CC BY
113
И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ И ОБЗОРЫ_
Прецизионная кардиология: тонкая грань между надеждой и разочарованием
Вайханская Т.Г.,
кандидат мед. наук, старший научный сотрудник функциональной группы клинической патофизиологии кровообращения Республиканского научно-практического центра«Кардиология», Минск, Беларусь
Vaikhanskaya TG.
Republican Scientific and Practical Center of Cardiology, Minsk, Belarus
Precision cardiology: a fine line between hope and disappointment
Резюме. Представлены потенциальные перспективы и проблемные вопросы прецизионной кардиологии, позволяющей использовать инновационные методы диагностики и лечения, основанные на интегральном анализе геномной информации индивидуума с помощью персональных молекулярно-биологических технологий (геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика, эпигеномика, фармакогеномика). Постгеномные технологии открыли стратегически новые терапевтические возможности для точной, доказательной, предиктивной, превентивной и персонализированной медицины, ориентированной на оптимальное, научно обоснованное и безопасное индивидуализированное лечение конкретного пациента.
Ключевые слова: прецизионная кардиология, геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика, эпигеномика, фармакогеномика, персонализированное лечение.
Медицинские новости. — 2016. — №2. — С. 9—16. Summary. The article presents the potentially prospective and problematic issues of cardiovascular precision medicine, allowing the use of innovation methods of diagnosis and treatment based on integrated analysis of genomic information with personal individual molecular biological techniques (genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics, epigenomics, pharmacogenomics). Post-genomic technologies have opened a new strategy of therapeutic possibilities for accurate, evidence-based, predictive, preventive and personalized medicine, focused on the optimal, scientifically-sound and safe individualized treatment of a particular patient.
Keywords: cardiovascular precision medicine, genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics, epigenomics, pharmacogenomics, personalized therapy.
Meditsinskie novosti. - 2016. - N2. - P. 9-16.
Наука всегда оказывается неправа. Она никогда не решит вопроса,
не поставив при этом десятка новых.
Б. Шоу
ловека ученые насчитали менее 25 тысяч (лишь вдвое больше, чем у дрозофилы), но впоследствии убедились в противоположном. Традиционно ген определяли как участок ДНК, который кодирует белок. Однако при расшифровке генома ученые выяснили, что гены, кодирующие белки, составляют примерно 1,5%, а остальные 98,5% участков ДНК не кодируют белки -это так называемая бесполезная, «мусорная» ДНК, функции которой до сих пор изучаются. Впоследствии выяснилось, что эти 98,5% участков ДНК имеют едва ли не большее значение: именно эта часть ДНК отвечает за ее функционирование, и многие некодирующие участки ДНК вовлечены в процессы транскрипции ДНК или участвуют в регуляции генов. Например, определенные участки ДНК содержат инструкции для получения похожих на ДНК, но небелковых молекул, так называемых двухцепочечных РНК. Эти молекулы являются частью молекулярно-генети-ческого механизма, контролирующего активность генов (РНК-интерференция).
В последнее десятилетие развитие медицины, клинической и медицинской биохимии происходит на стыке наук - физической химии, общей и молекулярной биологии, кибернетики. В современной прецизионной (точной) медицине реализуются такие проекты, как геномика, транскриптомика, про-теомика, метаболомика, эпигеномика, фармакогеномика и другие «-омики», позволяющие получить сверхточную картину индивидуального молекуляр-но-генетического состояния организма в виде биокомпьютерной модели. Прецизионная кардиология представляет собой интегральную отрасль медицины, которая включает разработку персонализированных средств диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) на основе изучения генома и протеома человека, предиктивного молекулярно-генетического тестирования на предрасположенность к кардио-васкулярным болезням и их превентив-ность, а также объединение диагностики
с лечением и персонифицированным фармакогенетическим мониторингом лечения [6].
К началу третьего тысячелетия (2003 -й -год полувекового юбилея открытия Д. Уот-соном и Ф. Криком двойной спирали ДНК) завершен грандиозный научный проект по расшифровке генома человека; эта программа была широчайше разрекламирована не только в научной, но и в популярной прессе. С поистине безграничной эйфорией и журналисты, и ученые смело утверждали, что человечество одержит победу над наследственными болезнями. В настоящее время геном человека секвенирован, определены последовательности расположения нуклеотидов в молекулах ДНК на всех 23 хромосомах (текст этот огромен, он состоит примерно из 3,2 миллиарда «букв»). Но ученые с удивлением обнаружили, что генов существует гораздо меньше, чем они ожидали, - это самый сенсационный результат проекта: вместо ожидаемых 100 тысяч генов в наследственном материале че-
Некоторые двухцепочечные РНК могут подавлять гены, препятствуя синтезу их белковых продуктов. Таким образом, если данные участки ДНК также считать генами, то их количество удвоится. В итоге исследования изменилось само представление о генах, и сейчас ученые считают, что ген - это единица наследственности, которую нельзя понимать как просто участок ДНК, кодирующий белки. Проведя простую аналогию функционирования клетки с устройством компьютера, можно сказать, что кодирующая часть ДНК - это биологический состав клетки, ее «железо», а в некодирующей части размещена стратегическая для организма информация, где находятся операционные системы, оперативная и долговременная память, механизмы комплексной защиты информации, полное программное обеспечение - «софт». Доводом в пользу такого предположения является отсутствие мутаций в «мусорной» ДНК - стратегическая информация должна быть защищена надежно. Но клетка является чем-то большим, чем просто совокупностью составных частей, для ее развития недостаточно закодированной в ДНК информации, столь же важным является процесс саморегулирования генома с помощью сообщения между соседними генами, воздействия других молекул клетки и белок-белковыми взаимодействиями [8].
Сегодня известно, что гены могут проявлять свою активность очень по-разному. Соотношение 1:1, из которого генетики длительное время исходили (ситуация, когда один ген кодирует один белок), является скорее исключением, чем правилом. Существуют гены, способные кодировать несколько различных белковых молекул. Это свойство называется альтернативным сплайсингом, а другие гены, напротив, могут только совместными усилиями запустить синтез одного единственного белка [11, 16].
Разобраться во всех этих чрезвычайно сложных взаимосвязях невозможно, если ограничиться лишь расшифровкой последовательности букв генетического алфавита и не учитывать механизмы функционального взаимодействия генов, белков, транскриптонов. В клетке происходит транскрипция, то есть на матрице ДНК происходит синтез РНК; эта так называемая матричная, или информационная, РНК подвергается сплайсингу - процессу, в ходе которого отдельные нуклеотидные последовательности из молекулы РНК вырезаются, а оставшиеся последовательности соединяются. У человека 94%
генов подвержены альтернативному сплайсингу, то есть сохраняющиеся в молекуле нуклеотидные последовательности могут соединяться в различных комбинациях, образуя различные формы РНК, и в результате один ген может кодировать множество различных белков [11].
Генетиками установлено, что примерно 8% человеческого генома составляют эндогенные ретровирусы (ЭРВ), которые
являются наследием древних ретрови-русных инфекций. Ученые, изучавшие активность генов в эмбрионах человека в применении технологий ЭКО, в 2015 г. сделали неожиданное открытие: в составляющих плод восьми клетках обнаружена не только ДНК родителей, но и генный материал HERVK - самого последнего ЭРВ, попавшего к человеку около 200 тысяч лет назад. Оказалось, что этот вирус защищает преимплантационные эмбрионы от других вирусов, обеспечивая их выживание, а также регулирует генную активность их клеток. В ходе дальнейших экспериментов выяснилось, что HERVK вырабатывает белок, не позволяющий другим вирусам попасть в эмбрион, то есть вирус защищает эмбрион человека от гриппа и других опасных болезней. Более того, Rec (акцессорный белок HERVK) связывает некоторые клеточные РНК и регулирует деятельность рибосом. Таким образом, ЭРВ играют важную роль в раннем развитии человека, участвуя в генной активности эмбриональных клеток [14].
Все эти и множество других выявленных обстоятельств и парадоксов привели к тому, что начальная эйфория быстро сменилась более трезвыми оценками, причем как уже достигнутых результатов, так и перспектив исследований в области биологии и медицины. Геном из «открытой книги жизни», как его называли журналисты, из «энциклопедии, написанной четырьмя буквами», превратился в базу данных - каталог нуклеотидных последовательностей. Этот каталог присутствует в каждой клетке организма, но обходятся с ним клетки по-разному: в разных клетках в разное время включаются и выключаются разные гены, синтезируются разные белки. Так, по образному выражению генетика П. Бола, «открытая книга жизни»
оказалась не только не готовой к чтению, но еще «закрытой, запечатанной и запакованной» [8]. Сегодня на «коротком» пути от гена к белку (весь путь помещается в пределах одной клетки) возникают немалые трудности в понимании патогенеза и изучении патофизиологии, и для их преодоления понадобилось создание новой науки - протеомики. Можно сказать, что сегодня все неосуществленные чаяния
геномики - науки о строении генома -переложены на протеомику - науку о строении протеома [16].
Итак, геномика выявляет возможные дефекты на пре- и трансляционном уровне, которые предшествуют передаче генетической информации с ДНК на РНК, синтезу матричной РНК (мРНК). Значимые участки ДНК при таком «переписывании» могут быть скомбинированы между собой самыми разными способами; в результате на базе одной матрицы получаются разные белки, которые отличаются по функциям, выполняемым в организме. Информация о том, как будут «скомпонованы» между собой различные участки, хранится уже не в ДНК, а в другой молекуле - информационной РНК, которая имеет свои особенности. То есть уже на этом этапе одним анализом генома не обойтись, необходимы исследования белков, экспрессированных в клетке (организме) и сети белок-белковых взаимодействий. Новый международный проект «Протеом человека» стартовал осенью 2010 г. По мнению специалистов, именно протеомика доведет до конца дело, начатое расшифровкой генома человека [7].
Постгеномика: транскриптомика, протеомика, метаболомика, эпигеномомика... Qua vadis? За прошедшее десятилетие радикальному обновлению подверглись методы количественного и качественного анализа молекулярных основ жизни. От обнаружения отдельных разновидностей молекул и в фундаментальной, и в прикладной биомедицинской науке бесповоротно перешли к детектированию целых классов молекул в их полной или почти полной совокупности. Такие совокупные методы получили наименование
Прецизионная кардиология - интегральная отрасль медицины, включающая разработку персонализированных средств диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний на основе изучения генома и протеома человека, предиктивного молекулярно-генетического тестирования на предрасположенность к кардиова-скулярным болезням и их превентивность, а также объединение диагностики с лечением и персонифицированным фармакогенетическим мониторингом лечения
Рисунок 1
| Схема основных разделов генетики и омиксных технологий
омиксных, от обобщения названий разделов науки с суффиксом «-омика». Например, транскриптомика изучает матричные РНК (мРНК), то есть транскриптомы, протеомика - белки, то есть протеомы, метаболомика - реакции обмена веществ, метаболизма, то есть метаболомы, и так далее. Так, с омиксными технологиями, представленными на рис. 1, человечество вступило в эру постгеномики.
Транскриптомика - это идентификация всех матричных РНК (мРНК), кодирующих белки, определение количества мРНК и закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки у данного человека в данных условиях. РНомика - идентификация всех некодирующих РНК и измерение их у данного человека в конкретных условиях. Метаболомика - идентификация всех метаболитов в клетках, тканях, органах, биологических жидкостях у данного человека в конкретных условиях [7].
Пожалуй, самой значительной сенсацией биологии конца ХХ стало открытие принципиально нового класса РНК. Практически во всех эукариотных организмах неожиданно было обнаружено огромное количество различных РНК, которые не кодируют белки и не являются ни рибосомальными, ни транспортными. Они играют в основном регуляторную роль - влияют на экспрессию генов (чаще всего на уровне трансляции). Это так называемые микро-РНК длиной от 19 до 22 нуклеотидов, к ним относятся также интерференционные РНК, которые выключают синтез определенных белков путем разрушения их мРНК. Микро-РНК регулируют экспрессию генов после их транскрипции. Это может происходить за счет репрессии трансляции мРНК, расщепления мРНК и ускорения распада мРНК.
В каждой микро-РНК есть участок, комплементарный особому участку в той мРНК, которая при каких-то обстоятельствах подлежит инактивации. Таким образом, большинство мРНК имеют «черные метки», указывающие на возможность собственной деградации, а микро-РНК, имеющие комплементарные участки, в нужный момент узнают «черные метки» и нацеливают на мРНК, приговоренные к ликвидации, ферменты и белки, для этого предназначенные. С помощью РНомики микро-РНК, содержащиеся в образцах, идентифицируются и определяется их концентрация. Оказалось, что изменения концентрации различных микро-РНК характерны для различных типов патологий [28]. Известно более двух тысяч микро-РНК человека (miRBase), каждая из которых может регулировать работу сотен генов-мишеней. Таким образом, короткие РНК участвуют в регуляции, трансляции, формировании неактивного «молчащего хроматина» (silent chromatin) и в обеспечении защиты клетки от перемещающихся подвижных элементов (транспозонов). В клинической РНомике наступила «новая лихорадка» по поиску «золотых» маркеров и предикторов заболеваний. Согласно полученным дан-
ным количество различных микро-РНК у человека может достигать 37 тыс. (по сравнению с приблизительно 22 тыс. генов, кодирующих белок). Гены выглядят скорее как фабрики по производству РНК и возможно, что гены, участвующие в биосинтезе белка, являются меньшинством [21, 24].
В изучении регуляции экспрессии генов сейчас все большее значение придается химическим изменениям, происходящим иногда в определенных участках генома. Наиболее известное из них - метилирование - присоединение
в ДНК специальной химической группы, состоящей из одного атома углерода и трех атомов водорода (метильная группа). Такая модификация существенно сказывается на работе гена, без изменения его текста. Метилирование, а также другие способы, которыми природа изменяет активность генов, меняя лежащие рядом с ними регулировочные участки, стали предметом изучения новой «постгеномной» дисциплины - эпигеномики (от греческого «эпи» - рядом, около). Явление немутационной эпигенетической изменчивости, открытое в конце 50-х годов при изучении генетики простейших и генетики соматических клеток, тогда не вписывалось в хромосомную теорию наследственности, «вызывая тень Ламарка» (последний утверждал, что признаки, приобретенные организмами в процессе своей жизни, могут передаваться по наследству, что отвергается современной генетикой). В наше время, когда молекулярная природа этого явления раскрыта, эпигеномика стала еще одним из важных направлений биологического поиска. Об этом говорит хотя бы тот факт, что еще до завершения проекта «Геном человека» произошло объединение усилий большой группы ведущих европейских научных центров с целью создания Европейского эпигенетического консорциума. Его основная задача - выявление сотен тысяч участков генома, подвергающихся метилированию, с анализом различных вариаций и изучение наследования изменений в фенотипе или в экспрессии генов, не связанных с изменениями последовательности ДНК. Эпигенетика вводит в игру еще один важный фактор -
окружающую среду. Внешние обстоятельства тоже влияют на активность генов, и эта активация или инактивация разных генов может также отчасти передаваться по наследству внукам и правнукам. Изменения экспрессии генов или фенотипа клетки, вызванные механизмами, не затрагивающими изменение ДНК, изучает эпигенетика [25] Эпигенетические изменения представляют собой химические модификации последовательности ДНК или гистонов - белков, необходимых для упаковки нитей ДНК в хромосомы.
Проведя простую аналогию функционирования клетки с устройством компьютера, можно сказать, что кодирующая часть ДНК - это биологический состав клетки, ее «железо», а в некодирующей части размещена стратегическая для организма информация, где находятся операционные системы, оперативная и долговременная память, механизмы комплексной защиты информации, полное программное обеспечение - «софт»
К эпигенетическим, то есть к внешним по отношению к ДНК механизмам регуляции экспрессии генома, относят метилирование, ацетилирование, убиквитинилирова-ние (ковалентное присоединение к белку мишени множества молекул убиквитина), биотинилирование и фосфорилирование. Эпигенетическая регуляция - это процесс, приводящий к изменению активности гена без изменений в его кодирующей последовательности, которое стабильно наследуется после исчезновения фактора, вызвавшего это изменение. Эпигенетические изменения, как правило, обратимые, не затрагивают изменений первичной структуры ДНК, бывают долговременные и кратковременные и имеют множество взаимосвязанных механизмов. Таким образом, фенотипические проявления сердечно-сосудистых заболеваний - это не только эффект от конкретного гена заболевания и специфической мутации. Фенотипы могут широко варьировать вследствие воздействия эпигеномных эффектов, влияния генов-модификаторов и внешних факторов; основные механизмы эпигеномного влияния представлены на рис. 2.
Именно механизмами этой сложной модели взаимодействия можно объяснить, почему фенотип наследственного заболевания может так сильно различаться даже среди родственников пробанда семьи с одинаковой мутацией.
Иногда совокупность генов сравнивают с большим симфоническим оркестром [25]. В зависимости от дирижера, исполнителей и музыкальных инструментов одна и та же партитура может звучать, вызывая у слушателей или восторг, или глубокое разочарование. Каким образом каждый «музыкант» (отдельный ген) играет в этом «оркестре»? Какую роль в «дирижировании» играет сложнейшее взаимодействие между различными генами и белками? Какое влияние оказывают на гены многочисленные факторы внутренней и внешней среды: радиация, температура, пища, солнечный свет, бактерии, вирусы, лекарственные вещества, внутриклеточные метаболиты? Как работают «дирижерские палочки» - сигнальные пути и молекулярные механизмы, контролирующие программы функционирования генов? Как дисгармония этих процессов отражается на слаженной игре «оркестра» в целом? На эти и многие другие вопросы геномного функционирования еще только предстоит ответить ученым.
Кардиоваскулярная геномика,
траскриптомика, протеомика,
фармакогеномика
Тем не менее, геномика заложила основы клинической генетики на многие
годы; она дала теоретическое обоснование и конкретные методические приемы, в том числе и автоматизированные, для поиска мутаций в отдельных генах (моногенная патология), которые являются этиологическими факторами врожденных нарушений, формирующих фенотипические проявления патологии - клинические симптомы или предрасположенности. Исторически сферой интересов генетики были моногенные заболевания, то есть заболевания, вызыва-
емые мутацией одного гена. Моногенные (менделевские) заболевания составляют менее 1%. Среди ССЗ с менделевским типом наследования известны: семейные формы гиперхолестеринемии (мутации гена, кодирующего апо-В - основной белок ЛПНП, и мутации в рецепторе апо-В - АРОВ); семейная гомоцистину-рия, детерминированная мутацией 5,10-метилен-тетрагидрофолатредуктазы; синдром Гатчинсона - Гилфорда (мутации гена ламина А/С); гипо-альфа-липопро-теидемия семейная с изолированным дефицитом ЛПВП (мутации в гене АВСА1); «каналопатии», связанные с мутацией генов К- или Na-каналов (SCN5A, KCNQ1); стероид-зависимый альдостеронизм, обусловленный дефектом цитохрома Р450, приводящий к гипертензии; синдром Лиддла с повышенной активностью на-
триевых каналов, чувствительных к амило-риду ^NN1 В) [13]. К настоящему времени известно более 100 кандидатных генов, детерминирующих развитие кардио-миопатий, созданы генетические карты для дилатационной, гипертрофической кардиомиопатии и аритмогенной право-желудочковой дисплазии [15]. Однако большинство ССЗ являются мультифак-ториальными, обусловленными влиянием множества генов, каждый из которых в отдельности обладает относительно сла-
бым действием, но комбинация их друг с другом или влияние факторов внешней среды способны индуцировать заболевания - ишемическую болезнь сердца (И БС), атеросклероз, артериальную гипертензию (АГ). Вероятность возникновения и развития атеросклероза могут повышать мутации в различных генах; такие мутации идентифицированы, например, в гене ALOX5AP, который кодирует белок активатора 5-липооксигеназы (5-lipoxygenase, 5LOX), этот белок активирует синтез лейкотриена - липида - медиатора воспалительного процесса в стенках сосудов. Развитию атеросклероза также способствуют мутации в гене 1^2А, который кодирует фактор регуляции транскрипции в миоцитах; изменения в гене АпоЕ, который кодирует аполипопротеин Е, входящий в состав липопротеинов высокой плотности
Рисунок 2
| Механизмы эпигеномного влияния на фенотипы сердечно-сосудистых заболеваний
Гены - модификаторы
в локусах: 1) дополнительные варианты кодирования; 2) некодирующие варианты, изменяющие уровень экспрессии; вне локусов- общие полиморфизмы или редкие мутации
Мутации генов, генотип
¿а.
Внешнее воздействие
Возраст Беременность Цитотоксические средства Вирусные инфекции Спорт
Инсоляция, радиация
Фенотип
Эпигеномные эффекты
Энзиматическая модификация гистонов (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, биотинилирование, убиквитинирование);
Трансляционное управление (микро-РНК) и трансляционные модификации
ПОСТ-
Рисунок 3
Классификация нуклеотидных вариаций, включающих полиморфизмы, мутации и вариации неясной значимости [27]
П
Однонуклеотидные полиморфизмы:
Общая частота >1% • Некодирующие (>99%) или кодирующие Эффект незначительный или отсутствие патологического эффекта
Изменение экспрессии генов
Регуляция сайтов
йтов
Мутации:
• Частота очень редкая (< 0,1%)
• Кодирующие или сайты сплайсинга
• Известный патофизиологический эффект Изменение фенотипа
Вариации неясной значимости:
• Частота очень редкая(<0,1%) или редкая (<0,5%)
Кодирующие
Неизвестный патофизиологический эффект
(ЛПВП); мутации в гене ^ГА, кодирующего синтез альфа-лимфотоксина [11, 12].
Доказано влияние множественных однонуклеотидных полиморфизмов геномной ДНК (результат точечной мутации), для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), на вероятность развития АГ [6]. Так, хорошо изучены полиморфизмы ангиотензиногена ^Т): Т174М (С>Т), М235Т(Т>С), повышающие риск заболевания (в гомозиготном варианте частота составляет 15-20%), и рецепторов 1 типа ангиотензина II (AGTR1) - неблагоприятный 1166С вариант встречается с частотой 30-40%.
Полное секвенирование генома позволяет определить и полиморфизмы, которые настолько редки, что пока не могут быть сделаны какие-либо выводы о влиянии их на здоровье, что создает некую неопределенность в анализе индивидуальных геномов, особенно в контексте клинической помощи (классификация нуклеотидных вариаций представлена на рис. 3). Чешский медицинский генетик Е. Мачакова отмечает: «В некоторых случаях трудно отличить, является ли обнаруженный секвенированный вариант причиной мутации или нейтральной (полиморфной) вариацией без каких-либо влияний на фенотип. Расшифровка редких вариантов секвенирования неизвестного значения, обнаруженных в болезнетворных генах, становится все более важной проблемой».
Очевидно, что совокупность проблем ССЗ не удастся решить, зная только последовательность нуклеотидов в геноме человека или расшифровав порядка 25 тыс. локусов, кодирующих соответствующие белки или регуляторы других генов. Уже созданы базы данных по сотням белков протеома миокарда, уровни которых изменяются при хронических и острых сердечно-сосудистых заболеваниях. Об-
наружено, что при этих заболеваниях возрастают концентрации белков теплового шока (heatshock proteins - HSP), белков митохондрий, а также белков, вовлеченных в генерирование энергии. Диагностически важные белки кардиопротеома классифицируются на белки, связанные с получением энергии и метаболизмом, белки, индуцируемые стрессом, и белки, обеспечивающие контрактильные функции и формирование цитоскелета [24].
Весьма перспективным оказался мониторинг динамики протеомов тканей, взятых при помощи биопсии: обнаружено более 100 кардиоспецифических белков, уровни которых значительно изменяются при заболеваниях сердца [24, 25]. Согласно предварительным данным наиболее многообещающими биомаркерами в кар-диопротеомике могут быть тропонины, изо-формы альфа-1-фибриногена, изоформы аполипопротеина А1, С-реактивный белок
и др. В передовых клиниках кардиологи уже сейчас читают кардиопротеомы так же уверенно, как электрокардиограммы и ангиограммы [25]. Исследования последнего времени доказали высокую роль некоторых белков в защите тканей от метаболического повреждения при ИБС. Полученные результаты актуальны в связи с поиском подхода к изучению молекулярно-клеточных механизмов защиты клеток от ишемии, возникающей в тканях в случае резкого нарушения кровотока [4, 20]. Метаболомика также может дать чрезвычайно много для практической кардиологии в связи с появлением методов молекулярного
профилирования (фингерпринтинг, или «метод отпечатков пальцев»). Созданная на основе этого подхода диагностика позволит определять заболевания на самых ранних этапах, еще до проявления симптоматики [1, 9, 25].
Использование множества омиксных технологий сделало возможной давнюю мечту медицины древности, вдохнуло новую жизнь в клиническую парадигму, сформулированную еще Галеном и Авиценной: «Лечи больного, а не болезнь». Анализ результатов омиксных обследований позволяет на практике осуществить вышеупомянутый принцип персонализированной медицины и назначать конкретному пациенту именно тот метод лечения, который более всего ему подойдет. В фармакогеномике генетическая информация может быть использована для выбора наиболее подходящего лекарственного препарата, назначающегося пациенту [19]. Препарат должен выбираться с максимальной возможностью получения желаемого результата и сведением к минимуму побочных эффектов у пациента. Фармакогенетика изучает генетические детерминанты в индивидуальной изменчивости реакции на препараты, включая изменчивость в реакции на первый прием препарата и вероятность риска редких и неожиданных явлений. Примеры генов, способных влиять на метаболизм лекарственных сердечно-сосудистых препаратов, представлены в таблице.
Геномные технологии (генная терапия) сегодня рассматриваются в качестве
направления, способного привести к прорыву в лечении кардиомиопатии и ИБС. Так, например, в кардиологии изучается и разрабатывается метод аденовирусных векторов для переносов генов, способных вызывать гиперплазию миоцитов, в клетки миокарда пациентов, перенесших инфаркт. Для лечения ИБС разрабатывается метод генной терапии, направленный на стимуляцию образования новых кровеносных сосудов (ангиогенез) [17, 26].
Очевиден существенный прогресс в изучении механизмов регенерации в сердечно-сосудистой системе, определении молекулярных мишеней для воздействия на регенеративные процессы
Большинство сердечно-сосудистых заболеваний являются мультифакториальными, обусловленными влиянием множества генов, каждый из которых в отдельности обладает относительно слабым действием, но комбинация их друг с другом или влияние факторов внешней среды способны индуцировать ишемическую болезнь сердца, атеросклероз, артериальную гипертензию
в тканях сердечно-сосудистой системы, определении регенеративного потенциала стволовых клеток, резидентных и полученных из пуповинной крови, жировой ткани, костного мозга. Достаточно массово ведутся экспериментальные разработки по получению клеток сердца из плюрипотентных клеток. Это направление сверхактуально для современной кардиологии и в скором времени может привести к технологическому прорыву в этой области. Результатом таких исследований будет становление новой медицинской концепции - оказание высокоэффективной помощи на ранних этапах болезни с последующим полным восстановлением структуры и функции нездорового органа.
Практическое применение:
реалии и мифы
Но уже и сейчас значимые достижения в прецизионной кардиологической науке широко применяются в клинической практике. Изучение протеома миокарда позволило внедрить в лабораторную диагностику такие маркеры, как тропо-нин, BNP (мозговой натрийуретический пептид), прогормон NT-proBNP (N-terminal of the prohormone brain natriuretic peptide), миелопероксидазу (MPO), липопротеин-ассоциированную фосфолипазу А2 (LP-PLA2). Развитие протеомики позволило при сердечно-сосудистых заболеваниях определять более 160 различных белковых маркеров, обеспечивающих более точную и эффективную диагностику. С помощью технологии рекомбинантных ДНК получен активатор тканевого плаз-миногена (АТП), который уже широко используется кардиологами для тромбо-лизиса. Успешно применяются стволовые клетки для регенерации поврежденной ткани миокарда. Разработан матричный материал для искусственных сосудов, который постепенно замещается собственными клетками организма. Создан генетический «атлас» моногенных ССЗ. Разработаны и успешно применяются на практике временные растворимые сосудистые стенты.
Конвергенция биомедицинских наук (геномики, протеомики и метаболомики) с другими научными направлениями и привлечением передовых информационных, клеточных и нанотехнологий позволяет существенно расширить возможности выявления индивидуальных рисков развития патологических процессов, обнаружения их на доклинической стадии и предотвращения их дальнейшего развития.
Однако на практике при всей заманчивости перспектив обнаружения
молекулярно-генетических маркеров, мишеней заболеваний и разработки на этой основе индивидуальных лекарственных средств их полномасштабная реализация в ближайшем будущем представляется проблематичной. Причин этому может быть несколько:
достатков и дефектов здравоохранения отводится 10%;
2) при изучении ДНК-маркеров предрасположенности к ряду заболеваний, в частности к острому ишемическому инсульту, в последние годы выявлено, что структурные особенности ряда уста-
Фармакогенетика изучает генетические детерминанты в индивидуальной изменчивости реакции на препараты, включая изменчивость в реакции на первый прием препарата и вероятность риска редких и неожиданных явлений
1) этиология большинства ССЗ, как известно, является мультифакторной; в их формировании и развитии наряду с генетическими особенностями участвуют и другие факторы риска (в первую очередь образ жизни, питания и среды обитания); более того, по широко известным данным [2], первостепенным фактором здоровья является здоровый образ жизни, который занимает 50-55% удельного веса всех факторов, обусловливающих здоровье населения; влияние экологических факторов на здоровье человека оценивается примерно в 20-25% всех воздействий, 20% составляют биологические (наследственные) факторы, и на долю не-
новленных генов определяют не столько независимый риск, сколько формирование модифицируемых факторов риска; частота генотипов ДНК-маркеров, для которых были показаны ассоциации с риском развития инсульта, в значительной степени варьируют в различных популяциях, поэтому их вклад в патогенез заболевания различен, а сами наборы ДНК-маркеров по данным разных исследователей не совпадают [3];
3) в результате анализа 35 широко цитируемых исследований оказалось, что только менее половины из предложенных биомаркеров (вариантов нуклеотидных последовательностей определенных
1 Гены, способные влиять на метаболизм фармакологических средств, используемых в кардиологической практике
Препарат Ген Выявленная ассоциация
Дигоксин ABCB1 Эффект зависит от биодоступности и клиренса
Варфарин CYP2C9 Повышение эффекта в случае гипофункционального аллеля
Лозартан, ибесартан CYP2C9 Повышение эффекта в случае гипофункционального аллеля
Метопролол, тимолол CYP2D6 У быстрых «метаболизаторов» лучший бета-блокирующий эффект
Препараты, удлиняющие QT-интервал KCNH2, KCNE2, KCNQ1, KCNE1, SCN5A Повышение риска нарушения сердечного ритма
Бета-блокаторы ADRB1,ADRB2 Повышение степени снижения ЧСС и АД
ACE Лучший ответ в случае DD-генотипа
Флувастатин ABCA1 Резистентность к препарату
Правастатин CEPT Вариабельность регрессии атеросклероза
Антитромбоцитарные препараты ITGB3 Вариабельность антитромбоцитарного эффекта
Ингибиторы АПФ AGTR1 Вариабельность снижения АД
Диуретики ADD1 Вариабельность случаев инсульта и гипотензивного ответа
Амилорид Гены эпителия Na-каналов Вариабельность эффекта у темнокожих пациентов
генов, уровней белков крови, микро-РНК и т. д.) статистически значимо ассоциированы с рисками развития ССЗ; а в более 80% случаев корреляция между биомаркерами и заболеваниями в самых первых и более часто цитируемых публикациях оказывалась значительно выше, чем в последующих и менее цитируемых статьях; поэтому авторы призывают специалистов доверять лишь данным, полученным при проведении масштабных исследований и многоцентровых анализов, а не результатам работ, впервые выявивших ту или иную закономерность, взаимосвязь [10, 18].
Немаловажными причинами являются и ограничения в использовании молекуляр-но-генетических методов: число лабораторий, способных проводить генетическое тестирование, невелико, обследование трудоемкое, дорогостоящее и нуждается в стандартизации; большинство практикующих врачей незнакомы с основами геномики и протеомики, с помощью которых генетическая неоднородность больных может повлиять на выбор тактики лечения; и, пожалуй, главное - в настоящее время нет данных клинических исследований, демонстрирующих доказательные преимущества добавления генетического тестирования к традиционным методам. Поэтому наряду с обнаружением генов, ассоциированных с тем или иным заболеванием, молекулярных биомаркеров - мишеней для фармакологических лекарственных средств, целесообразно комплементарное применение уже ставших традиционными персонализированных методов оценки рисков, раннего выявления, прогноза развития и профилактики наиболее распространенных заболеваний [5].
Но если основополагающими направлениями в познании живого будут сохраняться деление, расчленение и редукция клетки путем деления ее на части до изучаемых структур, измеряемых в нанометрах, а тенденции к еще более узкой специализации геномики и протеомики будут так же стремительно развиваться, то какие перспективы ожидают эти искусственно сужаемые научные направления? Ведь в них заложен микроструктурный подход, противопоставленный клеточной теории - основному постулату классической биологии. Одноклеточный организм и клетка (первичное образование живого) по своему строению, многопрофиль-ности процессов, их скорости, точности и производительности, способности к самоорганизации и самоуправлению не
имеют аналогов в доступном для нашего изучения пространстве. Они устроены и функционируют как биологические компьютеры. Многоклеточные организмы состоят из однотипных биологических компьютеров, функционирующих как информационные сети разной степени сложности. «Мы не имеем права искать настоящей жизнедеятельности вне клетки», - писал Р. Вирхов. Как только анатомировали многоклеточный организм и разделили клетку, человечество сразу же лишилось возможности понять живое, потому что были разрушены его главные составляющие - функциональные и информационные. Вероятно, последующее деление на изучаемые наноструктурные элементы без строгого алгоритма, объединяющего в единое целое все структурные, информационные и функциональные процессы, бессмысленно. Если перефразировать высказывание академика А. Василенко: «функция без структуры немыслима, структура без функции бессмысленна». Каждое последующее расчленение может удалять новые биологические отрасли науки от истины и делать познание живого недосягаемым. И тогда вполне обоснованы сомнения многих ученых в том, что исследование генома и нуклеотидных последовательностей, анализ протеома и последовательностей аминокислот в белках позволит человеку узнать о себе все [6-10].
Но случилось то, что должно было когда-нибудь произойти В июне 2015 г. китайские ученые сообщили о сенсационном исследовании по коррекции генома человеческого эм-
бриона [23]. Команда исследователей под руководством J. Huang из университета Сунь Ятсена в Гуанчжоу проводила опыты на нежизнеспособных эмбрионах, полученных из клиники репродуктивного здоровья. При оплодотворении «в пробирке» (и в естественных условиях тоже) в одну яйцеклетку иногда проникают два сперматозоида. Получается зародыш с одним лишним набором хромосом, который не может нормально развиваться, однако первые деления проходят как обычно. Этические аспекты (наличие информированного согласия от доноров эмбрионов) согласно китайскому
законодательству перед публикацией были тщательно проверены. Однако журналы Nature и Science статью отклонили, главным образом по этическим соображениям. Работу китайских ученых опубликовали в журнале Protein & Cell, редакция которого находится в Пекине. Исследователи попытались модифицировать ген, ответственный за развитие бета-талассемии - тяжелого заболевания крови; ген находится в 11-й хромосоме, называется HBB, кодирует белок бета-глобин. Для этого они использовали технологию CRISPR/ Cas9 (молекулярные ножницы для ДНК: комплекс белка и РНК находит нужную последовательность в геноме и «разрезает» ДНК в строго определенной точке, что открывает путь к редактированию генома).
J. Huang с соавт. впрыснули в эмбрионы матричную РНК белка Cas9 и специфическую РНК к участку-мишени, а также однонитевую ДНК, которая должна была стать заплаткой на месте разреза. Через 48 часов (достаточное время для того, чтобы CRISPR/Cas9 успела провести замену, а эмбрионы выросли примерно до восьми клеток) из 86 эмбрионов выжили 71. Ученые протестировали 54 эмбриона (из 71), чтобы проверить, сохранилась ли модификация при последующих делениях; выяснилось, что только у 28 «разрез» был сделан в нужном месте, и лишь в четырех случаях замена прошла адекватно. Более того, генетический анализ выявил множество незапланированных мутаций в других участках генома. Их
оказалось существенно больше, чем в экспериментах на мышах или на человеческих клетках в культуре [23]. И возможно, исследователи заметили не все такие мутации, поскольку они проверили только кодирующие участки генома - экзоны. Так что о практическом применении (даже не принимая во внимание этической составляющей) пока рассуждать не приходится. Но надо понимать, что так называемая прецизионная медицина высокоточных манипуляций с человеческим геномом уже существует. До настоящего времени ограничивались коррекцией
Одноклеточный организм и клетка по своему строению, многопрофильное^ процессов, их скорости, точности и производительности, способности к самоорганизации и самоуправлению не имеют аналогов в доступном для нашего изучения пространстве. Они устроены и функционируют как биологические компьютеры
лишь соматических клеток (неполовые), которые затем возвращали в организм (такая модификация не наследуется и поддается исправлению, так как срок жизни большинства соматических клеток сравнительно невелик). Специалисты в этой области китайский эксперимент не одобрили [22].
ожидать появления единой многомерной медицинской науки, раскрывающей детальные молекулярные механизмы патологий (в цепи событий, включающих гены - РНК - белки - метаболиты), с комплементарным применением инновационных и традиционных способов изучения человеческого организма для выбора оптимальных, персонально ориентированных оздоровительных, лечебно-профилактических и реабилитационных медицинских технологий.
Что касается ценности «омик» для лабораторной диагностики - это внедрение в клиническую практику новых биологических маркеров патологий. Диагностическая ценность маркеров обычно зависит от трех показателей: чувствительности, специфичности и предсказательной способности. К сожалению, маркеры с идеальной специфичностью и чувствительностью очень редки. Но, с другой стороны, причина почти всех патологий никогда не бывает единственной, чаще всего это неблагоприятное стечение многих отрицательных факторов. Возможным решением этой проблемы может стать разработка комплекса стандартных биомаркеров, которые могут повысить
предсказательную и диагностическую информативность. А поскольку биология высоких измерений позволяет установить причинно-следственные связи в цепи «ген - РНК (кодирующая или микро-РНК) - белок - метаболит», такие комплексы маркеров могут состоять из специфических олигонуклео-
литов [25]. Применение традиционных клинико-инструментальных и рутинных лабораторных методов диагностики, риск-стратификаций и прогнозирования с внедрением молекулярно-био-логических маркеров инновационных «омиксных» технологий позволит повысить эффективность индивидуально ориентированных лечебно-профилактических мер.
Все это позволит создать биомолекулярную компьютерную модель больного с возможностью лечить одновременно пациента и его интегральную молекулярно-генетическую модель болезни, построенную на основе гено-мики, транскриптомики, протеомики, метаболомики и биокибернетики, а по мере лечения на основе мониторинга их динамики корректировать и то и другое. И тогда, возможно, медицина XXI века станет прецизионной - доказательной, предиктивной, превентивной и персонализированной: предсказывающей, предотвращающей и ориентированной не на борьбу с отдельными болезнями, а на оптимальное, научно обоснованное и безопасное индивидуализированное лечение конкретного пациента.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Арчаков А.И., Згода Г.З., Копылов АТ. и др. // Украин. биохим. журн. - 2013. - Т.85, №6. - С.8-17.
2. Бобровницкий И.П., Василенко А.М., Нагор-нев С.Н. и др. // Рос. журн. восстановит. медицины. - 2012. - №1. - С.9-17.
3. Бондаренко Е.А., Шетова ИМ., Шамалов Н.А. и др. // Генетика. - 2011. - Т.47, №10. - С.1393-1401.
4. Вельков В.В. // Лабор. медицина. - 2008. - №9. -С.13-18.
5. Журавлев Ю.И., Назаренко Г.И., Рязанов В.В., Клейменова Е.Б. // Кардиология. - 2011. - №2. -С.19-25.
6. Auffray C., Charron D., Hood L. // Genome Med. -2010. - Vol.26, N2 (8). - C.57.
7. BakerM. // Nature. - 2013. - Vol.494. - P.416-419.
8. Ball P. // Nature. - 2003. - Vol.421. - P.421-422.
9. Bezprozvanny I.B. // Acta Naturae. - 2010. -Vol.2. - P.72-82.
10. Bossuyt P.M. // JAMA. - 2011. - Vol.305 (21). -P.2229-2230.
11. Dutkowski J, KramerM., Surma M.A. et al. // Nat. Biotechnol. - 2013. - Vol.31. - P.38-45.
12. Geoffrey S.P. // Eur. Heart J. - 2015. - Advance Access published online June 14.
13. Green R.C., Berg J.S., Berry G.T. et al // Genet. Med. - 2012. - Vol.14. - P.405-410.
14. Grow E.J., Flynn R.A., Chavez Sh.L. et al. // Nature. - 2015. - Vol.522. - P.221-225.
15. Haas J, Frese K.S., Peil B. et al // Eur. Heart. J. -2015. - Vol.36 (18). - P.1123-1135.
16. Hayden E.C. // Nature. - 2011. - Published online 19 May. - doi:10.1038/news.2011.304.
17. Hood L., Flores M.A. // N. Biotechnol. - 2012. -Vol.29 (6). - P.613-624.
18. loannidis J.P., Panagiotou O.A. // JAMA. - 2011. -Vol.305(21). - P.2200-2210.
19. Jain K.K. // Current Drugs. - 2002. - Vol.4 (6). -P.548-558.
20. Klotz L., Norman S., Vieira J.M. et al. // Nature. -2015. - Vol.522 (7553). - P.62-67.
21. Kohane I.S., Masys D.R., Altman R.B.// J. Am. Med. Assoc. - 2006. -Vol. - 296. - P.212-215.
22. Lanphier E., Urnov F., Haecker S.E. et al. // Nature. - 2015. - Vol.519. - P:410-411.
23. Liang P., Huang J. // Protein & Cell 2015. - Vol. 6 (5). - P.363-372.
24. Marko-Varga G., Omenn G.S., Paik Y.K., Hancock W.S. // J. Proteome Res. - 2013. - Vol.12. -P.1-5.
25. Oetting W.S., Robinson P.N., Greenblatt M.S. et al. // Hum. Mutat. - 2013. - Vol.34. - P.661-666.
26. Sobradillo P., Pozo F., Agusti A. // Arch. Bronconeumol. - 2011. - Vol.47 (1). - Р.35-40.
27. Stallmeyer B., Shulze-Bahr E. // Eur. Heart J. -2015. - Vol.36. - P.1643-1645.
28. Uchida Sh., DimmelerS. // Circulation Reseach. -2015. - Vol.116. - P.737-750.
Поступила 27.07.2015г.
Применение традиционных клинико-инструментальных и рутинных лабораторных методов диагностики, риск-стратификаций и прогнозирования с внедрением молекулярно-биологических маркеров инновационных «омиксных» технологий позволит повысить эффективность индивидуально ориентированных лечебно-профилактических мер
Но в ближайшем будущем следует тидов, белков, микро-РНК и метабо-
