CC BY
75
© ЛАЗУКО С.С., СОЛОДКОВ А.П., 2012
ПОВЫШЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ АОРТАЛЬНЫХ КОЛЕЦ К НИТРОГЛИЦЕРИНУ ПОСЛЕ СОЧЕТАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
СТРЕССА И ГИПЕРГЛИКЕМИИ
ЛАЗУКО С.С.*, СОЛОДКОВ А.П.**
УО ««Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,* УО ««Витебский государственный университет им. П.М. Машерова»**
Резюме. Цель исследования - изучить сочетанное влияние иммобилизационного стресса и гипергликемии на чувствительность гладкомышечных клеток аортальных сосудов крыс к нитроглицерину как донатору N0.
Опыты были проведены на препаратах изолированного кольца аорты крыс с удаленным эндотелием. Сочетанное воздействие гипергликемии и иммобилизационного стресса сопровождается более значительным увеличением чувствительности гладкомышечных клеток аортальных сосудов к экзогенному активатору N0 нитроглицерину, чем влияние только гипергликемии или иммобилизационного стресса. Этот факт может указывать на суммирование негативного эффекта гиперпродукции N0 характерного для гипергликемии и иммобилизационного стресса в отношении активности растворимой-гуанилатциклазы (р-ГЦ) гладкомышечных клеток аортальных сосудов крыс.
Ключевые слова: иммобилизационный стресс, гипергликемия, тонус сосудов.
Abstract. The aim of the research is to study the combined impact of immobilization stress and hyperglycemia on sensitivity of smooth muscle cells of aortal vessels of rats to nitroglycerine as NO donator.
The experiments were conducted on preparations of isolated ring of rat aorta with removed endothelium. The combined impact of hyperglycemia and immobilization stress is accompanied by a more considerable increase in sensitivity of smooth muscle cells of aortal vessels to exogenous NO activator nitroglycerine compared to the impact of hyperglycemia or immobilization stress only. This fact can indicate the summation of negative effect of NO hyper-production which is typical of hyperglycemia and immobilization stress with respect to the activity of soluble guanylate cyclase (s-GC) of smooth muscle cells of rat aortal vessels.
Стресс и сахарный диабет представляют собой наиболее часто встречающееся сочетание факторов риска развития сосудистых катастроф. Одной из
Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр-т Фрунзе, 27, Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, кафедра нормальной физиологии. Тел.: 8 (0212) 37-07-54-Ла-зуко С.С.
основных причин нарушения сосудистого тонуса при развитии этих состояний является дисфункция эндотелия [2].
Среди патогенетических механизмов развития дисфункции эндотелия при сахарном диабете особое значение принадлежит гипергликемии, продуктам гли-козилирования, окислительного стресса, нарушению реологических свойств крови и липидного обмена, гиперинсулинемии,
инсулинорезистентности. В конечном итоге это приводит к нарушению сбалансированного высвобождения эндотелием факторов, регулирующих тонус сосудов, систему гемостаза, процессы межклеточного взаимодействия [2]. В результате клетки эндотелия сами становятся источником патогенных факторов, ускоряющих развитие атерогенеза.
Одним из механизмов нарушения тонуса артериальных сосудов при гипергликемии и стрессе является дисфункция системы синтеза монооксида азота, сочетающаяся со значительным образованием продуктов свободнорадикального окисления. На ранних этапах развития данная дисфункция проявляется в гиперпродукции монооксида азота, переходящая затем в снижение его биодоступности и, наконец, завершающаяся нарушением его образования.
Учитывая тот факт, что нитроглицерин, действующим началом которого является NO, остается в арсенале лекарственных средств и числится в ряду наиболее эффективных препаратов для лечения ишемической болезни сердца, а также применяется при стенокардии, представляет интерес изучить чувствительность сосудов к нитроглицерину, особенно после сочетанного воздействия гипергликемии и стресса.
В связи с этим целью исследования было изучить сочетанное влияние иммо-билизационного стресса и гипергликемии на чувствительность гладкомышечных клеток аортальных сосудов крыс к нитроглицерину, как донатору NO.
Методы
Влияние возрастающих концентраций донатора NO нитроглицерина изучали на 24 денудированных изолированных сегментах аорты крыс. Все животные были подразделены на группы: 1-ая - контрольная (n=6); 2-ая - группа животных, перенесших стресс (n=6); в 3-ю группу вошли сегменты аорты животных с гипергликемией (n=6); 4-ую составили изолирован-
ные кольца животных, перенесших стресс на фоне предварительной гипергликемии (n=6).
В опытах на изолированном кольце аорты определяли его исходное напряжение и напряжение после сокращения стандартной дозой фенилэфрина (10-6 М). Кольцо аорты изолировали по следующей методике. Каждому животному внутри-брюшинно вводили гепарин (500 ед/кг) и затем под уретановым наркозом (1 г/100 г веса тела) вскрывали грудную клетку, удаляли сердце, легкие, отпрепаровывали грудную аорту, иссекали ее фрагмент длиной 5-10 мм и помещали его в охлажденный до 4°С раствор Кребса-Хензелайта. В охлажденном растворе фрагмент аорты тщательно очищали от жировой и соединительной ткани и лезвием вырезали кольцевой сегмент шириной 3 мм. Эксперимент проводили на приборе Schuler Organ bath Type 809 (Hugo Sachs Elektronik, ФРГ). Один конец кольцевого сегмента аорты жестко фиксировали, а другой прикрепляли к рычажку датчика силы F30 Type372 (Hugo Sachs Elektronik, ФРГ). Препарат функционировал в изометрическом режиме. Приготовленный таким образом кольцевой сегмент аорты помещали в термостатируемую ванночку, заполненную раствором Кребса-Хензелайта следующего состава (мМ/л): NaCl - 118; KCl - 4,8; MgSO4 1,18; KH2PO4 -1.2; CaCl2 - 2,5; NaHCO3 - 25,0; глюкоза - 11; рН-7,4 при температуре 37°С. Раствор насыщали карбогеном (95% О2 и 5% СО2). В течение периода стабилизации, который составлял 2 часа, каждые 15 минут обновляли, омывающий препарат аорты, раствор Креб-са-Хензелайта. Регистрацию напряжения препарата, сокращающегося в изометрическом режиме, осуществляли при помощи модульного усилителя TAM-A Type 705/1 HSE. Данные заносили в компьютер, где обрабатывались при помощи программы HSE ACAD (ФРГ).
Длительный иммобилизационный стресс воспроизводили путем фиксации крыс в положении на спине в течение 6 часов. Исследование животных проводили
через 90 минут после окончания иммобилизации. Контролем служили крысы, содержащиеся в тех же условиях, что и опытные, и получавшие одинаковый рацион.
Для моделирования гипергликемии животным однократно внутрибрюшинно вводили стрептозоцин (Sigma, USA), разведенный в цитратном буфере рН 4,5 в дозе 60 мг/кг. Через 14 дней у животных оценивали следующие показатели: гипергликемию, глюкозурию. В эксперимент брали животных с уровнем глюкозы в крови выше 20 мМоль/л. Глюкозу крови определяли при помощи глюкометра Accu-Chek Aktiv (Германия), мочи - Глюко-Альбу-рН-Уротестом УП «Унитехпром БГУ». Для исключения влияния на изучаемые параметры растворителя (цитратного буфера) стрептозоцина крысам однократно внутрибрюшинно вводили равное количество цитратного буфера. Определение стабильных продуктов деградации монооксида азота проводилось в плазме крови крыс. Метод основан на восстановлении нитратов до нитритов цинковой пылью в щелочной среде в присутствии аммиачного комплекса сульфата меди с последующим фотометрическим определением нитрит-ионов с помощью реакции Грисса [3].
Обработка полученных результатов проводилась с применением пакета статистических программ Microsoft Excel 2000, STATISTICA 6.0. Для сравнения двух количественных признаков применялся t-критерий Стьюдента, а также программного обеспечения GraphPad Prism (San Diego, California, USA). Использовались методы сравнения двух независимых выборок (контроль/стресс, контроль/гипергликемия и т.п.). Результаты эксперимента выражали как среднее арифметическое плюс - минус ошибка средней величины х±Sx. Различия принимали достоверными при значении вероятности ошибки p<0,05.
Результаты
В группе животных, обработанных стрептозоцином, уровень глюкозы в крови составил 26,1±1,7 мМоль/л, то есть в 5
раз выше, чем у интактных крыс (5,2±0,9 мМоль/л, р<0,05). 6-часовой иммобили-зационный стресс приводил к снижению уровня глюкозы в крови по сравнению с интактными животными на 36% (3,3±0,6 мМоль/л, р<0,05). Стресс не оказывал влияние на уровень глюкозы в крови животных на фоне предварительной гипергликемии и значения были сопоставимы с группой «гипергликемия» (25,9±1,5 мМоль/л). В группах «гипергликемия» и «гипергликемия+стресс» в моче обнаруживались кетоновые тела и глюкоза. В крови крыс, которым однократно вводили растворитель стрептозоцина (цитратный буфер), концентрация глюкозы (5,7±1,1 мМоль/л) не отличалась от данного показателя интактных животных. В связи с этим в дальнейшем сравнение результатов проводили с группой животных, которые за 14 дней до эксперимента получали однократную инъекцию цитратного буфера, обозначая ее как контрольную («контроль»).
В группе животных, перенесших стресс, а также в группах животных с гипергликемией до и после перенесенного стресса в условиях удаленного эндотелия исходное напряжение кольца аорты было одинаковым и составляло в среднем 1830±40 мН. Под влиянием фенилэфрина (10-6 М) прирост напряжения сегмента аорты крыс между группами не различался и составил в среднем 1400±149 мН. Добавление в ванночку нитроглицерина (10-12 -10-6 М) приводило к дозозависимому расслаблению кольца аорты, предварительно сокращенного фенилэфрином. В контрольных изолированных кольцах аорты максимальная дилатация возникала при концентрации нитроглицерина в ванночке 10-6 М, и составила 95% от предварительного сокращения фенилэфрином (рис. 1). В группе животных, перенесших стресс, максимальное расслабление сегмента аорты с удаленным эндотелием наблюдалось уже при концентрации нитроглицерина в ванночке 10-7 М (91%, рис. 1). Концентрация нитроглицерина, вызывающая полумак-симальное расслабление изолированно-
Рис. 1. Влияние удаления эндотелия на чувствительность к нитроглицерину изолированного кольца аорты крыс, перенесших иммобилизационный стресс, гипергликемию и их сочетание. Примечание: по оси абсцисс - log концентрации нитроглицерина (М); по оси ординат - процент расслабления, развившегося в ответ на введение в перфузионный раствор нитроглицерина, * - р<0,05, по сравнению с контролем.
го кольца аорты крыс стрессовой группы (ЕС50), составила 2,45х10-11 М, в то время как в контроле ЕС50 - 2,65х10-10 М (табл. 1). Данный факт указывает на повышение чувствительности аортальных сосудов животных, перенесших стресс, к нитрогли-
церину. И, по-видимому, свидетельствует о сенситизации гладкомышечных клеток изолированного кольца аорты к N0.
В изолированных денудированных сегментах аорты животных с 14-дневной гипергликемией максимальная релакса-
Таблица 1
Влияние удаления эндотелия на концентрацию нитроглицерина, вызывающую 50% ответную реакцию изолированного кольца аорты на нитроглицерин и концентрацию нитратов и нитритов в плазме крови крыс, перенесших иммобилизационный стресс, гипергликемию и их сочетание
Группа ЕС50, (10-11М) 95% доверительный интервал, (10-11М) N0^0^ мкМ/л
Контроль (п=6) 26,5х10-11 13,47х10-11-52,18х10-11 24,8±0,10
Стресс (п=6) 2,45х10-11* 0,79х10-11-0,76х10-11* 34,03±2,88*
Гипергликемия (п=6) 9,46х10-11 4,17х10-11-21,48х10-11 47,40±2,54*
Гипергликемия+стресс (п=6) 0,22х10-11* 0,12х10-11-0,44х10-11* 36,18±2,89*
ция наблюдалась при концентрации донатора N0 в перфузионном растворе 10-8 М, что составило 99% от предварительного сокращения фенилэфрином (рис. 1). ЕС50 данной группы составило 9,46х 10-11 М (табл. 1), также указывая на увеличение чувствительности гладкомышечных клеток артериального сосуда. В группе животных «гипергликемия+стресс» с удаленным эндотелием введение в дозозависимой манере в перфузионный раствор нитроглицерина приводило к расслаблению кольца аорты на 96% при концентрации препарата 10-9 М. Концентрация нитроглицерина, вызывающая полумаксимальное расслабление изолированного кольца аорты крыс группы «гипергликемия+стресс» (ЕС50), составила 2,23х10-12 М (табл. 1).
Под влиянием иммобилизационно-го стресса, гипергликемии и их сочетании концентрация N02/N03 в плазме крови увеличилась на 37, 91 и 46% соответственно (табл. 1).
Таким образом, в группах животных, перенесших стресс и 14-дневную стрепто-зоциновую гипергликемию в сочетании с иммобилизационным стрессом, наблюдалось повышение чувствительности изолированных денудированных аортальных колец к нитроглицерину по сравнению с
контролем. Это сочеталось с выраженным увеличением образования монооксида азота.
Обсуждение
В результате полученных нами данных было установлено, что, во-первых, при стрессе или 14-дневной гипергликемии, а также при их сочетании происходит увеличение образования N0. Приведенные факты согласуются с данными литературы о том, что в развитии гемо-динамических изменений наблюдаемых на ранних стадиях стресса и диабета большое значение имеет увеличение продукции N0 [5, 7]. Во-вторых, в денудиро-ванных изолированных сегментах аорты крыс, перенесших иммобилизацию или гипергликемию по отдельности, выявлялось равное повышение чувствительности гладкомышечных клеток аортальных сосудов к экзогенному N0, по сравнению с контролем. Сочетание гипергликемии и иммобилизационного стресса еще в большей степени повысило чувствительность гладкомышечных клеток изолированных аортальных сосудов к экзогенному донатору N0 нитроглицерину, указывая на их суммарный эффект.
Известно, что чувствительность здоровых изолированных кровеносных сосудов к экзогенному NO (введение нитроглицерина как донатора NO) in vitro и in vivo после удаления эндотелия (денудация) возрастает [6, 9, 11]. Кроме того, пролонгированная экспозиция in vitro и in vivo сосудистой гладкой мышцы с донорами NO приводит к уменьшению ответной реакции на его последующее добавление [9, 15]. В данной работе мы впервые предположили, что степень, в которой под влиянием денудации возрастает чувствительность артериального сосуда, зависит от интенсивности исходной базальной продукции эндогенного NO, а именно то, что при его гиперпродукции она увеличивается в большей степени, чем при гипопродукции.
Deel E.D с соавторами в 2007 показали, что гиперэкспрессия конституциональной NO-синтазы снижает сосудорасширяющий эффект и чувствительность гладкомышечных клеток сосудов к монооксиду азота, вероятно, в результате изменения активности гуанилатциклазы [14]. Данные факты позволяют предположить, что в присутствии интактного эндотелия, избыточно образующего NO, как это было выявлено нами при иммобилизации, гипергликемии и их сочетании, наблюдается десенситизация растворимой гуанилат-циклазы (р-ГЦ). Взятые вместе эти факты привели нас к предположению о том, что чувствительность системы растворимой гуанилатциклазы и накопление ц-ГМФ в гладкомышечных клетках, по-видимому, регулируется количеством воздействующего на нее NO. В случае гиперпродукции она значительно снижается и наоборот, тем самым предупреждая избыточность или компенсируя недостаточность его ва-зодилататорного эффекта.
Одним из возможных механизмов, лежащих в основе этого явления, может быть то, что при стрессе, гипергликемии или их сочетании происходит длительное усиление свободнорадикального окисления и гиперпродукции NO, которые сопровождаются уменьшением количества сульфгидрильных групп (-SH), основным
источником которых в гладкомышечных клетках является восстановленный глю-татион, а также снижением содержания в них НАДФН (окислительный стресс и нитрозилирующий стресс) [4]. Причем наибольшее их снижение наблюдалось при сочетанном воздействии стресса и гипергликемии. В гладкомышечной клетке экзогенные нитраты превращаются в диоксид азота (N02) и затем в нитрозотиол ^^N0), а при участии супероксиданиона в пероксинитрит, который также приводит к нитрозилированию сульфгидриль-ных групп белковых молекул, в том числе и гуанилатциклазы. Все эти процессы, в конечном итоге, сопровождаются снижением ее активности. Кроме того, растворимая гуанилатциклаза в артериальных гладкомышечных клетках находится под контролем НАДФН, который необходим, во-первых, для восстановления тиолов и сайтов гемма молекулы р-ГЦ для того, чтобы она могла быть активирована N0 [12] и, во-вторых, для поддержания на достаточном уровне образующегося в реакции Ь-аргинин^08 супероксиданио-на и пероксида водорода, которые также оказывают выраженное влияние на активность р-ГЦ [12]. Также известно, что длительное воздействие доноров N0 на гладкомышечные клетки приводит даже к подавлению экспрессии генов, ответственных за синтез р-ГЦ [16].
Активирующийся при иммобилизации, гипергликемии и их сочетании окислительный и нитрозилирующий стресс [4] в той или иной степени приводит к различному выраженному подавлению чувствительности и/или активности р- ГЦ и других белков, содержащих в своем составе сульфгидрильные группы и ответственных за дилататорный ответ N0 (активность ц-ГМФ-зависимых протеинкиназ, фосфо-диэстеразы 5 типа и ц-ГМФ-зависимых ионных каналов) [8, 13]. В результате этого развивается состояние дисфункции эндотелия, одним из проявлений которой является снижение биодоступности N0. Устранение же эндотелия в изолированном кольце аорты как источника избы-
точного образования N0 восстанавливает чувствительность р-ГЦ к нитроглицерину. Данное предположение о неоправданном снижении активности р-ГЦ при стрессе, гипергликемии и особенно при их сочетании подтверждает и тот факт, что количество тРНК €N08 при этих состояниях в гладкомышечных клетках оказывается увеличенной [10]. Следовательно, увеличение активности р-ГЦ после удаления эндотелия вполне можно считать зависимой от предшествующего уровня избытка N0. Усиление эффекта нитроглицерина в исследуемых изолированных кольцах аорты крыс после удаления эндотелия может быть также частично связано с активацией калиевых каналов, расположенных в мембранах гладкомышечных клеток, которые уменьшают свою активность в условиях гиперпродукции монооксида азота (пост-стрессорная [1] и диабетическая каналопа-тия). Однако это предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки.
Таким образом, характерная для стресса, кратковременной гипергликемии гиперпродукция N0 сохраняется и при их сочетании. Во всех случаях в отсутствии эндотелия наблюдается повышенная чувствительность гладкомышечных клеток артериального сосуда к нитроглицерину. Причем степень чувствительности возрастает в следующей последовательности: контроль ^ стресс ^ гипергликемия ^ сочетание гипергликемии и стресса. В результате полученных фактов можно заключить, что при 14-дневной гипергликемии и ее сочетании со стрессом наблюдается дисфункция эндотелия, характеризующаяся снижением биодоступности N0, обусловленной снижением чувствительности к нему сигнального пути N0 ^ р-ГЦ ^ цГМФ.
Заключение
При сочетании гипергликемии и иммобилизационного стресса в большей степени, чем при их раздельном влиянии удаление эндотелия в изолированном кольце аорты сопровождается повыше-
нием чувствительности гладкомышечных клеток к экзогенному донатору NO - нитроглицерину. Этот факт может указывать на суммирование негативного эффекта гиперпродукции NO, характерного для гипергликемии и иммобилизационно-го стресса в отношении активности р- гц гладкомышечных клеток аортальных сосудов крыс. Однако точный молекулярный механизм, лежащий в основе этих изменений, остается не ясным и требует дальнейшего изучения. Полное понимание этой ауторегуляторной петли может иметь важное терапевтическое значение в условиях, при которых наблюдается несоответствие в продукции NO и/или активации р-ГЦ (септический шок, атеросклероз, эректильная дисфункция, толерантность к нитратам и, возможно, при стрессе и гипергликемии).
Литература
1. Лазуко, С.С. Сравнительная характеристика постстрессорных изменений функциональной активности КАТФ- и ВКСа-каналов коронарных сосудов / С.С. Лазуко, С.С. Майорова, А.П. Солодков // Вестн. ВГМУ. - 2007. - Т. 6, № 2.
- С. 39-47.
2. Лобанок, Л. М. Функциональная роль эндотелия сосудов: патофизиологические и клинические аспекты / Л. М. Лобанок, Л. С. Лукша // Мед. новости. - 1999. -Т.48, №4. - С. 21-29.
3. Солодков А. П., Веремей И.С. Восстановление NO3 в NO2 цинковой пылью в присутствии аммиачного комплекса сульфата меди // Сборник научных трудов. - Витебск, 1999. - C.274-277.
4. Bonnefont-Rousselot, D. Diabetes mellitus, oxidative stress and endothelial dysfunction / D. Bonnefont-Rousselot, J.L. Beaudeux, P.Thеrond, J.Peynet, A.Legrand, Delattre// Ann Pharm Fr. -2004. - Vol. 62, № 3. - Р. 147-157.
5. Brownlee, M. Biochemistry аnd molecular cell biology of diabetic complipations. // Nature. -2001. - Vol. 414. - Р. 813-20.
6. Dowell, F.J., Henrion, D., Duriez, M., Michel, J-B. Vascular reactivity in mesenteric arteries following chronic nitric oxide synthase inhibition in Wistar rats. // Br. J. Pharmacol. - 1996. - Vol. 117. - Р. 341-346.
7. Gabbai, F.B., Effekt NOS blockers on renalfunction // Nepnrol Dial Transplant. - 2001.
- Vol. 16. - Suppl 3. - P. 10-13.
8. Holzmann, A., Bloch, K.D., Sanchez, L.S.,
Filippov, G. Zapol, W.A. Hyporesponsiveness to inhaled nitric oxide in isolated perfused lungs from endotoxin challenged rats. // Am. J.Physiol.
- 1996. - Vol. 271. - P. L981-L986.
9. Ljusegren, M.E., Ahlner, J., Axelsson, K.L. Studies on vascular smooth muscle tolerance to different cGMP-mediated vasodilators and cross-tolerance to glyceryl trinitate. // Pharmacol. Toxicol. - 1988.
- Vol. 62. - P. 302-307.
10. Mechanisms of reduced nitric oxide/cGMPmediated vasorela[ation in transgenic mice overexpressing endothelial nitric oxide synthase / T.Yamashita [et all] // Hypertension. - 2000. - Vol. 36. - Suppl 36. - P. 97-102.
11. Moncada, S., Rees, D.D., Schultz, R., Palmer, R.M.J. Development and mechanism of a specic supersensitivity to nitrovasodilators after inhibition of vascular nitric oxide synthesis in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1991. - Vol. 88.
- P. 2166- 2170.
12. Neo, B.H, Kandhi, S., Ahmad, M., Wolin, M.S. Redox regulation of guanylate cyclase and protein kinase G in vascular responses to hypoxia // Respir
Physiol Neurobiol. - 2010. - Vol. 174, № 3. - Р. 259-264.
13. Papapetropoulos, A., G.O, C.Y., Murad, F., Catravas, J.D. Mechanism of tolerance to sodium nitroprusside in rat cultured aortic smooth muscle cells. // Br. J. Pharmacol. - 1996. - Vol. 117. - Р. 147-155.
14. Vasomotor control in mice overexpressing human endothelial nitric oxide synthase / van Deel E.D. et al. // Am J Physiol Heart CircPhysiol. - 2007. -Vol. 293. - Р. H1144-H1153.
15. Waldman, S.A., Murad, F. Cyclic GMP synthesis and function. // Pharmacol. Rev. - 1987. - Vol. 39.
- Р. 163-196.
16. Waldman, S.A., Rapoport, R.M., Ginsburg, R., Murad, F. Desensitization to nitroglycerin in vascular smooth muscle from rat and human // Biochem. Pharmacol. - 1986. - Vol. 35. - P. 35253531.
Данное исследование выполнено при поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований
Поступила 30.11.2012 г. Принята в печать 03.12.2012 г.
