CC BY
68
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРА Т ДЛЯ ИНТРА ОПЕРАЦИОННОЙ... 93
УДК 616.428-089:616-073.75 А.А. Панкратов1, Т.Н. Андреева1, Р.И. Якубовская1, А.Д. Каприн1, А.А. Конарев2, Т.В. Якунина2, Е.А. Лукьянец2 ПРЕПАРАТ ДЛЯ ИНТРАОПЕРАЦИОННОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ «СТОРОЖЕВЫХ» ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ 1«Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» - филиал ФГБУ «НМИРЦ» МЗ РФ, Москва 2ФГУП Государственный научный центр «НИОПИК», Москва Контактная информация Панкратов Андрей Александрович, старший научный сотрудник отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии адрес: 125284 Москва, 2-й Боткинский проезд, дом 3; тел.: +7(495)945-87-16 e-mail: andreimnioi@yandex.ru Статья поступила 02.11.2015, принята к печати 27.11.2015. Резюме Нами разработан оригинальный препарат Лимфотест на основе соединения из группы дисульфопроиз-водных диаминотрифенилметановых красителей, отличающийся (от Лимфозурина) положением сульфогрупп в бензольном кольце - ^[4-(4-диэтиламинофенидХ2,4-дисульфофенилметилен)-2,5-циклогексадиенилиден-1]-Ы-этилэтаминий гидроксид внутренняя соль, натриевая соль. Предлагаемое соединение спектрально практически не отличается от Лимфазурина, однако гораздо более доступно и обладает высокой лимфотропностью. Препарат Лимфотест в виде 1 %-ного водного раствора характеризуется высокой диагностической эффективностью при использовании метода прямой цветной лимфографии, низкой токсичностью (введенные дозы превышали предполагаемую максимальную дозу для человека в 50-1000 раз) и не оказывает местно-раздражающего действия при подкожном применении. Ключевые слова: «сторожевые» лимфоузлы, интраоперационная визуализация.
A.A. Pankratov1, T.N. Andreeva1, R.I. Yakubovskaya1, A.D. Kaprin1, A.A. Konarev2, T. V. Yakunina2, E.A. Lukyanets2 THE PREPARATION FOR INTRAOPERATIVE VISUALIZATION OF «SENTINEL» LYMPH NODES 1Hertsen Moscow Research Institute of Oncology, Moscow 2State Research Center «NIOPIK», Moscow Abstract We developed the original preparation Lymphotest on the basis of disulphoderivative of diaminotriphenylmet-anic dye, differing from Lymphazurin by positions if sulphogroups in benzene ring - N-[4-[[4-(diethylamino)phenyl] (2,5-disulfophenyl)methylene]-2,5-cyclohexadien-1-ylidene]-N-ethylethanaminium hydroxide, inner salt, sodium salt. The proposed compound practically does not differ by spectrum from Lymphazurin, but is much more accessible and highly lymphotropic. Lymphotest in the form of 1% aqueous solution is characterized by a high diagnostic efficiency when using direct color lymphography, low toxicity (imposed dose exceeded the anticipated maximum dose for a human in 50-1000 times) and has no locally-irritating effect when using subcutaneously. Key words: «sentinel» lymph nodes, intraoperative visualization. Введение узлах у больных злокачественными новообразованиями ассоциировано с неблагоприятным прогно- Проблема выявления регионарного лимфо- зом, так как при этом значительно повышается риск генного метастазирования злокачественных новооб- дальнейшей генерализации опухолевого процесса и разований является крайне актуальной при опухолях снижается безрецидивная выживаемость больных. различной локализации, особенно при раке молоч- Современные методы исследования (эхография, ной железы, желудка, толстой кишки, матки, щито- компьютерная и магнитно-резонансная томографии, видной и предстательной желез, меланоме. Это свя- радионуклидная диагностика и др.) не могут дать зано с высокой частотой регионарного метастазиро- точного ответа о наличии или отсутствии метастазов вания (до 85 % при раке желудка, 90 % при мелано- в лимфатических узлах. Единственным достоверным ме, 26 % при раке предстательной железы и т.д.). методом определения микрометастазов в лимфати-Наличие метастазов в регионарных лимфатических ческих узлах является морфологическое исследова-
№ 4/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ние удаленного препарата. Однако расширенные лимфадеэктомии нередко приводят к развитию различных осложнений, среди которых наиболее часто встречаются деформация, потеря чувствительности, отеки в области операции. Могут развиться также флебиты и инфекционные осложнения. В этой связи является актуальным разработка методов, обеспечивающих визуализацию лимфатических путей и регионарных лимфатических сосудов во время операции как элемента прецизионной и в то же время адекватной лимфодиссекции.
В 1977 г. R.M. Cabanas [3] впервые выдвинул концепцию сторожевых лимфатических узлов. Согласно этой концепции существует так называемый «сторожевой» лимфатический узел, в который в первую очередь осуществляется отток лимфы из определенных участков ткани и который является первым барьером, задерживающим метастатические клетки опухоли. Согласно данной концепции, именно в этом узле реализуются первые метастазы опухоли.
Целью исследования являлась разработка препарата, позволяющего осуществить визуализацию путей лимфоотока от первичного опухолевого очага и «сторожевых» лимфоузлов.
После интраоперационного введения в зону опухоли такой препарат эффективнее всего связывается с альбумином плазмы крови и лимфы и с током лимфы поступает, прежде всего, в сторожевые узлы, окрашивая их в синий цвет, легко различимый глазом (без применения специальных устройств) на фоне тканей организма. Визуализированные сторожевые лимфатические узлы удаляют и срочно (интраоперационно) анализируют морфологическими методами. Выявление микрометастазов в сторожевых лимфоузлах является показанием к проведению расширенной лимфаденэктомии, что значительно повышает эффективность хирургического противоопухолевого лечения. Контрастный метод имеет преимущество по простоте использования и безопасности. В качестве красителей в нем используют Isosulfan blue dye, индигокармин, мети-леновый синий и другие [2; 4; 5].
Основные требования, предъявляемые к этим препаратам - хорошая лимфотропность и безопасность применения. В последние годы в мире успешно развивается метод контрастирования «сторожевых» лимфоузлов, однако пока зарегистрирован только один препарат - Лимфазурин, «Isosulfan blue injection 1%» ( «Lymphazurin injection 1%») на основе дисульфопроизводного диами-нотрифенилметанового красителя - N-[4-(4-диэтиламинофенид)(2,5-дисульфофенилметилен)-2,5 -циклогексадиенилиден-1] -N-этилэтаминий гид-роксид внутренняя соль, натриевая соль (N-[4-[[4-(diethylamino)phenyl](2,5 -disulfophenyl)methylene] -2,5 -cyclohexadien-1 -ylidene] -N-ethylethanaminium hydroxide, inner salt, sodium salt).
В России в настоящее время отсутствуют официнальные препараты, аналогичные вышеприведенному по механизму действия.
Нами разработан оригинальный препарат
Лимфотест на основе соединения также из группы дисульфопроизводных диаминотрифенилметано-вых красителей, однако изомерный Лимфазурину -отличающийся положением сульфогрупп в бензольном кольце -
М-[4-(4-диэтиламинофенид)
(2,4 -дисульфофенилметилен) -
2,5 -циклогексадиенилиден-1 ] -
N-этилэтаминий гидроксид внутренняя соль, натриевая соль. Предлагаемое соединение спектрально практически не отличается от Лимфазури-на, однако гораздо более доступно и обладает высокой лимфотропностью (рис. 1).
Материалы и методы
Исследования проводили на неинбредных крысах, самках, и мышах-гибридах F1, самках, с саркомой S-37, которая метастазирует по лимфо-генному пути.
Мыши и неинбредные крысы были получены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН (филиал НЦБТ «Андреевка»).
Для контрастирования лимфатических сосудов и лимфатических узлов препарат Лимфотест в виде 1%-ного р-ра в количестве 0,2 мл вводили под кожу внутренней поверхности правого бедра (крысам), а также под кожу по периметру роста первичного опухолевого узла и в ложе опухоли (мышам с саркомой S-37).
Исследование лимфатических сосудов и лимфатических узлов осуществляли через 5; 15 и 30 мин после введения препарата Лимфотест.
По истечении указанных выше сроков животных подвергали эвтаназии путем передозировки эфира для наркоза и проводили аутопсию, исследуя область расположения паховых лимфатических сосудов и узлов справа.
При изучении элементов «острой» токсичности препарат Лимфотест вводили мышам однократно подкожно в дозах от 25 до 500 мг/кг. Оценивали клиническую картину интоксикации и гибель животных от токсичности.
При изучении местно-раздражающего действия препарата Лимфотест, его вводили крысам подкожно в готовой лекарственной форме (1%-ный р-р на фосфатном буфере) в объеме 1 мл.
Оценку местно-раздражающего действия проводили макроскопически и с использованием гистологических методов исследования.
Результаты и обсуждения
Исходным веществом для получения Лимфо-теста является распространенный краситель Кислотный ярко-голубой З; кислотный синий 1; Acid Blue 1, Sulphan Blue, Patent Blue VF (CAS 129-17-9), широко применяющийся в текстильной и полиграфической промышленности, а также как пищевой краситель [1]. Он получается конденсацией бензалвдегид-2,4-дисульфокислоты с ММ-диэтиланилино.
Таблица
Физико-химические характеристики препарата Лимфотест
Структурная формула ЗОзМа
Эмпирическая формула C27HзlN2NaO6S2
Относительная молекулярная масса М = 566,66
Внешний вид Порошок от темно-синего до фиолетового цвета
Растворимость Легко растворим в воде, растворим в этаноле
Максимум поглощения, Хмакс в воде (640+2) нм
Молярный показатель поглощения на длине волны (Хмакс) в воде (емакс), л/(моль-см) 97 000
Потеря в массе при высушивании, % 2,0
Содержание сульфатной золы, % 14,53
Содержание хлора, % 0,3
Содержание основного вещества ~ 95 %
Рис. 1. Структурные формулы лимфазурина и лимфотеста.
Рис. 2. Хроматограмма высокого разрешения препарата Лимфотест.
Рис. 3. Препарат Лим-фотест.
Рис. 4. Интраоперационная цветная лимфография подмышечного и пахового лимфатических узлов, пораженных метастазами, у мышей с саркомой S-37 с использованием препарата Лимфотест.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ИНТРАОПЕРАЦИОННОЙ... 1 97
Рис. 5. Местно-тканевые реакции после однократного подкожного введения препарата Лимфотест в виде 1 %-ного раствора. Срок наблюдения - 3 сутки.
Однако содержание основного вещества в техническом красителе (даже в красителе марки "Indicator grade" фирмы Aldrich) составляет лишь около 50 %.
Для получения активной субстанции, в ФГУП «ГНЦ "НИОПИК"» разработана оригинальная патентоспособная технология очистки технического продукта, позволяющая получать очищенное вещество с содержанием основного вещества свыше 95 %.
На рис. 2 приведена хроматограмма высокого разрешения Лимфотеста.
Совместно в ФГУП «НИОПИК» и МНИОИ им.П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России разработана лекарственная форма препарата Лимфотест - 1 %-ный р-р в фосфатном буфере для подкожного и внутриопухолевого применения; флакон 50 мг в 5 мл (рис. 3).
На предприятии-изготовителе ФГУП «ГНЦ"НИОПИК"» была выпущена готовая лекарственная форма препарата «Лимфотест» (брутто-формула C27H3iN2NaO6S2, мол. вес 566.66). Физико-химические характеристики препарата представлены в табл..
В исследованиях in vitro показано, что препарата Лимфотест, связывается, главным образом, с альбумином человека и не образует комплексов с липопротеидами низкой плотности, что способствует эффективному накоплению красителя в «сторожевом» лимфоузле.
В сравнительных исследованиях на живот-ных-опухоленосителях с метастатическим поражением лимфоузлов показано, что препарат накапли-
вается в сторожевых лимфоузлах гораздо эффективнее, чем метиленовый синий и индигокармин, и дает сходные результаты в сравнении с препаратом Лимфазурин.
Предлагаемый препарат способен проникать в лимфатические сосуды и лимфатические узлы, окрашивая последние в интенсивно синий цвет, определяемый во время хирургического вмешательства.
Это дает возможность хирургу удалить 1-3 лимфатических узла, определяемых в зоне, наиболее близкой к опухоли, провести их морфологическое исследование, по результатам которого выбрать оптимальный объем оперативного вмешательства.
В МНИОИ им. П.А. Герцена - филиале ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России - проведены пилотные доклинические исследования на крысах без опухолей (интактные лимфатические узлы, подкожное введение препарата) и мышах с перевиваемой саркомой S-37 (введение в опухоль и под кожу по периметру опухоли).
Были использованы крысы без опухолей, которым препарат вводили под кожу, а затем оценивали регионарные по отношению к месту введения препарата лимфоузлы. Лимфоузлы регионарной зоны окрашивались лимфотропным красителем и легко визуализировались.
Были использованы также мыши с перевиваемой саркомой S-37, которым препарат вводили в объеме 0,2 мл в виде 1 %-ного р-ра в зону опухоли: в ткань опухоли и под кожу по периферии роста опухоли (обкалывание опухолевого очага).
Визуализировались лимфоузлы в зоне, регионарной по отношению к локализации первичного опухолевого очага (рис. 4).
В пилотных токсикологических исследованиях была оценена переносимость животными разрабатываемого препарата при однократном подкожном введении в дозах от 25 до 500 мг/кг.
Гибель животных от токсичности отсутствовала. Введенные дозы превышали предполагаемую максимальную дозу для человека, равную 0,5 мг/кг, в 50-1000 раз.
Изучение местно-раздражающего действия разрабатываемого препарата при его однократном подкожном введении в объеме 1 мл крысам в концентрации 1,0 %, предполагаемой для применения
у человека (исходя из имеющихся данных по аналогичному препарату), показало отсутствие местно-раздражающего действия при наблюдении за животными в течение 14 дней (рис. 5).
Выводы
Разработан оригинальный препарат «лимфо-тест» на основе соединения из группы дисульфо-производных диаминотрифенилметановых красителей, предназначенный для визуализации «сторожевых» лимфоузлов, в пилотных исследованиях в системе in vivo показана его диагностическая пригодность и безопасность.
Литература
1. Степанов Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей. М: Химия, 1984. - 592 c.
2. Blessing W.D., Stolier A.J., Teng S.C.et al. A comparison of methylene blue and lymphazurin in breast cancer sentinel node mapping // Am. J Surg. - 2002. - 184(4). - P. 341-5.
3. CabanasR.M. An approach for the treatment of penile carcinoma // Cancer. - 1977. - 39. - P. 456-66.
4. Schercr K., Studer W., Figueiredo-j.V., Birchcr A.J. Anaphylaxis to isosulfan blue and cross-reactivity to patent blue V: case report and review of the nomenclature of vital blue dyes // Ann. Allergy Asthma Immunol. - 2006. - 96. - P. 497-500.
5. Schercr K., Birchcr A. J., Figueiredo-j.V. Blue dyes in medicine - a confusing terminology // Contact Dermatitis. - 2006. - 54. - P. 231-2.
