CC BY
29
18. Östberg O. Zur Typologie der circadianenPhasenlage: Ans ätzezueinerpraktischenChronohygieneJn Hildebrandt G., ed. BiologischeRhythmen und Arbeit.Wien-New York: Springer-Verlag, 1976. pp. 117-137.
19. PutilovA.A. A questionnaire for self-assessment ofindividual traits of sleep-wake cycle. Bull Siberian BranchUSSRAcad. Med. Sci. 1990. 1:22-25.
20. Putilov A. A. Introduction of the tetra-circumplexcriterion for comparison of the actual and theoreticalstructures of the sleep-wake adaptability. Biol.Rhythm. Res.2007. 38:654.
21. Putilov A. A. Three-dimensional structural representation of the sleep-wake adaptability. Chronobiol. Int. 2016. 33 (2):169-80.
22. Randler C., Díaz-Morales J.F., Rahafar A., Vollmer C. Morningness-Eveningness and amplitude-developmentand validation of an improved composite scale to measurecircadian preference and stability (MESSi). Chronobiol Int. 2016. 33:832-48.
23. Roenneberg T., Wirz-Justice A. and Merrow M. Life between clocks: Daily temporal patterns of human chronotypes. Journal of Biological Rhythms. 2003. 18:8090.
24. Wuth O. Klinik und Therapie der Schlafstonmgen [Clinic and therapy for sleep disorders]. SchweizMed. Wochenschr. 1931. 61:833-837.
Сведения об авторах
Рагозин О. Н., БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», г. Ханты-Мансийск. Шаламова Е. Ю., БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», г. Ханты-Мансийск. Татаринцев П. Б., ФГБОУ ВО «Югорский государственный университет», г. Ханты-Мансийск. Петров И. М., ФГБОУ ВО Тюменский ГМУ Минздрава России, г. Тюмень.
Адрес для переписки: e-mail: oragozin@mail.ru.
1Ragozin O. N., 1Shalamova E. Yu., 2Tatarintsev M. Yu., 3Petrov I. M.
1 Khanty-Mansiysk State Medical Academy», Khanty-Mansiysk, Russia
2 Ugra State University, Khanty-Mansiysk, Russia
3 Tyumen State Medical University, Tyumen, Russia PHOTOPERIODIC STABILITY OF CHRONOTYPE
Aim. Development and evaluation of the photoperiodic stability index of the human chronotype in the conditions of the northern region.
Results. A model for assessing the seasonal dynamics of the biorhythmic stereotype is proposed. In the summer season, the shift of the maximum total points towards a decrease, the minimum - towards an increase, is revealed. In this case, intermediate values do not fluctuate.
Conclusion. The results of the study allow us to recommend the determination of the index of photoperiodic stability of the chronotype for the assessment of physiological fluctuations of individual chronotypological properties. Keywords: photoperiod, chronotype, resistance.
УДК 612.823
DOI: 10.36361/2307-4698-2019-21-1-44-49 Бонь Е. И., Зиматкин С. М.
УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь
ПОСТНАТАЛЬНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ ВНУТРЕННИХ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ НЕОКОРТЕКСА КРЫСЫ
В настоящей работе впервые представлены результаты комплексного количественного анализа динамики постнатального морфогенеза внутренних пирамидных нейронов неокортекса крысы. Происходит прогрессивный рост и дифференцировка перикарионов и нейропиля внутренних пирамидных нейронах неокортекса крысы, становление структурных и метаболических характеристик их органелл, сопровождающихся нарастанием иммунореактивности молекулярных маркёров созревания этих нейронов. Ключевые слова: морфогенез, нейроны, крысы, головной мозг.
Актуальность. Неокортекс, или новая кора, является в филогенетическом плане новейшей структурой коры больших полушарий головного мозга. Именно в неокортексе происходит сложный анализ и синтез поступившей в мозг информации, а также реализация условных рефлексов. Неокортекс является мате-
риальной основой когнитивных функций центральной нервной системы. Неокортекс крыс образован такими формациями, как лобная, теменная, височная и затылочная кора [2].
Нейроны внутреннего пирамидного слоя неокор-текса, или, как еще их называют, большие пирами-
ды пятого слоя,- самые большие по размерам среди нервных клеток головного мозга. Большая часть эфферентных волокон (ассоциативных, комиссураль-ных и проекционных) образованы именно их аксонами, в то время как верхушечные дендриты больших пирамид простираются до молекулярного слоя нео-кортекса [2].
Постнатальный морфогенез нейронов неокортек-са крысы изучался многочисленными исследователями. В их работах было описано снижение плотности расположения нейронов, увеличение их размеров и вариабельности формы перикарионов, формирование глыбок хроматофильного вещества, колебания ядерно-цитоплазматического соотношения, диф-ференцировка ветвления отростков и образование шипикового аппарата [3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 13]. Однако, эти исследования -преимущественно имели фрагментарный характер: не был задействован комплексный подход, не была отражена динамика количественных показателей, не выявлены четкие закономерности постнатального морфогенеза нейронов. В настоящей работе мы впервые представили результаты комплексного количественного анализа динамики пост-натального морфогенеза внутренних пирамидных нейронов неокортекса крысы.
Методика эксперимента. Эксперименты выполнены на 156 беспородных белых крысятах, родившихся от 75 самок крыс. Крыс содержали в стандартных условиях в соответствии с правилами содержания лабораторных животных [6]. На выполнение данных исследований получено разрешение этического комитета Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1, 11.03.2014).
Так как морфофункциональные свойства нео-корткса формируются поэтапно, то для изучения брались крысята на разных этапах онтогенеза: на 2-е, 5-е, 10-е, 20-е, 45-е и 90-е сутки. По достижении крысятами вышеобозначенных сроков, проводилась их декапитация. Фрагменты больших полушарий головного мозга, извлечененные из черепной корб-ки, фиксировали для дальнейшего гистологического, гистохимического, иммуногистохимического и электронно-микроскопического исследования. От потомства одной крысы-самки брали по 2 крысенка.
Гистологическое исследование. Участки коры головного мозга опускали в фиксатор Карнуа, затем провдоили через спирты и просветляли в ксилолы и заливали в парафин. Срезы неокортекса производили на микротоме (Leica RM2125, Германия), а затем окрашивали по методу Ниссля (0,1% толуидином). Используя стереотаксический атлас, определяли местоположение участков неокортекса на срезах [11].
На парафиновых срезах измеряли толщину не-окортекса, определяли число больших пирамидных нейронов, с помощью программы компьютерного анализа изображения Image Шагр (Bit Flow, США) считали площадь, форм-фактор и фактор элонгации их перикарионов.
Электронно-микроскопическое исследование.
Участки для электронной микроскопии фиксировали 1% осмием на буфере Миллонига (рН = 7,4). Для промывания материала брали смесь буфера Миллонига (20 мл) и сахарозы (900 мг). Затем кусочки неокортек-са проводили последовательно через спирты, смесь спирта и ацетона, ацетон, смесь смол и ацетона и заливали в смолу. На ультрамикротоме МТ-7000 (RMC, США) готовили полутонкие срезы и ультратонкие срезы. Контрастировали препараты ацетатом урана и цитратом свинца [12].
Для изучения ультратонких срезов использовали электронный микроскоп JEM-1011 (JEOL, Япония) с камерой 01ушрш MegaView III (01ушрш Бой: Imaging Solutions, Германия). Количественный анализ ультраструктуры нейронов выполняли, используя программу Image Шагр (Bit Flow, США).
Гистохимическое исследование. Фиксированные в жидком азоте участки неокортекса резали на крио-стате Leica CM 1850 (Leica Microsystems GmbH, Германия). На полученных препаратах исследовали активность ряда ферментов: сукцинатдегидрогеназы (СДГ), НАДН-дегидрогеназы (НАДН-ДГ), НАДФН-деги-дрогеназы (НАДФН-ДГ), глюкозо-6-фосфат-деги-дрогеназы (Г-6-Ф-ДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и кислой фосфатазы (КФ). Срезы окрашивали на выявление активности ферментов, проводили через 10% формалин, спирты и ксилолы. Заключение проводили в полистероловую смолу или глицерин-желатин. Оценка экспрессии ферментов проводилась путем подсчета в программе Image Шагр оптической плотности осадка хромогена.
Иммуногистохимическое исследование. Фиксатором выступил цинк-формалин. На парафиновых срезах определяли экспрессию NeuN (нейрональный ядерный белок) и СФ (синаптофизин). Использовался набор для иммуногистохимичекого исследования фирмы Abcam (Великобритания), содержащий первичные кроличьи антитела. Детекцию проводили с помощью набора EXPOSE Rabbit specific HRP/DAB detection IHC kit фирмы Abcam. На парафиновых срезах определяли оптическую плотность осадка хромогена в перикарионах нейронов (для NeuN) и в отростках (для синаптофизина).
Статистическая обработка цифровых данных. Полученные в результате вышеописанных исследований данные изучались в лицензионной компьютерной программе Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). Использовалась описательная статистика - критерий Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test) с применением поправки Бонферони. Данные представлялись как медиана (Me), нижний квартиль (LQ) и верхний квартиль (UQ) [1].
Результаты и их обсуждение.
Гистологическое исследование.
В постнатальном oнтoгенeзe перикарионы больших пирамидных нейронов неокортекса существенно увеличиваются в размерах в установленном промежутке (с 2-х по 90-e cутки) - площадь их тел возросла
в четыре с половиной раза (рис. 1, 2). Но форма нейронов не претерпела изменений.
Рисунок 1. Большие пирамидные нейроны неокортекса крыс на 2-е (А), 5-е (Б), 10-е (В), 20-е (Г), 45-е (Д) и 90-е (Е) сутки после рождения. Окраска по Нисслю. Цифровая микрофотография. Ув. 400
2 с
10 с
20 с
45 с
90 с
120
100 80
В
Рисунок 2. Изменения площади тел (А), расстояния между телами (Б), и плотности их расположения (В) больших пирамидных нейронов неокортекса крыс в постнатальном онтогенезе. Примечание: Me ± IQR
Промежутки между телами больших пирамид и плотность их расположения также возросли в четыре раза на 90-е сутки, по сравнению со 2-ми (рис. 1, 2) - это обусловлено развитием отростков нейронов (нейропиля) (рис. 1, 2).
Электронная микроскопия.
Форма, размеры и занимаемая в цитоплазме площадь органелл больших пирамидных нейронов в ходе постнатального онтогенеза претерпевают значительное изменение (рис. 3).
С 5-х по 45-е сутки постнатального онтогенеза число митохондрий на единицу площади цитоплазмы возрастает в два с половиной раза. Максимума их размеры достигают на 20-е сутки (в пять раз по сравнению с пятыми), а на 45-е вновь снижаются в два раза (р < 0,05). Кроме того, на 20-е сутки митохондрии достигают и наибольшей протяженности. Число крист в митохондриях к 45-м суткам возрастает в семь раз. по сравнению с 5-ми (рис. 3, 4).
На ранних этапах постнатального онтогенеза (5-е сутки) не связанные с гранулярной эндоплазма-тической сетью (ГрЭС) рибосомы составляют 87,5% от общего их числа (р < 0.05) (рис. 3, 5). В последствии они связываются с ГрЭС и на 45-е сутки наблюдается преобладание связанных рибосом - 56% от общего их числа (р < 0.05). С 5-х по 45-е сутки длинна каналов ГрЭС увеличивается в пять раз (р < 0.05).
Комплекс Гольджи на 5-е сутки не завершил еще своего формирования, его цистерны имеют вид вакуолей. В дальнейшем они уплощаются и занимают специфическую конфигурацию (рис. 3).
К 20-м суткам число лизосом в цитоплазме и их площадь достигают максимума - в четыре раза, по сравнению с 5-ми сутками. На 45-е сутки наступает снижение числа и размеров данных органелл (рис. 6).
6 5 4
к
2 1
С
Б
Рисунок 4. число митохондрий в цитоплазме нейронов не-окортекса крыс, на площадь 1 мкм2 (А) и изменение общей длины крист на одну митохондрию на разных этапах постнатального развития, мкм (Б). Примечания: Me ± IQR; * - р < 0.05 по сравнению с 5-ми сутками, + - р < 0.05 по сравнению с 20-ми сутками
20
А
0
5 с
А
Рисунок 3. Органеллы больших пирамидных нейронов неокортекса крысы на разных этапах постнатального развития. А, Б, В - митохондрии, Г, Д, Е - ГрЭС, Ж, З, И - комплекс Гольджи. А, Г, Ж - 5-е сутки, Б, Д, З - 20-е сутки, В, Е, И - 45-е сутки. Увеличение: 50000. Электронно-граммы
Гистохимическое исследование.
Активность фер-
ментов СДГ, НАДН-ДГ, НАДФН-ДГ, Г-6-Ф-ДГ и КФ в цитоплазме больших пирамидных нейронов неокортекса неуклонно возрастает от 5-х до 45-х суток после рождения. При этом содержание ЛДГ и рибону-клеопротеинов (РНП) изменений не претерпевает (табл. 1).
Иммуногистохимиче-ское исследование.
С 5-х по 20-е сутки им-мунореактивность белка №иМ значительно увеличивается (табл. 2).
Возрастает и иммуно-реактивность СФ в ней-ропиле больших пирамид (рис. 7, табл. 3).
Заключение. Обнаруженное существенное возрастание размеров больших пирамидных нейронов в динамике постнатального развития соответствует известному росту нейронов, характерному для нейронов мозга всех типов в данный период онтогенеза [3,5,7]. Обнаруженное нами прогрессивное увеличение расстояния между
10
?
о с 8
о
ю и 6
а о а т 'к 4 2
с
Т и 0
ч
Я
0,15
20 сутки
45
0,05
20 сутки
45
20
сутки
45
2 1,5 1
0,5 0
20
сутки
45
Рисунок 5. Число свободных (А) и связанных (Б) рибосом в цитоплазме нейронов неокорткса крыс на разных этапах постнатального развития, на площадь 1 мкм2. Примечание: Ме ± ЩЯ; * - р < 0.05, по сравнению с 5-ми сутками, + - р < 0.05 по сравнению с 20-ми сутками
Рисунок 6. Число (А) и площадь (Б) лизосом в цитоплазме больших пирамидных нейронов на разных этапах постнатального развития. Примечания - Ме ± ^Я; * - р < 0.05 по сравнению с 5-ми сутками
5
5
15
10
5
0
5
5
телами больших пирамид отражает прогрессивный рост нейропиля (дендритов внутренних пирамидных нейронов и афферентных аксонов других нейронов и синапсов между ними). Соответственно, в этот период постепенно уменьшается и плотность расположения больших пирамидных нейронов, как за счёт роста нейронов, так и в результате их раздвижения растущим нейропилем [3, 5, 7, 10].
Таблица 1
A^^Kocib ферментов в единицах oптичecкoй плотности в цитоплазме больших пирамидных нейронов неокортекса крыс (Me (LQ; U))
5 сутки 20 сутки 45 сутки
СДГ
- 0.14 (0.12;0.16) 0.17 (0.16;0,.174)
НАДНДГ
0.156 (0.15;0.17) 0.2 (0.2;0.23) * 0.24 (0,23;0.26) *
НАДФДГ
- 0.115 (0.11;0.116) * 0.13 (0.128;0.14) +
Г-6-Ф-ДГ
- 0.19 (0.18; 0.22) * 0.244 (0.24;0.25) +
ЛДГ
0.134 (0,13;0.14) 0,15 (0.14; 0.15) 0.14 (0.13;0.144)
КФ
- 0.24 (0.22;0.28) * 0.23 (0.22;0.236) *
РНП
0.2 (0.18; 0.22) 0.16 (0.13; 0.18) 0.19 (0.18; 0.2)
Примечание: активность фермента не определяется (ниже уровня чувствительности метода), * - р < 0.05 по сравнению с 5 сутками, + - р < 0.05 по сравнению с 20 сутками.
Таблица 2
Иммунореактивность NeuN в цитоплазме больших пирамидных нейронов неокортекса крыс, (Me (LQ; UQ)), в единицах оптической плотности
Сроки после рождения Экспрессия №uN
5-е сутки 0.16 (0.155; 0.165)
10-е сутки 0.18 (0.178; 0.182) *
20-е сутки 0.2 (0.19; 0.22) +
Примечание: * - р < 0.05 по сравнению с 5-ми сутками, + - р < 0.05 по сравнению с 10-ми сутками.
Таблица 3
Иммунореактивность СФ в нейропиле больших
пирамидных нейронов неокортекса крыс, (Me (LQ; UQ)), в единицах оптической плотности
Сроки после рождения Экспрессия СФ
5-е сутки 0.15 (0.14; 0.16)
10-е сутки 0.16 (0.15; 0.17)
20-е сутки 0.28 (0.27; 0.3) *
45-е сутки 0.32 (0.29; 0.34) *
Примечание: * - р < 0.05 по сравнению с 10-ми сутками, + - по сравнению с 20-ми сутками.
После рождения в цитоплазме больших пирамидных нейронов наблюдается значительное возрастание числа митохондрий, их элонгация. Число и длина их крист также увеличивается. При этом возрастает и активность СДГ и НАДН-ДГ - фермен-
тов, характеризующих функцию митохондрий (СДГ участвует в аэробном окислении углеводов в цикле Кребса, а НАДН-ДГ - в переносе электронов). Кроме того, НАДН-ДГ выполняет роль связующего звена между конечными продуктами распада углеводов и дыхательной цепью. Таким образом, происходит нарастание активности митохондрий и энергообеспечения нейронов.
Преобладание на 5-е сутки свободных рибосом говорит о том, что синтез белка в основном направлен на восполнение собственных потребностей интенсивно развивающихся клеток. Затем начинают преобладать связанные рибосомы - это говорит о переключении пептидного синтеза на экспорт, к нервным окончаниям. Связывание рибосом с ГрЭС происходит с помощью рибофорина. Данный процесс требует энергии и заметно, что увеличение количества числа связанных рибосом связано с развитием энергетического аппарата больших пирамидных нейронов.
Рост и развитие цистерн комплекса Гольджи соответствует и совершенствование синтетического и транспортного аппарата нейронов.
С 5-х по 20-е сутки существенно возрастает число и площадь лизосом. Эта закономерность была обнаружена ранее и для клеток Пуркинье мозжечка [5]. Активность КФ - маркерного фермента лизосом -возрастает также. Данные процессы свидетельствуют о развитии аппарата периваривания и защиты нейронов.
Полученные нами результаты не противоречат литературным данным об особенностях ультраструктуры пирамидных нейронов коры мозга крысы в возрастном аспекте [10,13].
Белок №uN не определяется в нейробластах, а только в зрелых нейронах центральной нервной системы. Данный белок принимает участие в сплайсинге, его экспрессия определяется в перинуклеарной области и ядре нервной клетки [9]. Поэтому наблюдаемое в нашем исследовании с 5-х по 45-е сутки после рождения возрастание иммунореактивности №uN в телах больших пирамидных нейронов неокортекса крыс является вполне ожидаемым и соответствующих структурному и метаболическому становлению этих нейронов.
Постепенное возрастание в постнатальном онтогенезе в нейропиле больших пирамидных нейронов неокортекса крысы иммунореактивности маркера синаптических пузырьков СФ очевидно связано с синаптогенезом, особенно в период с 10-х по 20-е сутки постнатального развития неокортекса крысы [3].
Таким образом, в постнатальном онтогенезе происходит прогрессивный рост и дифференцировка перикарионов и нейропиля внутренних пирамидных нейронов неокортекса крысы, становление структурных и метаболических характеристик их органелл, сопровождающихся нарастанием иммунореактивности молекулярных маркёров созревания этих нейронов.
Рисунок 7. Иммунореактивность СФ в нейропиле больших пирамидных нейронов неокортекса крыс на 5-е (А), 20-е (Б) и 45-е (В) сутки после рождения. Цифровая микрофотография. Ув. 400
Литература
1. Батин Н. В. Компьютерный статистический анализ данных: учеб.- метод. пособие.- Минск: Ин-т подгот. науч. кадров НАН Беларуси, 2008.- 160 с.
2. Бонь Е. И., Зиматкин С. М. Микроскопическая организация изокортекса крысы // Новости медико-биологических наук. 2017. № 4. С. 80-88.
3. Бонь Е. И., Зиматкин С. М. Онтогенез коры головного мозга крысы // Новости мед.- биол. наук.- 2014.- Т. 10, № 4.- С. 238-244.
4. Зиматкин С. М., Бонь Е. И. Органеллогенез больших пирамидных нейронов коры головного мозга // Морфология. 2017. № 2. С. 20-24.
5. Зиматкин С. М., Карнюшко О. А., Островская О. Б. Постнатальный морфогенез клеток Пурки-нье мозжечка крыс // Морфология. 2017. № 4. С. 12-16.
6. Копаладзе Р. А. Биоэтика: Эксперименты на животных - история, состояние, перспективы: монография.-М.: Компания Спутник+, 2003.- 65 с.
7. Максимова Е. В. Онтогенез коры больших полушарий, Москва,: Наука.- 1990.- 184 с.
8. Chen K., Rajewsky N. The evolution of gene regulation by transcription factors andmicroRNAs // Nat. Rev. Genet. 2007. Vol. 8 (2). pp. 93-103.
9. Mullen R. J. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates // Development.- 1992.- Vol. 116 (1).- P. 201211.
10. Parnavelas J. G. An ultrastructural study of the maturation of neuronal somata in the visual cortex of the rat / J. G. Parnavelas, A. R. Lieberman // Anat. Embriol.- 1979.-Vol. 157 (3).- P. 311-328.
11. Paxinos G. The rat brain in stereotaxic coordinates.- 6th ed.- London: Acad. Press, 2007.- 448 p.
12. Reynolds E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol.- 1963.- Vol. 17.- P. 208-212.
13. Sato I., Konishi K., Mikami A. Developmental changes in enzyme activities and in morphology of rat cortex mitochondria // Okajimas Folia Anatomy Japan. 2000. 76. pp. 353-361.
Сведения об авторах
Бонь Елизавета Игоревна, к. биол. н., старший преподаватель кафедры патологической физиологии имени Д. А. Маслакова УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Республика Беларусь. Зиматкин Сергей Михайлович, д. биол. н., профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Республика Беларусь. Адрес для переписки: e-mail: e_bon@list.ru.
Bon E. I., Zimatkin S. M.
Grodno State Medical University, Grodno, Belarus
POSTNATAL MORPHOGENESIS OF THE INTERNAL PYRAMIDAL NEURONS OF RAT NEOCORTEX
In present paper, we report for the first time the results of the complex quantitative analysis of the dynamics of post-natal ontogenesis of the internal neocortex pyramid neurons in the rat. There is a progressive growth and differentiation of the neuron's bodies and neuropil of the internal pyramidal neurons of the rat neocortex, the formation of the structural and metabolic characteristics of their organelles, accompanied by an increase in the immunoreactivity of molecular markers of maturation of these neurons. Keywords: morphogenesis, neurons, rats, brain.
