CC BY
60
УДК 579.864.1: 636.087.8
С. П. Антонова1*, Б. А. Кареткин1, Н. Г. Лойко2, И. В. Шакир1, В. И. Панфилов1
1 Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1
2 Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, 117312, Москва, ул. Проспект 60-летия Октября, д.7 к.2
*svetlanaantonova1@ramЫer.ra
ПОВЫШЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ГЛУБИННОМ ГЕТЕРОФАЗНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Проведено исследование влияния фруктанов на рост и стабильность Lactobacillus plantarum в условиях, моделирующих содержимое желудка, и при длительном хранении (4 нед., 2-10°С). Показано, что введение в состав питательной среды измельченных клубней топинамбура, а также экстракта из них позволяет повысить активность роста и конечный титр молочнокислых бактерий в 1,6 раз, а также их стабильность в кислой среде и при хранении.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, функциональное питание, пробиотики, топинамбур, глубинное гетерофазное культивирование
С каждым годом в нашей стране всё больше и больше возрастает интерес к концепции здорового «функционального питания». Вследствие постоянных стрессов, плохой экологии, малоподвижного образа жизни и многих других неблагоприятных факторов обогащенные продукты всё чаще начинают появляться в рационе современных людей. Согласно «Научной концепции функционального питания в Европе», разработанной в 1995-1998 гг, основным предназначением таких продуктов является улучшение и сохранение как физического, так и психического здоровья человека, а также уменьшение и предотвращение частоты возникновения заболеваний [1,2]. К категории функциональных относятся продукты, в которые при производстве либо добавляются новые полезные вещества (бифидо- и лактобактерии, пищевые волокна, минеральные вещества, витамины, флавоноиды, антиоксиданты, полиненасыщенные жирные кислоты), либо увеличивается концентрация уже имеющихся (кальций в молоке), либо уменьшается количество нежелательных компонентов (например, лактозы в молоке) [3].
Особое внимание уделяется кисломолочным продуктам. Ещё в 1908 году русский ученый И.И. Мечников впервые доказал их высокую ценность для здоровья. Дальнейшее развитие его идеи по энтеральному введению молочнокислых бактерий в качестве антагонистов патогенной микрофлоры привело к появлению пробиотических препаратов. В переводе с греческого термин
«пробиотик» означает «для жизни». Он имеет многовековую историю, а современная его трактовка была предложена на консультационном съезде экспертов,
организованном ВОЗ и Продовольственной и Сельскохозяйственной организацией ООН в 2001 году [4]. Согласно этому определению, «пробиотики - живые микроорганизмы, которые, будучи введены в адекватном количестве, приносят пользу здоровью хозяина» [5]. Основными представителями данной группы являются молочнокислые бактерии (МКБ) родов Bifidobacterium и Lactobacillus.
Рядом исследователей отмечено, что пробиотики в виде суспензии (что в большей степени характерно для продуктов питания) обладают рядом преимуществ перед высушенными формами, которые в процессе лиофилизации пришли в анабиоз и для своей активации требуют 8-10 часов - время, за которое большинство клеток могут выводиться из организма [6].
Одной из проблем, наиболее актуальных при использовании живых культур пробиотиков, является их устойчивость к различным неблагоприятным воздействиям. В частности, на основании клинико-экспериментальных
исследований были сделаны выводы о том, что под действием желудочного сока и желчи пробиотики теряют более 90% своей активности ещё до попадания непосредственно в кишечник [7]. Одним из способов снижения скорости гибели пробиотиков является иммобилизация клеток.
Наиболее широкое применение нашли альгинаты и их производные, иммобилизация на которых позволяет повысить выживаемость МКБ в кислой среде, моделирующей желудочный сок, а также делала их более устойчивыми к воздействию желчи и высоких температур [8, 9]. В предыдущих исследованиях также было показано, что введение в среду культивирования жома топинамбура, образующегося после выделения из клубней инулина, позволяет повысить устойчивость МКБ при длительном хранении, нагреве и замораживании-оттаивании [10]. Данный прием, послуживший основой для создания концепции кормового пробиотика, может быть применен и для создания функциональных пищевых продуктов. В данном случае необходима замена отхода переработки растительного сырья на клубни топинамбура или другие употребляемые в пищу части иных растений, которые содержали бы в достаточном количестве инулин и олигофруктаны, известные способностью стимулировать рост пробиотических
микроорганизмов и способствовать повышению их устойчивости.
Цель нашего исследования: изучить влияние измельченных клубней топинамбура, а также экстракта из них при введении в состав питательной среды на стабильность МКБ Lactobacillus plantarum в условиях, моделирующих содержимое желудка, и при длительном хранении.
Материалы и методы
Объект исследования - грамположительные анаэробные неспорообразующие молочнокислые бактерии Lactobacillus plantarum.
В ходе исследования использовали модельную подказеиновую молочную сыворотку (МС), для получения которой казеин осаждали из молока уксусной кислотой, прогревали суспензию до 60оС, охлаждали и отделяли осадок фильтрацией под вакуумом. Экстракт топинамбура получали после обработки измельчённых клубней горячей водой в соотношении 1:10, последующего охлаждения и отделения твёрдых частиц фильтрованием под вакуумом. Содержание фруктанов в экстракте определяли по разнице концентрации полисахаридов, определенных методом Бертрана-Шорля и редуцирующих веществ по Бертрану [10].
Изучение стабильности культуры проводили на трех средах различного состава: среда №1 (контроль) содержала 50 об.% МС, 50 об.% дистиллированной воды и 3 г/л дрожжевого экстракта (ДЭ); среда №2 вместо дистиллированной воды содержала 50 об.% экстракта клубней топинамбура; среда №3
отличалась от среды №1 тем, что в ее состав дополнительно вводили 10 масс.% измельченных клубней топинамбура. рН всех сред доводили до 7,0.
Культивирование проводили при 37 °C в течение 24 часов, что соответствует поздней экспоненциальной фазе роста. По окончании культивирования во всех пробах определяли содержание жизнеспособных клеток, после чего образцы помещали на хранение при температуре 2-10 °C. Определение КОЕ повторяли через фиксированные промежутки времени.
Для исследования стабильности МКБ в условиях, моделирующих содержимое желудка, доводили pH в образцах соляной кислотой до значения 2,0. КОЕ в каждой пробе определяли через каждые 30 мин. в течение 2 часов.
Для определения количества жизнеспособных микроорганизмов пользовались методом высева последовательных десятикратных разведений исследуемого образца на агаризованную среду MRS [10].
Результаты и обсуждение
Сравнение активности роста бактерий на исследуемых средах.
Молочная сыворотка - богатый субстрат с хорошими ростовыми свойствами, поэтому достаточно высокая активность роста МКБ была вполне ожидаема. Рост на средах, содержащих фруктаны, как в виде жидкого экстракта топинамбура (среда №2), так и с добавлением измельченных клубней (среда №3), оказался выше, чем на среде без фруктанов (среда №1) в 1,6 раза, что подтверждает их способность стимулировать активность роста МКБ, обнаруженную в исследованиях ряда авторов [11,12]. Необходимо отметить, что, поскольку лактоза мешает определению концентрации фруктанов в растворе, непосредственно измеряли их содержание в экстракте, где оно составляло 28,7 г/л, а среда №2 с учетом разбавления содержала 14,4 г/л фруктанов. В среде №3 определение фруктанов не проводили, однако, при соответствующем соотношении количества клубней и экстрагента, можно предположить, что и концентрация фруктанов в ней была близка к таковой в среде №2. Ростовая активность на среде №2 и №3 также была одинаковой.
Изучение стабильности L. plantarum при кислотных значенияхрН.
Введение в питательную среду твердой фазы в виде измельченных клубней топинамбура позволило в значительной степени повысить устойчивость МКБ к кислым условиям, имитирующим среду желудка. После 30 мин
экспозиции в среде №3 сохранялось 0,36% от первоначального количества жизнеспособных клеток, в то время как в остальных средах они обнаружены не были. При этом наблюдаемое во всех случаях резкое падение титра МКБ, вероятно, является характерной особенностью исследуемого штамма.
Таблица 1
Исследование стабильности Ь. р1аШагит в кислой среде, моделирующей желудочный сок
Изучение стабильности Ь. р1аШагит при хранении (2-10° С).
В рамках следующей серии экспериментов нами было изучено изменение численности жизнеспособных клеток Ь. р1а^агит в культуральной жидкости в течение 4 недель при температуре 2-10°С.
Количество жизнеспособных клеток после 4 недель хранения снижалось во всех представленных образцах сред (см. рис. 1). Однако в случае глубинного гетерофазного культивирования (среда №3) титр клеток после 4 недель хранения был в 2,4 раза выше, чем в контрольной пробе (среда №1), и в 1,3 - чем в среде №2. Данный факт подтверждает обнаруженный в предыдущих исследованиях эффект, что введение в основу питательной среды измельченных клубней топинамбура, оказывает положительное влияние на стабильность культуры.
Это может быть связано с выделением из топинамбура фруктанов. Также определенное влияние могут оказать и другие биологически активные вещества, выделившиеся из клубней в результате экстракции. С другой стороны, адгезия клеток микроорганизмов на поверхности топинамбура и, предположительно, дальнейшее
образование на ней биоплёнок также могли оказать стабилизирующее действие.
Заключение
В результате проведённого исследования установлено, что при глубинном гетерофазном культивировании измельчённые клубни топинамбура, содержащиеся в питательной среде, оказывают положительное влияние на рост молочнокислых бактерий, а также значительно повышают их жизнеспособность при длительном хранении и в кислой среде. Несмотря на то, что введение в питательную среду как пребиотических веществ, так и измельченных частей растений, являющихся источниками таковых, в равной степени увеличивает активность роста МКБ, наличие твердой растительной компоненты позволяет заметно сильнее повысить стабильность пробиотических микроорганизмов. Таким образом, включение в состав продуктов питания, содержащих живые МКБ, растительных компонентов - источников пребиотиков, является перспективным способом повышения их функциональной ценности благодаря пролонгации жизнеспособности и, как следствие, эффективности пробиотиков, в результате чего увеличивается польза продуктов для здоровья человека.
недели
-0,6 J
♦ Среда] ■ Среда 2 Ж Среда 3
Рисунок 1. Динамика численности жизнеспособных клеток Ь. р1аШагит в ходе хранения при температуре 2-10°С
Среда Кон. рн Количество жизнеспособных клеток при различной продолжительности обработки, КОЕ/мл
0 мин. 30 мин. 60 мин.
№1 4,0 (4,6±1,1)х108 - -
№2 4,0 (7,4±1,9)х108 - -
№3 4,0 (6,9±1,4)х108 (2,5±1,5)х106 -
Антонова Светлана Петровна, студентка 4 курса кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Кареткин Борис Алексеевич к.т.н., ведущий инженер кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Лойко Наталья Геннадиевна к.б.н., научный сотрудник лаборатории выживаемости микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Россия, Москва
Шакир Ирина Васильевна к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Панфилов Виктор Иванович д.т.н., проректор по научной и инновационной деятельности РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1) Bellisle F., Diplock A.T., Hornstra G. et al. Functional Food Science in Europe/ // British J. Nutrition. 1998, v.80, Suppl.1, 1-193
2) Verschuren P.M. Functional Foods: Scientific and Global Perspectives (Summary Report) // British J. Nutrition. 2002, v.88, Suppl.2, 125-130
3) Roberfroid M.B. Global view on functional foods: European perspectives // British J. Nutrition. 2002, v.88, Suppl.2, 133-138
4) Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.H., van Sinderen D. Getting better with bifidobacteria //Journal of Applied Microbiology. 2005. V. 98. № 6. P. 1303-1315.
5) Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food. - Cordoba, 2001. - 34 p.
URL: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0512e/a0512e00.pdf (дата последнего обращения 15.04.2014)
6) Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.3. Пробиотики и функциональное питание. - М. Из - во Грант. 2001. 288 с.
7) Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико- лабораторный синдром: современное состояние проблемы. - М., Гэотар-Медиа. - 2007. - С. 304-305.
8) Muthukumarasamy P, Allan W.P., Holley R.A. Stability of Lactobacillus reuteri in Different Types of Microcapsules// Journal of Food Science. 2006. V. 71. № 1. P. 20-24.
9) Bajaj P. R., Survase S. A., Bule M. V., Singhal R. S. Studies on Viability of Lactobacillus fermentum by Microencapsulation Using Extrusion Spheronization// J. of Food Biotechnology. 2010. V. 24. № 2. P. 150-164.
10) Кареткин Б.А., Лойко Н.Г., Шакир И.В., Панфилов В.И. Глубинное гетерофазное культивирование молочнокислых бактерий // Биотехнология. 2013. № 1. С. 59-68.
11) RossiM., Corradini C., Amaretti A., NicoliniM., Pompei A., Zanoni S., Matteuzzi D. Fermentation of fructooligosaccharides and inulin by bifidobacteria: a comparative study of pure and fecal cultures// J. of Applied and Environmental Microbiology. 2005, V. 71, № 10, P. 6150-6158.
12) Makras L., Van Acker G., De Vuyst L. Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 8700:2 degrades inulin-type fructans exhibiting different degrees of polymerization// J. of Applied and Environmental Microbiology. 2005, V. 71. № 11. P. 6531-6537.
Antonova Svetlana Petrovna, Karetkin Boris Alekseevich, Loiko Nataliya Gennad 'evna, Shakir Irina Vasil'evna, Panfilov Victor Ivanovich
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *[email protected]
IMPROVING STABILITY OF LACTIC ACID BACTERIA IN HETEROGENEOUS SUBMERGED FERMENTATION
Abstract
The study of effect of fructans on Lactobacillus plantarum growth and stability was carried out under simulated gastric juse conditions and those of a long-term storage (4 weeks, 2-10°C). It was shown that addition of crushed Jerusalem artichoke tubers or its extract into the growth medium composition could increase growth activity and final viable cell of lactic acid bacteria counts in 1.6 times, as well as their stability under acidic conditions and during a long term storage.
Keywords: lactic acid bacteria, functional food, probiotics, Jerusalem artichoke, heterogeneous submerged fermentation
