CC BY
32
УДК 579.843.1:579.26:616-022.1:614.7 Б01 10.18522/0321-3005-2016-1-80-83
ПОТЕНЦИАЛЬНАЯ ВОЗМОЖНОСТЬ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ БИОПЛЁНКАМИ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА
© 2016 г. С.В. Титова, Л.М. Веркина, Л.К. Лысова
Титова Светлана Викторовна - кандидат медицинских наук, директор Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: svetatitova@bk.ru
Веркина Людмила Михайловна - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: labbi-obez@mail.ru
Лысова Людмила Константиновна - научный сотрудник, Ро-стовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: labbiobez@mail.ru
Titova Svetlana Viktorovna - Candidate of Medical Science, Director of the Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service on Supervision in the Sphere of Consumer Rights Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: svetatitova@bk.ru Verkina Lyudmila Mikhailovna - Candidate of Medical Science, Head of Laboratory, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service on Supervision in the Sphere of Consumer Rights Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: labbiobez@mail.ru
Lysova Lyudmila Konstantinovna - Researcher, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service on Supervision in the Sphere of Consumer Rights Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: labbiobez@mail.ru
Создана экспериментальная система с использованием биоплёнки холерного вибриона для моделирования экологических процессов, реально возникающих в различных объектах окружающей среды. Изучены возможности использования биоплёнки холерного вибриона в качестве патогенного биологического агента путём инфицирования водных объектов бактериями V. cholerae, диспергируемыми из биоплёнок. Показано, что скорость контаминации зависит от зрелости биоплёнки, температуры водной среды и объёма резервуара.
Ключевые слова: экспериментальная биологическая/экологическая модель, возбудитель холеры, биопленка, контаминация водной среды.
An experimental system is presented with the use of Vibrio cholerae biofilm intended for modeling of ecological processes, actually occurring in different environmental objects. The authors have examined the possibilities of cholera vibrio biofilm usage as a pathogenic biological agent by way of water object infecting by V. cholerae bacterial cells dispersed from biofilms. It is demonstrated that the rate of contamination depends on biofilm maturity, water temperature and reservoir volume.
Keywords: experimental biological/ecological model, causative agent of cholera, biofilm, contamination of aqueous environment.
Холера является эндемичным заболеванием в 80 странах и остается угрозой для всех стран мира, так как существует реальная возможность завозов возбудителя инфекции. В РФ за последнее десятилетие зарегистрировано 42 завозных случая холеры в 19 регионах страны. Завозной характер подтвержден при изучении штаммов V. cholerae О1 и О 139 на молекулярном уровне.
На эндемичных территориях основной причиной вспышек холеры является фекальное загрязнение питьевой воды, но наряду с этим актуальными становятся и другие пути передачи возбудителя холеры. Не исключена возможность распространения инфекционных заболеваний, в том числе и холеры, посредством переноса возбудителей на пластиковом мусоре, в гигантском количестве плавающем в Мировом океане. Появляется совершенно новый термин - «пластисфера» [1]. Но до сих пор нет достаточных данных, раскрываю-
щих микробиологическую составляющую пласти-сферы, и не проводятся исследования по изучению факторов внешней среды, способствующих распространению инфекционного агента.
Кроме того, в настоящее время остаётся реальной угроза использования холеры как патогенного биологического агента (ПБА) в качестве биологического оружия в террористических целях, поэтому немаловажно прогнозировать скорость инфицирования возбудителем предполагаемого объекта заражения для осуществления своевременной деконтаминации.
В связи с этим появляется необходимость в моделировании неких экологических процессов, реально возникающих в различных биотопах, и получении экспериментальных данных о роли внутренних и внешних факторов, влияющих на микробиологическую составляющую модели.
На сегодняшний день образование биопленок (БП) различными видами патогенных для человека
бактерий, в том числе возбудителем холеры, признано универсальным способом их сохранения и обеспечения конкурентоспособности в различных экологических нишах [2-4]: этот феномен целесообразно использовать при исследовании потенциальной возможности инфицирования водных объектов вибрионами.
Цель работы - проведение экспериментов по моделированию условий контаминации водных объектов биоплёнками холерного вибриона.
Материалы и методы
В опыт были взяты штаммы V. cholerae ElTor, выделенные в разные годы от людей и из внешней среды, эпидемически опасные, с генотипами ctxAB+tcpA+toxR.+ Все штаммы V. cholerae проявляли типичные для вибрионов биологические свойства, а также обладали способностью к био-плёнкообразованию. При проведении эксперимента в качестве имитатора ПБА, находящегося во внешней среде, использовали БП холерного вибриона, полученные по авторской оригинальной методике [5]. Формирование биоплёнок происходило на твердом субстрате - пищевом пластике, помещённом во флаконы-«инкубаторы» с водопроводной автоклавированной водой, в результате естественной адгезии бактерий к пластику [5]. Исходная концентрация холерных вибрионов, приготовленная из 18-часовой агаровой культуры по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО-42-25-59-86 П), составляла 4^8-103 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). В экспериментах использовали БП 4-й стадии или собственно биопленку разного срока зрелости - от 5 до 20 сут.
В качестве объекта инфицирования была выбрана водная среда - вода водопроводная, автокла-вированная в объёме 0,2, 0,4 и 1,0 л.
Схема стандартного опыта состояла в следующем: пищевой пластик с образовавшейся на нём биоплёнкой через определенные промежутки времени извлекали из флакона «инкубатора» стерильным пинцетом, трижды промывали в забу-ференном фосфатами физиологическом растворе (PBS) методом погружения от неадгезированных вибрионов, переносили во флаконы с водой водопроводной, автоклавированной и инкубировали при 10 и 25 оС. Эксперименты продолжались до 120,0 ч (5 сут).
В течение всего срока наблюдения из каждого флакона с интервалом в 0,25 ч, 0,5, 1,0, 6,0, 24,0, 48,0 ч (2 сут), 120,0 ч (5 сут) делали высевы по 0,1 мл на чашки с агаром Мартена, рН 7,8. Контаминацию воды вибрионами учитывали в КОЕ/мл.
Опыты проводились согласно СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 группы патогенности (опасности)».
Результаты и обсуждение
Формирование биоплёнок обеспечивает выживание бактерий во внешней среде. Вместе с тем известно, что зрелая биоплёнка через определённый период времени разрушается (диспергируется), что сопровождается планктонизацией составляющих её элементов [6]. При случайном или преднамеренном попадании БП холерного вибриона в резервуары с водой дисперсия клеток приводит к контаминации резервуара и диссеминации инфекции.
В связи с этим первые эксперименты проводились с целью изучения зависимости скорости контаминации вибрионами водной среды от температуры и объёма резервуара, в который была внесена БП. В опыт были взяты биоплёнки в 4-й стадии (на 5-е сут «созревания») всех отобранных штаммов V. cholerae.
При 25 оС инкубации через 0,3 ч в 0,2 л пробах концентрация вибрионов составляла 102+3 КОЕ/мл. Дальнейшая инкубация способствовала интенсивному накоплению возбудителя, через 1,0 ч концентрация достигла 103 КОЕ/мл, через 6 ч в посевах регистрировали 106+7 КОЕ/мл. В 0,4 и 1,0 л пробах наблюдалась та же динамика увеличения КОЕ по мере инкубации, однако для достижения 103 КОЕ/мл потребовалось 1,0 и 6,0 ч соответственно. В дальнейшем, до окончания срока наблюдения, концентрация вибрионов оставалась на уровне 106+7 КОЕ/мл. Следует отметить, что, несмотря на общую тенденцию контаминирования водных объектов вибрионами, количество планктонных клеток, диспергированных из БП, зависело от штамма V. cholerae. Обращает на себя внимание, что наибольшим потенциалом инфицирования обладала БП холерного вибриона штамма № 19613, изолированного из внешней среды на территории г. Ростова-на-Дону. Этот факт, безусловно, свидетельствует о необходимости мониторинга за циркуляцией вибриофлоры в водных объектах с целью выявления эпидемически опасных штаммов и своевременного проведения комплекса противоэпидемических мероприятий. Температурный фактор также оказывал значительное действие на потенциал БП как ПБА. При 10 оС отмечены низкие значения контаминации возбудителя в первые часы, а через сутки инкубации и до окончания срока наблюдения у некоторых штаммов КОЕ оставалось на уровне единичных колоний.
Эксперименты были проведены в 3 -кратных повторностях для обеих температур инкубирова-
ния. Результаты динамики контаминации водных резервуаров диспергированными клетками вибрионов представлены в табл. 1, 2 в виде среднеарифметических величин, достоверных по Стью-денту - Фишеру с вероятностью 99 %.
Следующий этап работы - изучение способности БП в 4-й стадии разного срока зрелости от 13
до 20 сут к контаминации водных объектов. Для опытов был взят штамм № 19613 как наиболее продуктивный по результатам исследований дисперсии БП V. cholerae в предыдущих экспериментах. Полученные нами данные показывают, что БП, находящиеся в «зрелой стадии» - от 13 до 20 сут, не утратили своей активности.
Таблица 1
Динамика диспергирования клеток V. cholerae из БП при 25 оС
№ штаммов Время, ч
0,25 0,50 1,0 6,0
Объем, л
0,2 0,4 1,0 0,2 0,4 1,0 0,2 0,4 1,0 0,2 0,4 1,0
19613 1-102* 5-101 0 2-103 4-102 1-102 7-103 2-103 5-102 4-107 5-105 4-103
18904 3-101 2-101 0 4-102 1-102 0 1-103 4-102 3-101 1-107 3-104 7-102
5879 2-101 1-101 0 1-103 1-102 1-101 3-103 7-102 1-102 1-107 6-104 1-103
18337 2-101 2-101 0 1-103 7-101 0 2-103 1-103 2-101 4-106 1-105 1-103
18826 4-101 1-101 0 5-102 2-102 0 1-103 5-102 1-102 2-106 3-104 6-102
*- КОЕ/мл.
Таблица 2
Динамика диспергирования клеток V. cholerae из БП при 10 оС
№ штаммов Время, ч
3,0 24,0 48,0 120,0
Объем, л
0,2 0,4 1,0 0,2 0,4 1,0 0,2 0,4 1,0 0,2 0,4 1,0
19613 4-103* 5-102 5-102 2-102 4-101 1-102 1-102 2-101 1-101 3-101 2-101 0
18904 5-102 2-102 3-101 4-101 2-101 2-101 2-101 2-101 0 2-101 2-101 0
5879 6-102 1-102 1-102 1-102 2-101 1-101 4-101 1-101 1-101 4-101 1-101 1-101
18337 7-102 2-102 2-101 1-102 7-101 0 1-102 2-101 0 1-101 2-101 0
18826 4-103 2-102 1-102 5-101 2-101 1-102 2-101 0 0 2-101 0 0
*- КОЕ/мл.
Контаминация вибрионами водных резервуаров сопоставима с КОЕ/мл, зарегистрированными в опытах с 5-суточными БП. Через 1,0^6,0 ч инкубации в исследуемых объектах наблюдалась та же тенденция, концентрация V. cholerae достигала 103 КОЕ/мл с дальнейшей динамикой увеличения концентрации холерных вибрионов.
Согласно данным [7, 8], бактерии возбудителя холеры, освобождённые из БП в окружающую среду, изменяют свои свойства, в том числе повышают свою инфекциозность на 1^2 порядка. Если учесть, что человеку для заболевания холерой достаточно дозы V. cholerae Ю4^6 КОЕ/мл, то контаминация водного резервуара диспергированными из биопленки клетками холерного вириона в концентрации
103 КОЕ/мл создаёт реальную угрозу заражения холерой уже через 0,5 ч.
Таким образом, разработанная экспериментальная модель позволила нам установить, что объёмы резервуара водного объекта и температура окружающей среды - важные внешние факторы потенциальной возможности использования биоплёнки холерного вибриона в качестве ПБА. Особый интерес представляют полученные данные о длительном сохранении способности к контаминации у «зрелых» биоплёнок холерного вибриона.
Представленные результаты могут быть использованы для оптимизации и надлежащей организации санитарно-эпидемиологической работы с це-
лью обеспечения соответствующего уровня биологической безопасности.
Литература
1. Zettler E.R., Mincer T.J., Amaral-Zettler L.A. Life in the
«Plastisphere»: Microbial communities on plastic marine debris // Environ. Sci. Technol. 2013. Vol. 47. P. 7137-7146.
2. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинзбург А.Л. Биоплён-
ка как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. Т. 40, № 11. С. 1445-1456.
3. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азибекян Р.Р., Романова Ю.М.
Структурно-функциональная характеристика бактериальных биоплёнок // Микробиология. 2010. Т. 79, № 4. С. 435-446.
4. Lutz C., Erken M., Noorian P., Susand Sh., McDougaid D.
Enviromental reservoirs and mechanisms of persistensce of Vibrio cholerae // Front Microbiol. 2013. Vol. 4. P. 375.
5. Титова С.В., Кушнарёва Е.В. Использование нового
метода изучения динамики образования биоплёнок холерными вибрионами в условиях, приближённых к естественным // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2014. № 5. С. 73-77.
6. Stoodely P., Wilson S., Hall-Stoodely S., Boyle J.D.,
Lappin-Scott H.M., Costerion J.W. Growth and detachment of cellcluster from mature mixed-species biofilm // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. P. 5608-5613.
7. Tamayo R., Patimalla B., Camilli A. Growth in biofilm in-
duces a hyperinfectious phenotype in Vibrio cholerae // Infect. Immun. 2010. Vol. 78, № 8. P. 3560-3569.
8. Окулич В.К., Плотников Ф.В., Кабанова А.А. Роль
микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе // Иммунопато -логия, аллергология, инфектология. 2012. № 4. С. 70-82.
Поступила в редакцию
References
1. Zettler E.R., Mincer T.J., Amaral-Zettler L.A. Life in the
«Plastisphere»: Microbial communities on plastic marine debris. Environ. Sci. Technol., 2013, vol. 47, pp. 7137-7146.
2. Il'ina T.S., Romanova Yu.M., Ginzburg A.L. Bioplenka kak
sposob sushchestvovaniya bakterii v okruzhayushchei srede i organizme khozyaina: fenomen, geneticheskii kontrol' i siste-my regulyatsii ikh razvitiya [Biofilms as a way of existence of bacteria in the environment and the host organism: the phenomenon of genetic control and regulation systems for their development]. Genetika, 2004, vol. 40, no 11, pp. 1445-1456.
3. Smirnova T.A., Didenko L.V., Azibekyan R.R., Romanova
Yu.M. Strukturno-funktsional'naya kharakteristika bakteri-al'nykh bioplenok [Structural and functional characterization of bacterial biofilms]. Mikrobiologiya, 2010, vol. 79, no 4, pp. 435-446.
4. Lutz C., Erken M., Noorian P., Susand Sh., McDougaid D.
Enviromental reservoirs and mechanisms of persistensce of Vibrio cholerae. Front Microbiol., 2013, vol. 4, p. 375.
5. Titova S.V., Kushnareva E.V. Ispol'zovanie novogo metoda
izucheniya dinamiki obrazovaniya bioplenok kholernymi vibrionami v usloviyakh, priblizhennykh k estestvennym [Using a new method for studying the dynamics of biofilm formation in V. cholerae conditions, approximate to the natural]. Izv. vuzov. Sev.-Kavk. region. Estestv. nauki, 2014, no 5, pp. 73-77.
6. Stoodely P., Wilson S., Hall-Stoodely S., Boyle J.D., Lap-
pin-Scott H.M., Costerion J.W. Growth and detachment of cell cluster from mature mixed-species biofilm. Appl. Environ. Microbiol, 2001, vol. 67, pp. 5608-5613.
7. Tamayo R., Patimalla B., Camilli A. Growth in biofilm in-
duces a hyperinfectious phenotype in Vibrio cholerae. Infect. Immun, 2010, vol. 78, no 8, pp. 3560-3569.
8. Okulich V.K., Plotnikov F.V., Kabanova A.A. Rol' mikrob-
nykh bioplenok v patogeneze infektsionnykh protsessov na sovremennom etape [The role of microbial biofilms in the pathogenesis of infectious processes at the present stage]. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya, 2012, no 4, pp. 70-82.
21 января 2016 г.
