ПОТЕНЦИРОВАНИЕ IN VITRO ФОСФОМИЦИНА В ОТНОШЕНИИ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ С ПОМОЩЬЮ СТАФИЦИНА Текст научной статьи по специальности «Медицинские науки и общественное здравоохранение»

МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ

УДК 579.841.11:615.015.8:[615.33+615.281]:616-092.4

ПОТЕНЦИРОВАНИЕ IN VITRO ФОСФОМИЦИНА В ОТНОШЕНИИ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA С МНОЖЕСТВЕННОЙ

ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ С ПОМОЩЬЮ СТАФИЦИНА

Никитина Анастасия Павловна,

ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова

студент

anastasiya.mka998@gmail.com

Панкратов Данил Лятифович,

ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова

студент pdl-19102000d@mail.ru

Аннотация

Стафицин, по данным исследований, обладает очень слабым антибактериальным действием в отношении грамотрицательных микроорганизмов (МПК = 500-1000 мкг/ мл), но может усиливать эффективность других антибиотиков, в частности фосфо-мицина, в отношении синегнойной палочки. При использовании диско-диффузионного и шахматного методов был показан синергетический эффект в отношении различных клинически значимых штаммов Pseudomonas aeruginosa с множественной лекарственной устойчивостью. Показано, что для некоторых штаммов усиление активности фосфомицина при потенцировании стафицином возрастало более чем в 15 раз. Выявлены комбинации с лучшими концентрациями, и они могут применяться как местно, так и системно. Однако необходимы дальнейшие исследования in vitro и in vivo, прежде чем это явление можно будет использовать в клинической практике.

Ключевые слова: стафицин, фосфомицин, потенцирование антибиотиков, множественная лекарственная устойчивость, метод «шахматной доски», Pseudomonas aeruginosa.

IN VITRO FOSFOMYCIN POTENTIATION IN MULTIDRUG-RESISTANT STRAINS OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA BY A STAPHYCIN

Nikitina Anastasiya Pavlovna,

Pavlov State Medical University of Saint Petersburg

student

anastasiya.nika998@gmail.com

Pankratov Danil Lyatifovich,

Pavlov State Medical University of Saint Petersburg

student

pdl-19102000d@mail.ru

Abstract

Staphycin, according to the research, has very little antibacterial action against gracilic microorganisms (MIC = 500-1000 ^g/ml), but it can enhance the effectiveness of other antibiotics, particularly fosfomycin against Pseudomonas aeruginosa. Using the disc diffusion and checkerboard approaches, a synergistic effect has been shown in various clinically relevant multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa strains. It was demonstrated that for some strains, the enhancement in fosfomycin activity during potentiation with staphycin increased more than 15 times. Combinations with the best concentrations were identified, and they can be produced both locally and through systemic circulation. However, further in vitro and in vivo research is needed before this phenomenon might possibly be used in clinical practice.

Keywords: staphycin, fosfomycin, antibiotic potentiation, multidrug-resistance, checkerboard method, Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa — условно-патогенный микроорганизм человека, обладающий разнообразными механизмами устойчивости к широкой группе антибиотиков [4]. Она может быть причиной многих заболеваний, в том числе пневмонии, циститов, абсцессов. Это один из самых грозных возбудителей внутрибольнич-ных инфекций. Инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa, имеют высокий уровень смертности, а у выживших могут остаться тяжелые нежелательные эффекты в результате лечения токсичными антибиотиками последней инстанции. P. aeruginosa обладает большим количеством механизмов устойчивости к антибиотикам и успешно их реализует. Она имеет широко распространенную множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). МЛУ определяется как способность микроорганизма сопротивляться проти-вомикробным препаратам 3 и более классов, структурно не связанных друг с другом и имеющих различные молекулярные мишени [6]. Распространение штаммов Pseudomonas aeruginosa с множественной лекарственной устойчивостью необходимо ограничить, но достижение этих целей затруднено из-за того, что существует мало средств, направленных на борьбу с этими штаммами, а разработка

новых лекарств является чрезвычайно длительным и трудоемким процессом. По оценкам ВОЗ, к 2023 году может быть создано и выпущено на рынок до четырех новых препаратов, но их создатели утверждают, что ни их эффективность, ни спектр их действия не позволят нам кардинально склонить чашу весов в борьбе с микроорганизмами в нашу пользу[12]. Одним из наиболее перспективных подходов в этой области является комбинирование уже одобренных препаратов с разной степенью активности против Pseudomonas aeruginosa, однако в совокупности оказывающих синергетический эффект в отношении друг друга и могут бороться с этим патогеном. Важным моментом, который следует учитывать, является то, что сочетание антибиотиков с синергетическим взаимодействием позволяет снизить дозы препаратов, что снижает риск побочных эффектов и скорость развития резистентности, сохраняя при этом возможность повышения доз в качестве резерва. Стафицин потенциально является одним из таких препаратов. Стафицин — синтетическое противоми-кробное средство, производное бензопи-ранопиримидина, по своей химической природе ацетат 7,9-дибром-2Н-[1]бен-зопирано[2,3^]пиримидин-2,4(3Н)-ди-

она. Активен в отношении грамположи-тельных микроорганизмов, таких как Staphylococcus spp., Streptococcus spp. Его антибактериальный эффект связан с подавлением синтеза бактериальной ДНК. Способность же фосфомицина проявлять синергетический эффект в настоящее время является достаточно хорошо изученным явлением. Его действие было продемонстрировано в исследованиях с полимиксином [8], амикацином, рифампицином [7], офлоксацином [11], цефотаксимом [9], амоксициллином [5].

Для подтверждения наличия эффекта потенцирования фосфомицина стафи-цином был проведен ряд экспериментов с пятью полирезистентными штаммами Pseudomonas aeruginosa: P. aeruginosa ATCC CRL-1572, P. aeruginosa ATCC 15442, P. aeruginosa ATCC 29813, P. aeruginosa ATCC 29260, P. aeruginosa ATCC 10145. Используя метод серийных разведений, на первом этапе эксперимента были определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) стафицина в отношении каждого штамма Pseudomonas aeruginosa. Были взяты концентрации стафицина 10 мкм/мл, 25 мкм/мл, 50 мкм/мл, 100 мкм/м, 250 мкм/мл, 500 мкм/мл и 750 мкм/мл, 1000 мкм/мл. Измерения проводились методом серийных разведений в соответствии с протоколами Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [3]. На дальнейших этапах исследования тем же методом определяли МПК для фосфомицина. Использовали концентрации 1 мкм/мл, 2 мкм/мл, 4 мкм/мл, 8 мкм/мл, 16 мкм/мл, 32 мкм/ мл, 64 мкм/мл, 128 мкм/мл и 256 мкм/мл.

Вторым этапом исследования было определение наличия у рассматриваемых антибиотиков синергетического действия при совместном применении стафици-на в отношении изучаемых штаммов P. aeruginosa. Для определения наличия синергического действия в комбинации со стафицином было отобрано 35 ан-

тибиотиков: Азитромицин, Амикацин, Амоксициллин + Клавулановая кислота, Ампициллин, Ампициллин + Сульбак-там, Бензилпенициллин, Ванкомицин, Гентамицин, Доксициклин, Имипенем, Карбенициллин, Кларитромицин, Клин-дамицин, Левомицетин, Левофлоксацин, Линезолид, Линкомицин, Меропенем, Не-омицин, Норфлоксацин, Рифампицин, Рокситромицин, Спарфлоксацин, Стрептомицин, Тикарциллин + Клавуланат, То-брамицин, Триметаприм + Сульфаметок-сазол, Фосфомицин, Фузидин, Цефазолин, Цефатоксим, Цефоперазон, Цефтазидим, Ципрофлоксацин, Эритромицин. Диско-диффузионный метод использовался для проверки наличия синергетического эффекта. Он проводился в соответствии со стандартами CLSI [2]. Диско-диффузионный метод был проведен на всех исследуемых штаммах для изучения потенциальных комбинаций стафицина в субэффективных дозах (50 мкг/мл для всех штаммов) с каждым из исследуемых антибиотиков в стандартных концентрациях на диагностических дисках (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Российская Федерация). В качестве питательной среды использовали колумбийский агар + рыбно-пептон-ный агар (Thermo Fisher Scientific Inc, США). Планшеты инкубировали при температуре от 35 до 37°С в окружающем воздухе в течение 24 часов. Эффективность действия оценивали, сравнивая зону полного отсутствия роста на среде с добавлением стафицина в субэффективной концентрации и аналогичную зону на среде без добавления стафицина.

Для следующих этапов исследования как наиболее эффективная была определена комбинация стафицина с фосфомици-ном. Следующая часть исследования заключалась в определении МПК фосфо-мицина для каждого штамма изучаемых бактерий по ранее описанной методике. Зависимость от концентрации синергетического эффекта комбинации стафицина

и фосфомицина была предметом последующей фазы исследования. Для этого раздела исследования использовался метод «шахматной доски», так же известный как метод перекрестного титрования. Мы использовали 96-луночные планшеты. В 1 планшете проводили 2 идентичных повтора, заполняя по 48 ячеек в каждой. В 96-луночные планшеты (Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Китай) вносили антибиотики в одинаковых на всех планшетах концентрациях по 90 мл вместе с 120 мл разбавленной бактериальной взвеси с конечной концентрацией бактерий около 5 х 105 колониеобразующих единиц в лунке (КОЕ/мл) в жидкой среде Колумбийский агар + рыбно-пептонный агар (Thermo Fisher Scientific Inc, США). Панели инкубировали при температуре от 35 до 37°С в окружающем воздухе в

течение 24 часов. Для каждого планшета измеряли оптическую плотность с помощью спектрофотометра (Awareness Technologies Inc. Stat Fax 2100 Microplate Reader, США) в каждой лунке через 0 и 24 часа. Далее определялся индекс действия сочетания антибиотиков (FICI). FICI для комбинаций антибиотиков рассчитывали по формуле: FICI = [Ae]/[Ac]+[Be]/ [Ac], где А и В - концентрации антибиотиков, с - МПК антибиотиков, применяемых поодиночке, е - МПК антибиотиков, используемых в комбинация. FICI до 0,5 интерпретируется как синергетический эффект взаимодействия, от 0,51 до 4,0 -как индифферентный и > 4,0 - как антагонистическое взаимодействие [1].

Результаты

На первом этапе определяли данные МПК стафицина по отношению к изучаемым штаммам (табл. 1). На основании полученных данных для изучения синергетического эффекта были вы-

браны концентрации стафицина значительно ниже МПК, чтобы исключить самостоятельное подавление роста бактерий антибиотиком. Для всех штаммов была взята концентрация 50 мкг/мл.

Таблица 1. Результаты испытаний синергизма нескольких комбинаций антибиотиков методом шахматной доски в отношении 5 изолятов

Pseudomonas aeruginosa

црннак Р rtpnigfpijiw АТСС1РШ Р .tjtrpjgpmfljut A JCC CRL-I.4-? Р ¿lPTItgillAtn А ТСС /5JJJ Р flpptjgppinur J ТСС 19813 Р npniginn'tfl А ТСС iflJJi [*J

ornift епнйсксч въшгмод^йсгвег;: + + + + SO

вшщнПсшк + 20

Ли li1i uieul j 114 ajhue взаи.чодгпсокг 0

МПК фосфонншиз IMKJ-'M.II т т т 2«

МПК" стафшпша [мы mj| 500 750 750 1000 1000

Диско-диффузионный метод показал, на 86%, а фосфомицин на 100%. Кон-что 2 из 35 исследуемых комбинаций — центрация стафицина с фосфомицином стафицин с фосфомицином (рис. 1) и была предметом дополнительных иссле-рифампицином — потенциально могут дований, поскольку данная комбина-оказывать синергетическое действие. ция оказалась наиболее эффективной. Рифампицин повышал свою активность

Рис. 1. Демонстрация синергетического эффекта стафицина и фосфомицина в отношении штамма P. aeruginosa ATCC 15442, при помощи диско-диффузионного метода (а) на среде без стафицина, (б) на среде со стафицином в концентрации 50

мкг/мл.

Далее методом перекрестного титрования определяли концентрации, наиболее эффективно ингибирующие рост бактерий. При этом мы ориентировались не столько на полное подавление микробного роста, сколько на кратность снижения оптической плотности взвеси в клетках. Такими концентрациями являются: 50/25 мкг/ мл стафицина + 8/16 мкг/мл фосфомицина для штаммов P. aeruginosa ATCC 29813, P. aeruginosa ATCC CRL-1572, P. aeruginosa ATCC 15442 и 100 мкг/мл стафицина + 32 мкг/мл фосфомицина для штамма P. aeruginosa ATCC 29813 (Рис. 2). Произведен расчет коэффициента снижения оптической плотности взвеси в лунках с оптимальными концентрациями антибиотиков в комбинациях, по отно-

шению к контрольным ячейкам, с антибиотиками отдельно в соответствующих концентрациях, а также к контрольной ячейке, содержащей чистую бактериальную взвесь. Для этого соответствующие значения 0 часов вычитали из значений оптической плотности после инкубации в течение 24 часов. В результате оптическая плотность снизилась на 120-380% относительно контроля фосфомицина в концентрациях 8 и 16 мкг/мл, на 120570% относительно контроля стафицина в концентрациях 25 и 50 мкг/мл, и на 200880% относительно контрольной ячейки в зависимости от тестируемого штамма. В отношении штамма P. aeruginosa ATCC 10145 выраженного синергетического эффекта не было выявлено.

t ■ п и H»

1

1Ь

Я

H

ku

ля

Ht

, m

(*h

нрН1 в » к « с Ol

6

H

il

M

1»

IM

Un

na

4 1 HL Jt H Ul

4 1

16

К

JO

'W

Uü

Чч

m

1 ■ : n H in

_t_

Л-

к

in :

rw

44«

rui 1

ui

Рис. 2. Различие оптической плотности клеток в исследуемых пластинах. Градиент плотности показысвает интенсивность роста бактерий в каждой клетке. (а) P. aeruginosa ATCC 29260, (б) P. aeruginosa ATCC 15442, (c) P. aeruginosa ATCC CRL-1572, (d) P. aeruginosa ATCC 29813. Горизонтальная линия (концентрация 0-128 мкг/мл) для фосфомицина, вертикальная линия (концентрация 0-750 мкг/мл) для

стафицина.

Таким образом, наше внимание привлекли явления потенцирования стафицина и фосфомицина при оценке наличия синергизма в комбинациях антибиотиков со стафицином, так как прирост эффективности составил 100%. Из данных МПК для каждого антибиотика можно заключить, что существует определенное синергическое взаимодействие между фосфомицином и стафицином (FICI <0,5) и что эффективные концентрации обоих антибиотиков в их комбинациях значительно ниже (в 5-16 раз). Синерге-тический эффект явно зависит от дозы, поскольку уровни эффективности различных комбинаций антибиотиков различаются. Из-за возможности достижения самых высоких уровней концентрации антибиотика в системном кровотоке мы рекомендуем разделить оптимальные дозы на две категории: для системного применения и для местного применения. Наиболее эффективны комбинации концентраций антибиотика для системного кровообращения: стафицин 10 мкг/мл +

фосфомицин 32/64 мкг/мл для штаммов P. aeruginosa ATCC 29260, P. aeruginosa ATCC CRL-1572, P. aeruginosa ATCC 15442 и стафицин 25 мкг/мл + 32/64 мкг/мл. мл фосфомицина или 10 мкг/мл стафицина + 128 мкг/мл фосфомицина для штамма P. aeruginosa ATCC 29813. Для местного применения оптимальными концентрациями антибиотиков для штаммовP. aeruginosa ATCC 29260, P. aeruginosa ATCC CRL-1572 и P. aeruginosa ATCC 15442 являются 50/25 мкг/мл стафицина + 8/16 мкг/мл фосфомицина и 100 мкг/мл стафицина + 32 мкг/мл фосфомицина. Эти комбинации сохраняют определенный синергетический эффект. При подборе концентраций антибиотиков учитывалось значимое снижение оптической плотности. Использование данного явления в клинической практике требует дальнейших исследований in vitro и in vivo. Будущие исследования будут сосредоточены на механизме синергизма между стафицином и фосфомицином, но пока мы можем сделать вывод, что этот

эффект связан с тем, что два препарата действуют на разные мишени. Фосфоми-цин ингибирует фермент УДФ-^ацетил-глюкозамин-енолпирувилтрансферазу, которая отвечает за начальный этап синтеза пептидогликана, представляющий собой взаимодействие УДФ-^ацетилглю-козамина (УДФ-GlcNAc) с фосфоенолпиру-

ватом (ФЕП) с образованием УДФ-GlcNAc [10]. Вероятно, способность фосфомици-на влиять на продукцию пептидогликана облегчает проникновение стафицина в бактериальную клетку, ускоряя транспорт стафицина к бактериальной ДНК - предполагаемой мишени его действия.

Список использованных источников:

1. Berenbaum, M. C. (1978). A Method for Testing for Synergy with Any Number of Agents. Journal of Infectious Diseases, 137(2), 122-130.

2. CLSI. 2018. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. 11th ed, Wayne, USA.

3. CLSI. 2018. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed., Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, USA.

4. Dawadi P, Khadka C, Shyaula M, Syangtan G, Joshi TP, Pepper SH, Kanel SR, Pokhrel LR. Prevalence of metallo-ß-lactamases as a correlate of multidrug resistance among clinical Pseudomonas aeruginosa isolates in Nepal. Sci Total Environ. 2022 Dec 1;850:157975.

5. Di Nola F, Soranzo ML. Studio comparativo su volontari sani della biodisponibilitä di due formulazioni farmaceutiche di una cofosfolattamina orale: Esperienza entro soggetti [Comparative study, on healthy volunteers, of the bioavailability of 2 pharmaceutical formulations of oral cofosfolactamines. Trials between subjects]. Minerva Med. 1983 Feb 18;74(6):239-48. Italian. PMID: 6828256.

6. Jyoti Tanwar, Shrayanee Das, Zeeshan Fatima, Saif Hameed, «Multidrug Resistance: An Emerging Crisis», Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, vol. 2014, Article ID 541340, 7 pages, 2014.

7. March GA, Bratos MA. A meta-analysis of in vitro antibiotic synergy against Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 2015 Dec;119:31-6.

8. Scudeller L, Righi E, Chiamenti M, Bragantini D, Menchinelli G, Cattaneo P, Giske CG, Lodise T, Sanguinetti M, Piddock LJV, Franceschi F, Ellis S, Carrara E, Savoldi A, Tacconelli E. Systematic review and meta-analysis of in vitro efficacy of antibiotic combination therapy against carbapenem-resistant Gram-negative bacilli. Int J Antimicrob Agents. 2021 May;57(5):106344.

9. Shimokata K, Torigai K, Kato M, Sakai S, Nomura F, Ito T, Saka H, Senda Y, Torii Y, Ito T, et al. [Effects of cefotaxime single administration and of cefotaxime + fosfomycin administration against respiratory tract infections]. Jpn J Antibiot. 1988 Sep;41(9):1261-71. Japanese. PMID: 3071617.

10. Silver LL. Fosfomycin: Mechanism and Resistance. Cold Spring Harb Perspect Med. 2017 Feb 1;7(2):a025262. PMID: 28062557

11. Weber P, Boussougant Y, Ichou F, Dutoit C, Carbon C. Bactericidal effect of ofloxacin alone and combined with fosfomycin or vancomycin against Staphylococcus aureus in vitro and in sera from volunteers. J Antimicrob Chemother. 1987 Dec;20(6):839-47.

12. Всемирная организация здравоохранения: официальный сайт. - 2022 URL: https:// www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (дата обращения: 10.12.2022) - Текст электронный

© Никитина А.П., Панкратов Д.Л., 2022