CC BY
25
УДК 579.843.1:574:616.932-029.9
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НОВОГО МЕТОДА ИЗУЧЕНИЯ ДИНАМИКИ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ В УСЛОВИЯХ, ПРИБЛИЖЕННЫХ К ЕСТЕСТВЕННЫМ
© 2014 г. С.В. Титова, Е.В. Кушнарева
Титова Светлана Викторовна - кандидат медицинских наук, и.о. директора, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: svetatitova@bk.ru.
Кушнарева Евгения Владимировна - младший научный сотрудник, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, e-mail: krakazybra@mail.ru.
Titova Svetlana Viktorovna - Candidate of Medical Science, Acting Director, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service on Supervision in the Sphere of Consumer Rights Protection, M. Gorky St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: svetatitova@bk.ru. Kusnaryova Evgeniya Vladimirovna - Junior Researcher, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service on Supervision in the Sphere of Consumer Rights Protection, M. Gorky St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia. e-mail: krakazybra@mail.ru.
Предложен новый способ получения биопленок холерных вибрионов на основе использования твердого субстрата. Проведено исследование биопленок с помощью прижизненного флуорохромирования на всех этапах их образования: от стадии обратимой адгезии до стадии сформированной биопленки. Экспериментально обоснована возможность применения нового способа для выделения холерных вибрионов, находящихся в низких концентрациях (единичные клетки) в водных объектах окружающей среды.
Ключевые слова: штаммы холерных вибрионов, концентрация, биопленка, покровные стекла, пробы водных объектов.
A new method of Vibrio cholerae biofilm production is suggested based on the use of solid substrate. Using in vitro fluorochrome-labeling, the investigations of biofilms were carried out on all stages of their formation: from the stage of reversible adhesion to the stage of completely formed biofilm. Experimental results indicate that the new method can be used for the isolation of cholera vibrios in low concentrations (single cells) in environmental water objects.
Keywords: Vibrio cholerae strains, concentration, biofilm, cover glass, samples from water objects.
Способность бактерий, в том числе патогенных для человека, к образованию биопленок во многом определяет возможность их длительного выживания в различных экологических нишах [1—3].
По всей видимости, не является исключением из этого правила и возбудитель холеры, штаммы которого постоянно выделяются на территории субъектов Российской Федерации из открытых водоемов [4]. Как правило (за исключением случаев серьезных эпидосложнений), их концентрация в воде настолько низка, что для выделения культуры требуется стадия обогащения. Вместе с тем периодическое, но не постоянное выделение штаммов Vibrio cholerae из одних и тех же объектов окружающей среды наводит на мысль о возможности их существования в форме биопленок, образующихся на твердых субстратах, которые не попадают в пробы воды, отбираемые для
исследования. Несмотря на определенные успехи в изучении способности холерных вибрионов к формированию биопленки [5-7], остаются неизвестными как минимальное исходное количество клеток в популяции, достаточное для начала этого процесса, так и внешние факторы, способствующие его завершению. Исследования формирования биопленок холерными вибрионами в условиях, приближенных к природным, до настоящего времени не проводились, тогда как такие данные могли бы способствовать прогнозированию вспышек заболеваний и даже, возможно, эпидпроцессов.
Целью настоящего исследования явилось изучение возможности формирования биопленок на твердых поверхностях холерными вибрионами, находящимися в воде поверхностных водоемов в заведомо низких концентрациях.
Материалы и методы
В работе использовали два нехолерогенных (не содержащих генов холерного токсина с£х:А) штамма: V. скв1егае El Тог № Р-5392 и V. скв1егае O139 № 17918. Штаммы получены из музея живых культур ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора», где они хранились в ампулах в лиофилизированном состоянии.
Эксперименты проводили при комнатной температуре в 100-миллиметровых флаконах; средой инкубации служила водопроводная либо речная вода, субстратом - покровные стекла размером 20x20 мм, помещенные в вертикальном положении в специальное устройство, находящееся на дне флакона, и погруженные в воду (до 9 стекол в одном флаконе). В каждую емкость вносили суспензию клеток холерных вибрионов, приготовленную из 18-часовой агаровой культуры, в конечной концентрации от 10 -^10 макроклеток/мл. В качестве контроля использовали те же суспензии, но без твердых субстратов (покровных стекол).
Для исследования динамики процесса адгезии клеток к поверхности покровных стекол через определенные промежутки времени вынимали пинцетом по 2 покровных стекла из каждой пробы, промывали их в забуференном фосфатами физиологическом растворе (PBS) методом погружения и в вертикальном положении помещали на листы фильтровальной бумаги для стекания с их поверхности оставшейся жидкости. После этого одно из стекол накладывали на поверхность агара Мартена и через 15 мин переворачивали на другую сторону, чашки с агаром помещали в термостат при 37 оС и на следующие сутки регистрировали наличие роста культур холерных вибрионов в местах отпечатков. Второе стекло помещали на предметное стекло, наносили раствор акридинового оранжевого (АО) в концентрации 20 мкг/мл и накрывали покровным стеклом большего размера (24^24 мм). Препарат раздавленной капли исследовали в люминесцентном микроскопе при увеличении 7x90. Число адге-зированных клеток определяли прямым подсчетом.
Параллельно отбирали аликвоты суспензии (планктонная проба) и определяли в них концентрацию холерных вибрионов высевом 10-кратных разведений на пластины агара Мартена с последующим подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ) (рис. 1).
Наблюдения проводили один раз в сутки в течение первой недели, затем один раз в неделю и один раз в месяц. Общий срок наблюдения - два месяца.
Все способы моделирования проводились согласно СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II группы патогенности (опасности)».
Рис. 1. Схема изучения образования биопленок холерными вибрионами в динамике: 1 - переносят в 1%-ю пептонную воду для накопления клеток холерных вибрионов в течение 6 ч с последующим исследованием покровного стекла в отпечатках на пластинах с агаром Мартена и подсчетом КОЕ; 2 - покровное стекло используют для исследования отпечатков на пластинах с агаром Мартена с последующим подсчетом КОЕ; 3 -покровное стекло исследуют микроскопическим методом «раздавленная капля»
Результаты и обсуждение
С первого дня эксперимента холерные вибрионы адгезировались на поверхности покровных стекол в виде отдельных клеток, цепочек и небольших скоплений. Очевидно, эта стадия соответствует аналогичной, описанной в литературе как стадия 1, когда твердая поверхность покрывается первичной пленкой, или как стадия 2 - собственно микробная адгезия, когда микроорганизмы обратимо прикрепляются к твердой поверхности. Между молекулами и структурами на поверхности микроорганизмов и твердого субстрата действуют неспецифические физико-химические силы [8, 9]. К четвертым суткам скопления занимали всю площадь покровных стекол и состояли из клеток с сохраненной подвижностью, а также из слитых друг с другом клеток, между которыми находилось аморфное вещество, окрашенное в мутно-оранжевые и мутно-зеленые цвета. Такие картины, описанные в научной литературе, характерны для стадии 3, в свою очередь состоящей из нескольких этапов с возможностью передвижения клеток вдоль твердой поверхности и формирования внеклеточного матрикса. В планктонной части опытных и контрольных проб происходило наращивание концентрации клеток холерных вибрионов до 106 КОЕ/мл к четвертым суткам и оставалось на этом уровне в течение трех недель с последую-
щим постепенным снижением. Начиная с пятых суток исследования микроскопические препараты выглядели как сформированные биопленки. Просматривалось несколько слоев клеток, которые наслаивались друг на друга, образуя многомерную структуру, которая определялась при изменении положения микровинта: четкие очертания клеток были видны в каждом отдельном слое, тогда как в остальных они выглядели размытыми. Клетки были окружены аморфным веществом, окрашенным в мутно-оранжевые и мутно-зеленые цвета и представляющим, вероятно, матрикс, состоящий из полисахаридов и белков. Между скоплениями встречались пустые места в виде дорожек. Анало-
гичное описание приводится в литературе как 4-я стадия - вторичных колонизаторов. Микроорганизмы прикрепляются к тем, которые уже сформировали биопленку, в этой же стадии формируются специфические структуры - полости, каналы, выросты, поры [10].
В течение следующих двух месяцев микроскопические препараты отличались количеством скоплений и их ростом как в ширину, так и в высоту, между скоплениями образовывались свободные места в виде дорожек. В планктонной части опытных и контрольных проб концентрация холерных вибрионов через два месяца от начала эксперимента снизилась на два порядка (104 КОЕ/мл) (рис. 2).
Рис. 2. Концентрация штаммов V. choleraе О1 и О139 в пробах с водопроводной, речной водой и покровными стеклами (на примере штамма V. choleraе Е1 Тог № Р-5392 с начальными концентрациями 10 и 100 мк/мл
Дальнейшее понижение начальной концентрации холерных вибрионов с 10,0 до 0,1 м.к./мл еще более приблизило наши модели к естественным условиям. Высевы из планктонной фазы проводили через каждые 2 ч. Параллельно одно покровное стекло помещали на чашку с агаром, второе переносили из проб в 1%-ю пептоннную воду (ПВ) с последующей инкубацией при 37 оС в течение 6 ч, третье исследовали под микроскопом, как описано выше. ПВ использовали в качестве среды обогащения, для накопления культуры холерных вибрионов. Контролем служили пробы воды без стекол с
соответствующими концентрациями клеток холерных вибрионов.
Полученные нами результаты почасовых исследований из отпечатков покровных стекол на пластинах агара Мартена позволяют судить о накоплении культуры холерных вибрионов на покровных стеклах через 4 ч от начала эксперимента с начальной концентрацией холерных вибрионов 10,0 м.к./мл, через 10 ч - 1,0, через 12 ч - 0,1 м.к./мл (рис. 3) с дальнейшим постепенным увеличением количества адгезированных клеток, что можно было видеть при микроскопии стекол.
Рис. 3. Рост холерных вибрионов с начальной концентрацией 1,0 м.к. в 10 мл. Отсутствие роста через 9 ч.
Наличие роста через 12 ч
Микроскопические картины препаратов всех экспериментальных проб характерны для первой и второй стадий образования биопленок.
При 6-часовом выдерживании покровных стекол в 1%-й ПВ на агаровых пластинах появлялся полусливной или сливной рост через 10 ч (4+6) и 16 (10+6) от начала эксперимента при концентрациях 1,0 и 0,1 м.к./мл соответственно.
Особый интерес представлял тот факт, что адгезия вибрионов к покровным стеклам сопровождалась параллельным наращиванием их концентрации в планктонной фазе. При начальной концентрации 10,0 м.к./мл она увеличилась на один порядок через 8 ч, а к 24 ч составила 10М06 КОЕ/мл.
В контрольной пробе через 18 ч концентрация холерных вибрионов увеличилась на один порядок и составила 102 КОЕ/мл без дальнейшего увеличения в течение суток (рис. 4а).
При начальной концентрации холерных вибрионов 1,0 м.к./мл увеличение их концентрации начиналось через 12 ч (на один порядок) и к 24 ч достигало 103 м.к./мл. В контрольной пробе за 24 ч не происходило увеличения концентрации холерных вибрионов (рис. 4б). В экспериментальной пробе при концентрации холерных вибрионов 0,1 м.к./мл через 24 ч от начала исследования концентрация их достигла 5-10 мкм/мл, в контрольной пробе холерные вибрионы к этому периоду не обнаруживались (рис. 4в).
время (часы)
■о— экспериментальная проба
-контрольная проба
а
■в— экспериментальная проба
-контрольная проба
б
■о— экспериментальная проба
-контрольная проба
в
Рис. 4. Размножение V. ско1втае Е1ТогР-5392 в планктонной части экспериментальной (с покровными стеклами) и в контрольной (без стекол) пробах при начальной концентрации 10,0 (а), 1,0 (б) и 0,1 (в) м.к./мл
Суммируя все полученные данные, можно заключить, что клетки холерных вибрионов адгезиру-ются к поверхностям покровных стекол независимо от их начальной концентрации и накапливаются в регистрируемом количестве на покровных стеклах раньше, чем в жидкой среде (планктонной форме). Как известно, во второй стадии формирования биопленки микробные клетки обратимо прикрепляются к твердой поверхности, поэтому холерные вибрионы продолжают накапливаться в планктонной форме, однако медленнее, чем в биопленочной.
Одним из объяснений полученных нами данных [11, 12] может служить тот факт, что прикрепленные (адгезированные) микроорганизмы размножаются быстрее, чем находящиеся во взвешенном состоянии (в планктоне), и характеризуются повышенной метаболической активностью: продуцируют протеазы, амилазы и липазы, обеспечивающие развитие растущего бактериального сообщества. Кроме того, в отдельных участках биоплёнки периодически возникают очаги размножения, в результате чего в окружающую среду выделяются свободные (планктонные) клетки микроорганизмов.
Возможно, поэтому и планктонная часть культуры сохраняет свою концентрацию в течение двух месяцев (срок наблюдения).
Таким образом, бактерии, адгезированные на покровных стеклах, можно изучать в живых микроскопических препаратах, а при переносе стекол с адгези-рованными клетками на пластины с агаром - получить рост культуры быстрее, чем холерные вибрионы накопятся в планктонной пробе, т.е. использование покровных стекол позволяет исследовать способность образования биопленки в динамике в разных условиях культивировании. Так, из исходно низких концентраций холерных вибрионов (1 кл. в 10,0 мл) производится накопление культуры значительно раньше (через 12 ч), чем в пробах без покровных стекол (через 24 ч). На основании этих экспериментальных фактов мы предполагаем использовать предметы из стекла для выделения холерных вибрионов из воды поверхностных водоемов.
Литература
1. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен,
генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. Т. 40, № 11. С. 14451456.
2. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азибекян Р.Р., Романо-
ва Ю.М. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок // Микробиология. 2010. Т. 79, № 4. С. 435-446.
3. Lutc C., Erken M., Noorian P., Susand Sh., McDougaid D.
Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio cholerae // Front Microbiol. 2013. Vol. 4. P. 375.
4. Ежова М.И., Кругликов В.Д., Водопьянов А.С., Водо-
пьянов С.О. Шестиалтынова И.С., Олейников И.П., Непомнящая Н.Б., Подойницына О.А. Холерные вибрионы О1 серогруппы, выделенные из водных объектов Ростова-на-Дону в ходе мониторинга в 2008-2012 гг. // Проблемы особо опасных инфекций. 2013. Вып. 4. С. 56-59.
5. Moorthy S., Watnick P. Identification of novel stage spe-
cific genetic requirements through whole genome transcription profiling of Vibrio cholerae biofilm development // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 57. P. 1623-35.
6. Куликалова Е.С., Урбанович Л.Я., Марамович А.С.,
Миронова Л.В., Саппо С.Г. Способность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп к образованию биопленки в эксперименте «Холера и патогенные для человека вибрионы» // Материалы пробл. комиссии. 2009. Вып. 22. С. 90-92.
7. Татаренко О.А., Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р.,
Шестиалтынова И.С., Чемисова О.С., Маркина О.В., Непомнящая Н.Б., Ускова Н.Н. Влияние некоторых факторов на формирование биоплёнки токсиген-ными и атоксигенными холерными вибрионами эль-тор // Эпидемиол. и инф. болезни. 2012. № 5. С. 36-40.
8. Van Loosdrecht M.C.H. Bacterial Adhesion.
Wageningen, 1988. 200 p.
9. Раилкин А.И. Процессы колонизации и защита от
биообрастания. СПб., 1998. 272 с.
10. Watnick P.I., Lauriano C.M., Klose K.E., Kolter R. The
absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae O139 // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 39(2). P. 223-35.
11. Могилевич Н.Ф., Самонин В.В., Еликова Е.Е. Иммо-
билизованные микроорганизмы и очистка воды // Микробиол. журн. 1995. Т. 57, № 5. С. 90-105.
12. Доброхотский О.Н., Хомяков Ю.Н., Хомякова Т.И.
Эпидемиологическое значение формирования биоплёнок в технических системах // Жизнь безопасно-стей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. 2009. № 1. С. 78-80.
Поступила в редакцию_25 августа 2014 г.
