона з 16-ма нейронами вхщного рiвня, одним нейроном виxiдного рiвня та деякою кiлькiстю нeйронiв схованого рiвня з сигмо1дною функцiею активацп. На нейрони вxiдного рiвня подаються сигнали фотодiодiв симетрично вiд св^ло дiодa з мiнiмaльним рiвнeм сигналу. З вихщного нейрона знiмaеться значення концентрацп "зв'язаних" молекул рецептора. Нейронна мережа тдвищуе точнiсть розпiзнaвaння мшмуму i збiльшуе зaвaдостiйкiсть приладу. Структура (кшьюсть нeйронiв схованого рiвня) та коефщенти ще1 нейронно1 мeрeжi визначаються при проектуванш рецептора.

Для визначення концентрацп дослщжувано1 речовини нeобxiдно врахувати вплив попeрeднix вимiрювaнь на кшьюсть "зв'язаних" молекул рецептора. Для цього пропонуеться використати додаткову штучну нейронну мережу. На ll входи подаються концентрацп "зв'язаних" молекул рецептора, отримаш при попередшх вимiрax, а з вихщного нейрона зшмаеться значення концентрацп дослщжувано1 речовини пщ час останнього вимiру. Структура та

182

коефщенти ще! нейронно! мережi також визначаються при проектуванш типу рецептора.

Прогнозування ресурсу рецептора для наступних вимiрiв полягае у визначенш достатньо! кiлькостi його "незв'язаних" молекул для гарантованого визначення мшмально! необхщно! концентраци дослщжувано! речовини у наступнш пробi. При досягненнi визначено! концентраци "зв'язаних" молекул (для кожного типу рецептора свое!) необхщно здшснити його оновлення.

Прогнозування ресурсу металево! плiвки сенсора полягае у визначенш И товщини та прийняттi ршення про те, чи вона е достатньою для проведення процедури видалення та нанесення рецептора за умови забезпечення необхщного рiвня функцiонування реалiзацil поверхневого плазмонного резонансу. Ресурс ще! плiвки визначаеться методами видалення та нанесення рецептора i конкретизуеться при його виборь

Структура приладу

Для забезпечення дискретизаци напруги на фотодюдах рекомендуеться використовувати аналого-цифровi перетворювачi (АЦП) з роздшьною здатнiстю 12 б^ [8]. Швидкодiя АЦП повинна забезпечити дискретизацш вихщно! напруги 128-ми фотодiодiв з частотою вибiрки вiд 5 кГц до 2 МГц. Рекомендована швидкодiя складае 25 кГц. АЦП з такими характеристиками широко представлен в номенклатурi систем на кристалi рiзних фiрм [9-11].

В склад сенсора 8ргее1а входить ЕЕРЯОМ, об'емом 4 кб з штерфейсом доступу типу 11С. Цей ЕЕРЯОМ доцшьно використати для зберiгання шформаци про сенсор, призначено! для роботи приладу. В цш пам'ятi пропонуеться збершати наступнi записи:

- номер сенсора;

- тип ГВ1, для яко! призначено сенсор;

- дату нанесення рецептора;

- термш ди рецептора;

- ресурс рецептора;

- кшькють проведених дослщжень з використовуваним рецептором;

- ресурс металево! плiвки сенсора;

- кшькють оновлень рецептора;

- концентраци "зв'язаних" молекул рецептора при попередшх вимiрах пiсля останнього оновлення рецептора;

- структура нейронно! мережу призначено! для визначення концентраци "зв'язаних" молекул рецептора [12];

- ваговi коефщенти та змщення нейронiв нейронно! мережi призначено! для визначення концентраци "зв'язаних" молекул рецептора;

- структура нейронно! мережу призначено! для визначення концентраци дослщжувано! речовини;

- ваговi коефщенти та змiщення нейронiв нейронно! мережi призначено! для визначення концентрацi! дослщжувано! речовини.

Тому контролер пристрою повинен тдтримувати штерфейс 11С.

183

Структурну схему пристрою представлено на рис. 2.

C- Programmer е

Рис.2 Структурна схема пристрою

Конструктивно вш складаеться з трьох частин - сенсор, вимiрювальний блок та програматор, з'еднаних мiж собою з допомогою роз'емiв.

Вимiрювальний блок призначений для дискретизаци та аналiзу вихiдних сигналiв сенсора та шдикацп результатiв дiагностики. Його ключовим елементом е мiкроконвектор - МС - типу ADUC831 [13], який включае АЦП, ROM, RAM, АЛП, контролер штерфейсу ПС, порти вводу виводу, тактовий генератор. Вш забезпечуе:

- зчитування та декодування вмiсту пам'ятi сенсора;

- дискретизацш напруги на аналогових виходах сенсора;

- формування iмпульсiв керування сенсором;

- обробку вихiдного сигналу сенсора;

- запис шформаци у вщповщш поля пам'ятi сенсора;

- шдикацш результатiв роботи.

Дискретизацiя сигналу сенсора забезпечуеться з допомогою вбудованого аналого-цифрового перетворювача - ADC. Iндикацiя результат роботи забезпечуеться з допомогою рiдкокристалiчного iндикатора - LCD. Системний таймер - RTC - забезпечуе можливють автоматичного визначення сенсорiв, термiн придатност рецепторiв яких вичерпано. Узагальнена блок схема алгоритму роботи контролера вимiрювального блоку представлена на рис. 3.

Програматор призначений для оновлення вмюту EEPROM сенсора при оновленш рецептору. Вш тдключаеться до комп'ютера та забезпечуе програмування EEPROM по штерфейсу 11С. Вiн представляе собою драйвер штерфейсу 11С на базi програматора Ic-prog [14].

Висновки

Розроблено компактний пристрш який забезпечуе експрес-дiагностику ГВ1 та мiкотоксикозiв. Розроблений пристрiй базуеться на реакци "антиген-антитшо" бюлопчно-активних речовин та явищi ППР. Багаторазове використання рецептора (антигена, або антитш) дозволило збшьшити ресурс

184

бюсенсора та зменшити трудомштюсть дослщжень бюлопчних проб. Збер^ання шформацп про бiосенсор у вбудованому в сенсори ЕЕРЯОМ забезпечило можлившть обробки отриманих сигналiв по шдивщуальному алгоритму що дозволяе проводити розробку вiрус-, та токсин специфiчних рецепторiв та бiосенсорiв незалежно вiд вимiрювального блоку. Конструктивне роздiлення вимiрювального блоку та сенсора дозволило ушф^вати вузли, що забезпечило можлившть використання набору сенсорiв з одним вимiрювальним блоком. Спектр використання пристрою забезпечуеться набором рецепторiв та е iнварiантним до самого пристрою.

Рис. 3. Узагальнена блок-схема алгоритму роботи контролера вшупрювального блоку

Лiтература

1. В. Романов. Микроэлектронные биосенсорные системы. Электронные компоненты и системы. №3, Март 2003, стр. 5 - 6.

2. A.V. Nabok, A.Tsargorodskaya, A.K. Hassan, N.F. Starodub Total internal reflection ellipsometry and SPR detection of low molecular weight environmental toxins. Appl. Surface Science - 2005. - 246.- P. 381-386.

3. N.F. Starodub, L.V. Pirogova, V.P. Artyukh, V.N. Starodub Biospecific interactions on the optical transducer surface the base of infection diagnostics.// In Proc. of NATO ARW "Frontiers of Multifunctional Nanosystems. Ed. Buzaneva E., Scharff P. Vol. 57, P. 369-376. 2002.

4. http://www.sensata.com/products/sensors/spreeta-highlights.htm

5. В. Романов, Т Бедненко. Микроэлектронные биосенсоры семейства Spreeta. Электронные компоненты и системы. №4, Апрель 2004, стр. 4 - 7.

6. N.F.Starodub, V.M. Starodub, A.V. Demchenko, A.V. Zherdev, B.B. Dzantiev,

185

A.V. Goncharic, N.V. Piven Creation of optical immune sensors for the determination of low weight toxic substances in environment. Proc. of International Trade Fair for Optical and Microtechnology Products with Conferences, 25-27 May 2004, Nuremberg Exhibition Center, Germany, 2004, P.335-340.

7. N. F. Starodub, L. V. Pirogova, V. M. Starodub, A. Demchenko Antibody immobilization on the metal and silicon surface. The use of self-assembled layer and specific receptors. Bioelectrochemistry, 2005, 66, 111-115.

8. http://www.aigproducts.com/surface plasmon resonance/spr evaluation modul e.htm

9. http://www.analog.com/en/subCat/0,2879,762%255F%255F0%255F%255F0%2 55F,00.html

10. http://www.silabs.com/tgwWebApp/public/web content/products/Microcontrolle rs/Precision Mixed-Signal/en/mixedsig matrix.htm

11. http://focus.ti.com/paramsearch/docs/parametricsearch.tsp?family=analog&famil yId=630&uiTemplateId=N0DE STRY PGE T

12. I. Turchenko, V. Kochan, A. Sachenko. Neural-Based Recognition of MultiParameter Sensor Signal Described by Mathematical Model // International Scientific Journal of Computing. - 2004. - Vol. 3. - Issue №2. - P. 140-147

13. http://www.analog.com/en/prod/0,,762 0 ADUC831%2C00.html

14. http://www.ic-prog.com/

Cmammx nadiumna do peda^ii 2.04.2008

186