CC BY
36
Биомедицина • № 2, 2015, С. 73-79
Потенцирование гепарином антиноцицептивного действия нейропептида FMRFа на супраспинальном уровне
А.Е. Хомутов, К.А. Пурсанов, О.В. Лушникова, З.В. Перепелюк
ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород
Контактная информация: д.б.н. ХомутовАлександр Евгеньевич, kfg@bio.unn.ru
В опытах на крысах с использованием теста «горячей пластины («hot plate») и регистрацией латентного периода реакции облизывания лапок установлено потенцирующее действие гепарина на ан-тиноцицептивный эффект нейропептида FMRFa. Протамина сульфат, Налоксон и Обзидан снижали антиноцицептивный эффект FMRFa. Гепарин блокировал антианальгетическое действие Протамина сульфата, Налоксона и Обзидана.
Ключевые слова: нейропептид FMRFa, гепарин, Протамина сульфат, Налоксон, Обзидан.
Введение
Нейропептид БМЯРа отнесен к семейству опиоидных пептидов группы параопиоидов, в которую входят также около двух десятков представителей. Регуляторные пептиды семейства БМЯРамида активно исследуются уже более трёх десятилетий, однако данные относительно механизма их действия у млекопитающих весьма противоречивы [18]. Некоторые авторы приписывают пептидам этого семейства способность активировать симпатическую нервную систему, также было показано, что симпатомиметические эффекты БМЯРа при системном введении обусловлены его способностью взаимодействовать с периферическими а- и Р-адренорецепторами [12]. С другой стороны, РМИРамиды способны взаимодействовать с опиатными рецепторами, причем их действие зависит от уров-
ня, на котором рассматривается система. Так, на простых тест-системах (активность ферментов) у них проявляются антагонистические свойства, на более сложных тест-системах РМИРамиды могут вести себя как агонисты или антагонисты, или же эффект отсутствует [7]. В мозге и гипофизе крыс обнаружено широкое представительство БМЯР-иммунореактивных нейронов, которые, возможно, образуют новую, относительно независимую пептидергическую систему. Из литературы [2] известно, что РМКРа-подобные пептиды могут образовываться путем ограниченного проте-олиза из некоторых опиоидных пептидов: УООРМКР-КН2, локализованного преимущественно в надпочечниках, и геморфин-подобных пептидов ЬУУР-WTQRF и VWVРWTQRP, выделенных из гомогенатов головного мозга и являющихся фрагментами 31-40 и 32-40
Р-цепи гемоглобина [3]. Таким образом, данные факты указывают на существование связи между эндогенной опиоид-ной и симпато-адреналовой системой: фрагменты параопиоидов, образующиеся в результате их ограниченного про-теолиза, обладают способностью взаимодействовать с адренорецепторами, и, возможно, служат в качестве функциональных антагонистов своих предшественников (эндоопиоидов) [7].
Существенную роль в проявлении эффектов РМИРа, как и многих других веществ, играет количественный эквивалент применяемого пептида, при внутрибрюшинном введении крысам в дозе 5 мг/кг РМИРа оказывает действие, сходное с введением адреналина в той же дозе, т.е. угнетение двигательной активности, саливация, пилоэрекция, гипергликемия, отек легких. Блокада альфа-адренорецепторов дигидроэрго-тамином (2 мг/кг) отменяла данные патологические изменения; с другой стороны, введение пептида в дозе 0,1 мг/кг, как и применение адреналина в той же дозе, не приводило к существенным морфологическим отличиям от контроля [8].
В литературе имеются данные об анальгетической активности многих представителей семейства (№РР, №АР, МРБР) РМИРа-подобных пептидов. Интратекальные инъекции РМИРа и МРРР способны вызвать гиперанальгезию у крыс, а также пролонгируют мор-финовую анальгезию [13, 16]. Показана их роль в регуляции боли на спиналь-ном уровне на модели воспалительных болей, вызванных каррагеновыми инъекциями, а также при термической болевой стимуляции, при этом значительно возрастает уровень тИ^А в спинном
мозге, кодирующей №РР прекурзор [14].
Как известно, полифункциональный мукополисахарид гепарин широко представлен в организме млекопитающих и характеризуется уникальной способностью к взаимодействию с эндогенными белками и полипептидами, осуществляющими регуляторные функции [4-6]. В связи с этим, оценивать активность в организме того или иного пептида без изучения влияния на этот процесс гепарина является, на наш взгляд, неконструктивным.
Целью работы явилось изучение процессов пролонгирования гепарином антиноцицептивного действия нейро-пептида РМИРа на супраспинальном уровне, а также влияния на этот процесс Протамина сульфата, Налоксона и Об-зидана.
Материалы и методы
Для исследования были использованы 90 половозрелых беспородных крыс-самцов массой 200±10 г, содержащихся на общем рационе вивария. Животные были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово» РАМН. Исследования осуществляли в соответствии с правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к Приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.), «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 г. и ФЗ РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. Животные содержались в одинаковых стандартных условиях в пластиковых клетках с автопоилками, получали полноценный комбикорм и
очищенную водопроводную воду ad libitum. В качестве подстилки использовали древесные опилки из нехвойных пород деревьев.
В качестве исследуемых веществ использовались следующие препараты:
1) высокомолекулярный гепарин (произв. Московского эндокринного завода), содержащий в 1 мл раствора 5000 МЕ (1МЕ=0,0077 мг);
2) FMRFa, синтезированный в ГНЦ РАМН;
3) Протамина сульфат (произв. Московского эндокринного завода), содержащий 10 мг сухого вещества в 1 мл раствора;
4) Налоксон (произв. Варшавского фармацевтического завода «Польфа»), содержащий 0,4 мг действующего вещества в 1 мл растовора;
5) Обзидан (произв. «ISIS PHARMA GmbH»), содержащий 1 мг пропраноло-ла в 1 мл раствора.
Исследуемые вещества вводили вну-трибрюшинно в объёме 1 мл в определённой последовательности, предусмотренной условиями опыта. Временной интервал между введениями был постоянным и составлял 10 мин.
При исследовании антиноцицептивного действия FMRFa использовали тест «горячей пластины («hot plate»), который даёт общее представление о действии веществ на супраспинальном уровне [9]. Животное помещали на пластину, нагретую до 57-58°С, температура поверхности пластины регулировалась термостатом. По секундомеру засекалось время от момента помещения животного на пластину до момента первого облизывания лап (задних), что и составляло латентный период реакции облизывания лап (ЛП РОЛ). Макси-
мальное время нахождения животного на пластине - 25 сек.
Анальгетический эффект оценивался в процентах от значений контрольной группы, принимаемой за 100%. Для оценки использовались медианы. Это связано с тем, что средняя арифметическая очень подвержена влиянию крайних членов вариационного ряда, наименее характерных для данной совокупности, что в случае использования нами небольших выборок (6-10 особей в группе) недопустимо. Кроме того, определённые ограничения продолжительности измерения вообще исключили в ряде опытов возможность использования какой-либо другой обобщающей характеристики. Поэтому в наших опытах использование медианы являлось наиболее оправданным.
Достоверность различий между группами оценивалась с использованием непараметрического критерия Уилкок-сона-Манна-Уитни для независимых совокупностей. Для множественных сравнений применяли критерий Данна [1].
Результаты и их обсуждение
Внутрибрюшинное введение РМИРа в дозе 0,1 мг/кг сопровождается увеличением времени ЛП РОЛ, что говорит об антиноцицептивном действии параопиоида (табл.). Анальгетический эффект РМИРа потенцируется на фоне действия гепарина в дозе 500 МЕ/кг, что выражается в продолжительности эффекта. Так, если при введении РМИРа максимальный эффект регистрируется только в течение первых двух минут от момента инъекции, то на фоне действия гепарина продолжительность анальгетического эффекта увеличивается до 60 мин.
Таблица
Влияние РМКРа, гепарина и Протамина сульфата на ЛП РОЛ (%) у крыс
Условия опыта Время после введения веществ, мин
20 40 60 90 150
Контроль (физиол. раствор) 100 100 100 100 100
FMRFa (0,1 мг/кг) 223,4* 105,4 130,8* 118,4 126,0
Гепарин (500 МЕ/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг) 188,3*+ 204,3*+ 167,0*+ 98,0 145,1*
Протамина сульфат (10 мг/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг) 84,3+ 92,6+ 72,1*+ 80,5+ 97,2+
Протамина сульфат (10 мг/кг) ^ гепарин (500 МЕ/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг) 145,5*+ 150,2*+ 117,6 158,2*+ 102,4
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем;
+ - р<0,05 по сравнению с БМКБа.
Блокада эндогенного гепарина Протамина сульфатом с последующим введением РМИРа характеризуется реверсией анальгетического эффекта, а ЛП РОЛ в течение всего времени наблюдения достоверно ниже показателей группы крыс, которым вводили РМЯРа. Интересные данные были получены при последовательном введении Протамина сульфата, гепарина и РМЯРа. В этом случае величина ЛП РОЛ была ниже показателей РМЯРа, но выше контрольных величин (табл.).
Предварительное введение Налок-сона, являющегося антагонистом опи-атных рецепторов, в дозе 1,0 мг/кг, с последующей внутрибрюшинной инъекцией РМЯРа характеризовалось блокадой антиноцицептивного действия РМЯРа, причём в течение 60 мин ЛП РОЛ резко отличался от аналогичного результата при введении только РМЯРа. Введение исследуемых веществ по схеме «Налоксон ^ гепарин ^ РМИРа»
сопровождалось значительным снижением ЛП РОЛ в течение 40 мин от момента введения относительно группы с введением только РМЯРа и увеличением ЛП РОЛ в течение всего времени наблюдения при введении по схеме «Налоксон ^ РМИРа» (рис. 1).
Обзидан, являющийся неселективным Р-адреноблокатором, снижает ан-тиноцицептивное действие РМЯРа, а при введении по схеме «Обзидан ^ гепарин ^ РМИРа» анальгетический эффект РМЯРа в значительной степени увеличивается по сравнению с результатом работы по схеме «Обзидан ^ РМЯРа» (рис. 2).
Таким образом, данные фармакологического анализа показывают, что антиноцицептивное действие РМЯРа связано с активацией опиоидэргической и адренергической систем. На фоне блокаторов гепарин способствует проявлению анальгетической активности РМЯР-пептида.
'40
411
20 40 «0 9(1 150
I'. | М МИ 11111 [ L »üt'Jlllllll Щ
Рис. 1. Влияние FMRFa, гепарина и Налоксона на ЛП РОЛ (%) у крыс.
1 - Контроль (физиол. р-р);
2 - FMRFa (0,1 мг/кг);
3 - Гепарин (500 ME/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг);
4 - Налоксон (1 мг/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг);
5 - Налоксон (1 мг/кг) ^ гепарин (500 ME/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг). Примечание: *-р< 0,05 по сравнению с контролем;
+ -р< 0,05 по сравнению с FMRFa.
ISO
tu
20 40 60 90 150
]1]>емя noc.it Ы1< I
Рис. 2. Влияние FMRFa, гепарина и Обзидана на ЛП РОЛ (%) у крыс.
1 - Контроль (физиол. р-р);
2 - FMRFa (0,1 мг/кг);
3 - Гепарин (500 ME/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг);
4 - Обзидан (1 мг/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг);
5 - Обзидан (1 мг/кг) ^ гепарин (500 ME/кг) ^ FMRFa (0,1 мг/кг). Примечание: *-р< 0,05 по сравнению с контролем;
+ -р< 0,05 по сравнению с FMRFa.
Анализируя возможные механизмы потенцирующего действия гепарина на антиноцицептивный эффект FMRFa, особого внимания заслуживают взаимоотношения гепарина с медиаторны-ми системами, в т.ч. и с рецепторами. Так, оказалось, что гепарин влияет на десенситизацию S-опиоидных рецепторов, подавляет неконкурентным способом связывание с сигма-рецептором опиоидов ЗН+-К-аллилнорметазоци-на в микросомальной фракции мозга и мембран печени крыс [20]. Гепарин уменьшает фосфорилирование дельта-опиоидных рецепторов, соединенных с G-белком (GPCR), и, как следствие, снижает гипосенсибилизацию, вызванную специфическим опиоидным агонистом эторфином и D-Ala2,-D-Ьеи5-энкефалином (DADLE) [15, 17]. Гепарин блокирует выход Ca2+ [17, 19, 21], также как ингибитор инозитол 1,4,5-трисфосфата, гепарин реверсирует развитие морфиновой толерантности [19]. Процесс десентизации, т.е. уменьшение чувствительности (гипо-сентизация) и сокращение числа рецепторов на клеточной поверхности (интернализация) показаны не только для опиоидных рецепторов, но и для других, также принадлежащих к GPCR (в частности, р2-адренергических и а2-адренергических), для А1-аденози-новых рецепторов и м2-мускариновых рецепторов [10, 11]. Недавно были изучены рецепторы FMRFa-пептидов человека, они также относятся к классу GPCR [16]. Роль гепарина как неспецифического блокатора протеинкиназы доказана для опиоидных рецепторов и для Р-адренергических рецепторов. Возможно, взаимодействуя с данным видом рецепторов, гепарин уменьшает
процесс десенситизации, вызванный воздействием синтетических агони-стов, тем самым повышает чувствительность рецепторов к анальгетикам и, соответственно, при прочих равных условиях пролонгирует анальгетиче-ский эффект.
Выводы
В реализации анальгетического эффекта нейропептида FMKia (в дозе
0.1.мг/кг) принимают участие опиоид-ная и Р-адренергическая системы. На фоне действия гепарина (500 МЕ/кг) антиноцицептивное действие параопи-оида усиливается. Протамина сульфат, Налоксон и Обзидан снижают аналь-гетическое действие FMRFa. Гепарин, включённый в схему последовательных введений, снижает антианальгетическое действие Протамина сульфата, Налоксо-на и Обзидана.
Список литературы
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика. 1999. 459 с.
2. Гомазкое O.A. Современные тенденции в исследовании физиологически активных пептидов // Успехи совр. биологии. 1996. Т. 116.№1.С. 60-68.
3. Иеаное В.Т., Карелин A.A., Михалёеа И.И. Выделение, структура и свойства новых эндогенных пептидов // Биоорганическая химия. 1992. Т. 18. № 10-11. С. 1271-1311.
4. Каркищенко H.H. Психоунитропизм лекарственных средств. - М.: Медицина. 1993. 208 с.
5. Кондашееская М.В. Тучные клетки и гепарин - ключевые звенья в адаптивных и патологических процессах // Вестник РАМН. 2010. № 6. С. 49-54.
6. Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Пастороеа В.Е. Противосвёртывающие эффекты комплексного соединения высокомолекулярного гепарина с аргинином // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т. 147. № 3. С. 300-303.
7. Парин С.Б., Зимин Ю.В., Крылов В.Н.
Применение пептидов опиоидного ряда в экспериментальной терапии шока // Антиги-поксанты и антипротекторы / Мат-лы конф. - СПб. 1994. Вып. 4. С. 272-273.
8. Пономаренко A.A., Тиняков Р.Л. Эдемоген-ное и гипергликемическое действие FMRF-амида // Сб. работ мол. ученых биол. ф-та ННГУ.-Н. Новгород. 1998. С. 113-114.
9. Северьянова Л.А., Бобынцев И.И., Кирьянова H.A., Долгинцев М.Е. Эффекты L-аргининана различные виды болевой чувствительности // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 141. № 5. С. 503-506.
10. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. - Волгоград: Изд-во «Семь ветров». 1999. 640 с.
11. Судаков С.К., ТригубМ.М. Гипотеза реципрок-ного взаимодействия центрального и периферического звена эндогенной опиоидной системы // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 146. № 12. С. 604-607.
12. Тиняков Р.Л., Парин С.Б., Крылов В.Н. Реанимирующее действие FMRFа-подобных пептидов при клинической смерти у крыс // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. 1996. № 4. С. 417-418.
13. Gouarderes С., Sutak М., Zajac J.M. Antinociceptive effects of intrathecally administrered F8Famide and FMRFamide in the rat // Eur. J. Pharmacol. 1993. Vol. 237. P. 73-81.
14. Ferdinand S. Gene for pain modulatory Neuropeptide NPFF: induction in spinal cord by
noxious stimuli // Mol. pharm. 1999. Vol. 55. № 4. P. 804-811.
15. Hasbi A., Polastron J., Allouche S. Desensi-tization of the delta-opioid receptor correlates with its phosphorylation in SK-N-BE cells: involvement of a G protein-coupled receptor kinase // J. Neurochem. 1998. Vol. 70. N 5. P. 2129-2138.
16. Kontinent V., Kalso E. Differential modulation of a2-adrenergic and ^-opioid spinal antinoci-ception by neuropeptide FF // Peptides. 1995. Vol. 16. P. 973-977.
17. Morikawa H., Fukuda K., Mima H. Desen-sitization and resensitization of delta-opioid receptor-mediated Ca2+ channel inhibition in NG108-15 cells // Br. J. Pharmacol. 1998. Vol. 123. N 6. P. 1111-1118.
18. Raffa R.B. The action of FMRFamide and related peptides on mammals // Peptides. 1998. V. 9. P. 915-922.
19. Smith A., Surviladze Z., Gaudet E. A p110p and p110S phosphatidylinositol 3-kinases up-regulate FcsRI-activated Ca2+ influx by enhancing inositol 1,4,5-trisphosphate production // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. № 20. P. 17213-17220.
20. Tsao L.I., Su T.P. IP3 receptor antagonist heparin uncompetitively inhibits [3H](+)-SKF-10047 binding to sigma receptors // Eur. J. Pharmacol. 1996. Vol.311.N1.P. 28-36.
21. Yoon S.H., Lo T.M., Loh H.Y.H. Delta-opioid-induced liberation of Gbettagamma mobilizes Ca2+ stores inNG108-15 cells // Mol. Pharmacol. 1999. Vol. 56. № 5. P. 902-908.
Potentiation of antinociceptive effect of neuropeptide FMRFa by heparin on supraspinal level
A.E. Khomutov, K.A. Pursanov, O.V. Lushnikova, Z.V. Perepelyuk
In experiments on rats using a test "hot plate" and the registration of the latent period of the reaction licking feet potentiating effect of heparin on the antinociceptive FMRFa effects was established. Protamine sulphate, Naloxone and Obzidan reduced antinociceptive FMRFa effects. The heparin blocked the anti-analgetic action of Protamine sulfate, Naloxone and Obzidian.
Key words: neuropeptide FMRFa, heparin, Protamine sulphate, Naloxone, Obzidian.
