CC BY
111
К.В. Балакин, A.B. Иващенко
ПОСТГЕНОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ РАЗРАБОТКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ С НОВЫМИ МЕХАНИЗМАМИ ДЕЙСТВИЯ
Центр Высоких Технологий ХимРар, г. Химки, Московская обл., тел.: +7 (495) 995-4941, e-mail: [email protected]
Традиционно в самом начале декабря на базе Центра Высоких Технологий ХимРар в подмосковных Химках проводятся научные конференции, посвященные различным аспектам разработки инновационных лекарств. Темой четвертых по счету «декабрьских чтений», состоявшихся 03 декабря 2007 года, стали передовые технологии создания противоопухолевых лекарств нового поколения. В настоящей статье представлен краткий анализ основных научных итогов состоявшегося форума.
Общая информация
Международная конференция «Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия» состоялась 03 декабря 2007 года на базе негосударственного Исследовательского Института Химического Разнообразия (ИИХР) в Центре Высоких Технологий (ЦВТ) ХимРар (Химки, Московская область). Однодневный форум собрал более 60 отечественных специалистов, а также ряд зарубежных исследователей, работающих в области изучения механизмов возникновения и развития опухолевых заболеваний и создания лекарственных средств для их лечения. Был освещен целый ряд перспективных подходов к решению этой задачи, связанных с достижениями «постгеномной эры». Основная идея этих подходов состоит в широком использовании информации, полученной в геномных и протеомных исследованиях. Эти данные применяются для поиска новых синтетических молекул, модулирующих активность белковых биомишеней, вовлеченных в развитие опухолевых патологий.
На конференции были представлены доклады зарубежных ученых, а также ведущих отечественных специалистов. В рамках пленарной сессии состоялись два доклада от видных зарубежных исследователей -Яна Лавровского, руководителя исследовательских программ компании ChemDiv, Inc. (США), и Стефана Краусса, главы Биомедицинского Инновационного Центра при Университете Осло (Норвегия). Другие доклады были представлены в рамках трех рабочих сессий: «Инновационные противоопухолевые агенты», «Новые биомишени для действия противоопухолевых препаратов» и «Поиск противоопухолевых лекарств на основе новых технологий генерации знаний». Выступили ведущие ученые из Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина, МГУ им. М.В. Ломоносова, Института биоорганиче-
ской химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Института физиологии им. И.П. Павлова, ЦВТ ХимРар и ряда других российских исследовательских институтов и фармацевтических корпораций.
Необходимо сказать несколько слов о месте проведения конференции. ЦВТ ХимРар - это уникальный для Российской Федерации научно-исследовательский комплекс, объединяющий инновационные высокотехнологичные компании, занятые разработкой и выведением на рынок лекарственных препаратов нового поколения. ЦВТ ХимРар оказывает полный комплекс услуг для крупнейших отечественных и международных фармацевтических компаний, связанных с доклинической и клинической разработкой инновационных лекарств. Организации ЦВТ осуществляют как сервисные модели развития бизнеса, оказывая различные заказные научные исследования для зарубежных и отечественных фармпроизводителей, так и инициативные разработки. После прохождения этапа техно-логизации новых знаний наиболее успешные проекты зачастую выделяются в самостоятельные предприятия, осуществляющие дальнейшую коммерциализацию разработок. В последние годы ЦВТ ХимРар все чаще ассоциируется с проведением представительных международных научных конференций. Начиная с 2004 года здесь был проведен целый ряд международных конгрессов, на которых обсуждались проблемы создания новых таргетных лекарств, исследования молекулярных биомишеней, организации кооперации исследовательских организаций, коммерциализации научных разработок, а также другие актуальные вопросы. Традиционными стали ежегодные «декабрьские чтения», и нынешняя конференция, темой которой стали передовые технологии разработки противоопухолевых лекарств нового поколения, оказалась уже четвертой по счету.
Разработка новых противоопухолевых лекарств: экономический аспект
Прежде чем перейти к обсуждению основных научных итогов конференции, необходимо, на наш взгляд, кратко затронуть экономический аспект разработки новых противоопухолевых препаратов. Фармацевтика является одной из самых рентабельных и доходных отраслей мировой экономики, демонстрирующей высокие темпы роста. По данным аналитической организации IMS Health, в 2008 году прогнозируется 6%-ный рост мирового фармацевтического рынка по сравнению с 2007 г. Предположительно, общее количество продаж на мировом фармацевтическом рынке за 2008 год составит $735-745 млрд. В общей структуре рынка существенную долю занимают лекарства, призванные на борьбу с многочисленными опухолевыми патологиями, которые вносят наибольший вклад в смертность населения как в России, так и во всем мире. Имеющиеся в распоряжении врачей препараты часто недостаточно эффективны, обладают опасными побочными действиями или оказываются недоступными для пациентов в силу высокой стоимости. Для многих видов опухолей до сих пор вообще не существует эффективных средств терапевтического воздействия. Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (Food and Drug Administration, FDA) составило в конце 2007 года список препаратов, перешедших в 2007 году в клинические исследования. Противоопухолевые соединения являются безусловными лидерами в этом списке, насчитывая 88 из 253 препаратов (табл. 1). Для сравнения, занимающие второе место антивирусные лекарства и вакцины представлены вдвое меньшим числом препаратов.
Таблица 1
Области терапевтического применения препаратов, перешедших в 2007 г. в клинические испытания. Данные Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA)
Терапевтическая область Число препаратов
Онкология 88
Антивирусные препараты и вакцины 44
Заболевания ЦНС 41
Сердечно-сосудистые заболевания 26
Органы пищеварения и метаболизм 23
Респираторные заболевания 9
Офтальмология 8
Дерматологические 6
Заболевания опорно-двигательного аппарата 6
Другие 6
Противоопухолевые препараты чрезвычайно востребованы в Российской Федерации. В соответствии с прогнозом международного аналитического агентства BMI, объем рынка онкологических препаратов в структуре рецептурных лекарств в Российской Федерации будет неуклонно повышаться (рис. 1). Необходимо отметить, что доля рецептурных лекарств составила в 2006 году 60% от общей доли лекарств на рынке. Онкологические препараты входят в высшую ценовую категорию на отечественном фармацевтическом рынке. Не случайно, например, что, занимая лишь 4,5% российского рынка (в стоимостном выражении), именно онкологические препараты являются лидером по продажам в структуре продаж в государственной системе дополнительного лекарственного обеспечения (ДЛО) (данные аналитического агентства DSM Group). Доля онкологических препаратов в этом сегменте выросла с 25% в 2006 году до 35,6% в 2007 году. Более того, на рынке ДЛО абсолютным лидером по продажам является противоопухолевый препарат Гливек, средство для лечения миелоидной лейкемии.
Представленные данные свидетельствуют о том, что успешная реализация масштабных проектов по созданию инновационных противоопухолевых лекарств не только позволит сохранить здоровье и жизнь миллионам пациентов, но также способна приносить значительную экономическую отдачу. Защищенный патентами, лицензиями и авторскими правами инновационный лекарственный препарат в состоянии обеспечить стабильную прибыль, снижение конкурентных рисков и послужить отправной точкой для дальнейшего развития компании или института-разработчика. Задача последних состоит в привлечении современных научно-исследовательских технологий для наиболее эффективной реализации масштабных проектов по разработке лекарственных субстан-
600 -------------------------------------------------------------
500 -------------------------------------------------------------
400 ---------------------------------------ГП------ ----- -
X
I 300 ---------------1—1----- ----- ------ ----- ----- -
200 — ----------- ------- -------- -------- ------- -------- -
100 — ----------- ------- -------- -------- ------- -------- -
0 I 1—1 , L-I і І_І і — , I—I I—I , I—
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
годы
Рис. 1. Прогноз роста суммарного объема рынка онкологических препаратов в структуре рецептурных лекарств в Российской Федерации. Данные агентства BMI, 2007 г.
ций. Важно отметить, что после десятилетий застоя в создании новых лекарств отечественные разработчики постепенно выходят на современный уровень исследований, что уже в настоящее время приносит многообещающие результаты.
По нашему мнению, сегодня в Российской экономике, по крайней мере в ее фармацевтическом и биотехнологическом секторах, наступает некоторый переломный момент, когда происходит интенсивное освоение новых технологий исследований, а рыночные институты позволяют привлекать инвестиции в область разработки новых препаратов. Успех придет к тем компаниям и институтам, которые смогут умело «оседлать» эти ключевые факторы. Результаты состоявшейся конференции наглядно демонстрируют, что научное сообщество готово внести свой существенный вклад в решение общей задачи инновационного развития отечественной фармацевтической индустрии.
Материал статьи далее структурирован в соответствии с темами и содержанием тематических рабочих сессий, состоявшихся в рамках научной программы конференции.
Пленарные доклады: слово зарубежным коллегам
В рамках пленарной сессии состоялись два доклада от известных зарубежных исследователей, работающих в области молекулярной биологии рака. Я. В. Лавровский, руководитель исследовательских программ компании ChemDiv, Inc. (США), представил доклад на тему «Разработки противоопухолевых лекарств на основе новейших биомишеней». Докладчик обсуждал результаты масштабных исследований по не-
скольким направлениям создания новых противоопухолевых агентов на основе «постгеномных» технологий, проведенных компанией СЪетЮгу совместно со своими партнерами в 2005-2007 годах. Базовой стратегией исследований явилось создание таргетных низкомолекулярных препаратов, воздействующих на определенные биомишени в организме человека, функционирование которых связано с возникновением и развитием опухолей. В частности, речь идет о нескольких типах соединений: ингибиторы активности хемокинового рецептора CXCR4, антиангиогенные агенты - ингибиторы сигнального каскада VEGF/VEGFR, ингибиторы внутриклеточных каскадов эмбрионального развития HedgeHog и Wnt. В ходе работ по этим направлениям было создано несколько перспективных низкомолекулярных агентов для лечения широкого круга раковых патологий, например, рака простаты, поджелудочной железы, прямой кишки и др. Также была разработана новая технология с использованием специальных биодеградируемых полимеров, позволяющая улучшать фармакологические свойства противоопухолевых препаратов. По каждому из указанных направлений исследований в настоящее время проводятся завершающие доклинические исследования, которые, в случае успешности, уже в 2008 г позволят начать клинические испытания.
Рамки небольшой статьи не позволяют детально описать все представленные проекты. Поэтому ограничимся одним примером. Компанией ChemDiv совместно с российскими коллегами из ЦВТ ХимРар была разработана новая технология с использованием специальных биодеградируемых полимеров, позволяющая улучшать фармакологические свойства противоопухолевых препаратов. Так, на основе известного лекарства Таксол™ был создан инновационный препарат Нанотаксол, обладающий пониженной токсичностью и улучшенными фармакокинетическими свойствами. В экспериментах на мышах с привитыми опухолями человека было показано, что Нанотаксол существенно эффективнее исходного препарата в способности к продлению периода выживаемости (рис. 2).
Рис. 2. Нанотаксол обладает улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с исходным препаратом
НАУЧНЫЕ ИТОГИ МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ
Данная технология было апробирована и на других препаратах, в том числе на антибиотиках и анальгетиках. Ее использование позволяет создавать целый класс новых лекарств, используя в качестве основы проверенные препараты.
Стефан Краусс, глава Биомедицинского Инновационного Центра при Университете Осло (Норвегия), осветил некоторые важнейшие аспекты сигнальных клеточных каскадов Hh и Wnt. Эти каскады эмбрионального Развития определяют процессы роста и дифференциации нормальных и ряда опухолевых клеток (Taipale & Beachy 2001). В последние годы было выяснено, что Hh и Wnt каскады являются потенциальными фармакологическими биомишенями, а их ингибиторы - перспективными терапевтическими средствами для лечения некоторых видов рака, включая базальноклеточную карциному, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки (Kiselyov et al. 2007). В таблице 2 представлены актуальные данные по модуляторам активности Hh и Wnt каскадов, вошедшим в клиниче-
скую или доклиническую фазу исследований. В докладе был дан краткий обзор принципов функционирования Hh и Wnt сигнальных каскадов в процессах эмбрионального развития, роста стволовых и опухолевых клеток. Были также представлены данные биологических испытаний новых соединений, способных ингибировать эти каскады.
Инновационные противоопухолевые агенты
В рамках первой рабочей сессии были представлены четыре доклада, посвященных новым разработкам отечественных исследователей в области создания средств химической терапии опухолей.
Доклад A.A. Штиля, доктора медицинских наук, заведующего лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, назывался «Оли-вомицин А - мощный противоопухолевый антибиотик. Механизмы цито-
Таблица 2
Модуляторы активности НЬ и Wnt каскадов, вошедшие в клиническую или доклиническую фазу исследований
Название Механизм действия Фаза испытний Разработчик Терапевтическая область
CUR-61414 (G-024856) антагонист Бшо рецептора, ингибитор Ык каскада фаза Iклиниче-ских испытаний Roche, Curis, Genentech Базально -клеточная карцинома
Cyclopamine антагонист Бшо рецептора, ингибитор Ык каскада доклинические Johns Hopkins University, Howard Hughes Medical Institute, Curis рак
Hh-Ag 1.2 агонист Бшо рецептора, активатор Ык каскада доклинические Curis, Elan болезнь Паркинсона
SAG 1.1 агонист Бшо рецептора, активатор Ык каскада доклинические Curis, Johns Hopkins University Нейрологические заболевания
CUR-691 антагонист Бшо рецептора, ингибитор Ык каскада доклинические Curis, Genentech Нейрологический рак
IPI-609 ингибитор Ык каскада доклинические Infinity Pharmaceuticals рак
SDX-308 (CEP-18082) ингибитор Wnt каскада, ингибитор Р-катенина доклинические Salmedix рак
SDX-309 ингибитор Wnt каскада, ингибитор Р-катенина доклинические Salmedix рак
SDX-328 ингибитор Wnt каскада, ингибитор Р-катенина доклинические Salmedix рак
ICG-001 ингибитор Wnt каскада, ингибитор фактора СВР доклинические Institute for Chemical Genomics, Choonqwae рак прямой кишки
PRLX-8025 ингибитор Wnt каскада, ингибитор Р-катенина доклинические Prolexys рак прямой кишки
токсичности и оптимизация структуры». Оливомицин А (рис. 3), производное ауреоловой кислоты (см., например, Simonova et al. 2005), является мощным индуктором апоптоза, вызывая в концентрации всего 50 нМ гибель 50% клеток линий рака толстой кишки, молочной железы, меланомы и лейкоза человека в течение 24 часов. Соединение образует комплексы с узкой бороздкой ДНК в GC-богатых областях. Следовательно, цитотоксичность Оливомицина А может быть вызвана повреждением структуры дуплекса; последствиями этого будут, в частности, нарушения матричного синтеза. Действительно, в соответствии с экспериментальными данными, Оливомицин А является ингибитором транскрипции, причем сегрегация ядрышка (признак блокирования транскрипции, обусловленной РНК-полимеразой I) проявляется в первые минуты воздействия низких концентраций (12,5 нМ) препарата. Микрочип-анализ генной экспрессии выявил снижение мРНК ~ 50% генов. Наибольшее подавление экспрессии было отмечено для генов, продукты которых важны для выживания клеток: субъединица VI цитохромоксидазы и протимозин-альфа (снижение соответственно в 10 и 8 раз через 3 часа обработки клеток 100 нМ Оливомицина А). В низких концентрациях (<25 нМ) препарат вызывал активацию p53-зависимой транскрипции гена-репортера, а в более высоких -блокировал р53-зависимую трансактивацию (базальную и индуцируемую противоопухолевыми препаратами). В относительно высоких концентрациях (500 нМ) Оливомицин А снижал репликацию ДНК в клетках. Ингибирование матричных синтезов может быть обусловлено подавлением активности топоизомеразы I (ИК50 ~ 25 нМ). В докладе были также представлены результаты химической оптимизации Оливомицина А с целью создания соединений с выраженной противоопухолевой активностью и лучшим терапевтическим индексом, чем у исходного антибиотика. В частности, производное ЛХТА-1297 проявило цитотоксичность в культурах опухолеых клеток и противоопухолевую активность у животных с перевивным лейкозом Р388. В настоящее время проводится углубленное доклиническое исследование этого модифицированного антибиотика.
OMe OH
,OH
OMe,
R" =
HO
CH,
OAcch3
H3C
CH
O
i-PrCO.
CH3 CH3
HO
O-
HO
Рис. 3. Противоопухолевый антибиотик Оливо-мицин А
В докладе кандидата химических наук С.А. Лака-тоша, старшего научного сотрудника лаборатории химической трансформации антибиотиков ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, были представлены сведения о создании новых ингибиторов протеинкиназ для преодоления лекарственной устойчивости инфекций и злокачественных опухолей. Серин-треониновые и тирозиновые протеинкиназы - ферменты, участвующие в передаче сигналов от клеточной мембраны к ядру и аппарату генной транскрипции, играют ключевую роль в развитии основных заболеваний человека, включая диабет, шизофрению, сердечно-сосудистые расстройства, различные виды опухолей, нарушения иммунитета (Cohen 2005). Эти киназы также обеспечивают образование бактериальных биопленок и поддержание толерантности и персистирования сложных популяций микроорганизмов. Докладчик представил новые методы синтеза ингибиторов протеинкиназ нового типа -аналогов известных ингибиторов класса бис(индол-3-ил)малеимидов. Скрининг на панели из 24-х протеин-киназ, относящихся как к серин-треониновым, так и к тирозиновых протеинкиназам, а также на изоформах протеинкиназы С (Са, Ср, Су) и PKC-подобных се-рин-треониновых протеинкиназах бактерий, привел к отбору ряда перспективных соединений. В продолжающихся в настоящее время исследованиях отобранные вещества будут использованы как основа для создания малотоксичных и высокоселективных ингибиторов киназ для лечения опухолей человека и преодоления устойчивости бактерий к антибиотикам.
Е.Л. Водовозова, доктор биологических наук, заместитель заведующего лабораторией химии липидов ИБХ РАН, представила сообщение на тему разработки и применения липидных производных химиотерапевтических средств в липосомальных формах.
Включение противоопухолевых препаратов в состав носителей-наночастиц, в том числе липосом, позволяет уменьшить общую токсичность и повысить эффективность лечения за счет уменьшения концентрации свободного лекарства в кровотоке и явления пассивного транспорта носителей в опухоли. В свою очередь, биодеградируемые липидные производные лекарств (липофильные пролекарства) обладают улучшенной фармакокинетикой. В ИБХ РАН были разработаны синтезы пролекарств широко применяемых в клинике препаратов с целью включения их в липидный бислой липосом (рис. 4). Доставка лекарств в опухолевые клетки в виде липофильных пролекарств в мембране липосом дает ряд преимуществ по сравнению с инкапсулированием во внутренний водный объем носителя. В частности, уменьшается утечка препарата в процессе циркуляции липосом в кровотоке и при
Рис. 4. Структура липосомы, содержащей липидные производные лекарственных субстанций
взаимодействии с клеткой; изменяется механизм проникновения лекарства в клетку и его внутриклеточный трафик, что повышает потенциал преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток; упрощается технология приготовления лекарственных липосом. Для увеличения селективности действия (таргетная терапия) исследователями были сконструированы липосомы, несущие молекулярные «адреса» углеводной природы, синтез которых разработан в ИБХ РАН. В докладе были рассмотрены принципы построения молекул липофильных пролекарств и гликоконъюгатов, способ получения липосомальных препаратов длительного хранения. В ряде недавних работ была показана эффективность предлагаемого подхода на примерах резкого улучшения терапевтических свойств лекарств на моделях экспериментальных животных с раком молочных желез и лимфолейкозами, а также ингибирования пролиферации метотрексат-резистентных клеток лейкемии человека (см., например, Водовозова и др. 2007).
Кандидат биологических наук В.И. Казей, руководитель отдела высокопроизводительного скрининга Исследовательского института химического разнообразия (ИИХР), функционирующего на базе ЦВТ ХимРар, представил доклад на тему «Открытие специфических ингибиторов Р13К сигнальных каскадов: новые
тенденции в разработке противоопухолевых агентов». В рамках оригинальной концепции «химическое разнообразие с точки зрения биологического эффекта» в ИИХР совместно с компанией ChemDiv был разработан ряд фокусированных библиотек химических соединений, предназначенных для эффективного первичного поиска низкомолекулярных модуляторов специфических мишеней или клеточных каскадов. Докладчик представил результаты скрининга библиотеки соединений (5000 соединений, включая 650 структурных хемотипов), «ортогонально» аннотированной по отношению к ряду мишеней. Аннотация включала в себя как «традиционные» (киназы, рецепторы, сопряженные с G-белками, ядерные рецепторы, ионные каналы и про-теазы), так и «специальные» биологические мишени (сигнальные каскады и модуляторы динамики мик-ротубулярных белков). С использованием концепции Focused Diversity™ удалось идентифицировать серии эффективных ингибиторов киназы PI3Ka специфического и двойного действия. В частности, были получены два структурных хемотипа с высокой патентоспособностью, в ряду которых были обнаружены эффективные ингибиторы в клеточных и ферментных тестах (100-2000 нМ), с функциональной активностью в диапазоне 4-5 нМ при ингибировании киназы ^Akt (ELISA). Селективность этих агентов по отношению к различным киназам составила: PI3KP > 50х; PI3K5, PI3Ky> 10х; PKA и 20 других киназ > 100х. Были также получены важные экспериментальные in vivo показатели, относящиеся к фармакокинетике, токсичности, эффективности по отношению к клеточным линиям рака прямой кишки и опухолей молочной железы.
Новые биомишени для действия противоопухолевых препаратов и тест-системы биологических испытаний
В рамках второй рабочей сессии было представлено четыре доклада. А.Н. Ку-имов, кандидат биологических наук,
руководитель лаборатории культур животных клеток НИИ физико-химической биологии МГУ,
выступил с сообщением на тему «Ферменты семейства PARP как платформа для создания новых лекарств». Поли-ADP-рибозилирование является одним из способов посттрансляционной модификации белков, который клетка использует в механизмах защиты ДНК от повреждений, для регуляции митоза и других жизненно важных процессов. К ферментам семейства PARP (поли-ADP-рибоза-полимераз) относят 17 белков, закодированных в геноме человека (Otto et al. 2005). Среди них наиболее изученными являются PARP-1, активируемая разрывами ядерной ДНК, и танкиразы (Dynek & Smith 2004), два сигнальных белка, локализованных в различных клеточных компартментах. Все ферменты этого семейства используют NAD+ для синтеза поли-ADP-рибозы, ковалентно связанной с рядом специфических белковых субстратов. В отечественных и зарубежных лабораториях изоэнзим танкираза-2 человека был клонирован как опухолевый антиген. Этот фермент в норме экспрессируется в клетках эпителия почечных канальцев и в некоторых других типах дифференцированных клеток. Исследователи НИИ физико-химической биологии МГУ также обнаружили танкиразу-2 в 20-30% исследованных опухолей молочной железы, причем ферментативная активность одной или обеих танкираз была повышена во всех исследованных опухолевых клетках. Функция танкиразы состоит в регуляции длины теломер ДНК, расхождения хромосом при митозе и некоторых других процессов. В табл. 3 показаны результаты недавнего исследования, демонстрирующие увеличенное присутствие танкиразы у пациентов с различными видами опухолей по сравнению со здоровыми людьми. На основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод о том, что ингибиторы танкиразы и других ферментов семейства PARP могут найти применение при лечении многих заболеваний, в том числе онкологических.
Доклад С.Н. Новикова, старшего научного сотрудника отдела сенсорных систем Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (ИФ РАН), был посвящен перспективам создания новых противоопухолевых препаратов на основе матрицы пиразин-связывающих белков. Пиразин-связывающие белки (англ. pyrazine-binding proteins, PyrBP) относятся к се-
Таблица 3
Присутствие танкиразы (клон МО-ВС-203) у пациентов с различными видами опухолей по данным иммунологического теста (8ЬеЬ/икЬоу 2007)
Вид опухоли Присутствие танкиразы по отношению к общему числу образцов (число по-ложит./общее число (%))
Нормальные доноры (нет опухоли) 6/228 (2,6%)
Рак молочной железы 6/60 (10,0%)
Рак прямой кишки 17/116 (14,7%)
Рак шеи 2/31 (6,5%)
Меланома 3/45 (6,7%)
Рак яичников 3/75 (4,0%)
Рак почек 2/51 (3,9%)
мейству низкомолекулярных транспортных белков с молекулярной массой 18-22 кДа - липокалинов, осуществляющих адресный перенос гидрофобных физиологически активных соединений к органу-мишени (или ткани-мишени) в жидких средах (кровь, лимфа, слизь). В докладе был представлен подробный анализ современного состояния экспериментальных исследований по генотоксичности 2,5-диметилпиразина (2,5-DMP), а также дано теоретическое обоснование перспектив создания новой группы противоопухолевых препаратов на основе 2,3,5,6-тетраметилпиразина (TMP, лигустразина), ассоциированного с рекомбинантным пиразин-связывающим белком. Были также рассмотрены принципы конструирования новых лекарственных соединений в составе полимерной матрицы PyrBP (Новиков 2005). Особое внимание было уделено разработке неинвазивных (ингаляционных) методов введения данного комплекса и результатам экспериментальных работ по выделению в клетках обонятельной выстилки и легочной ткани млекопитающих специфических рецепторов к PyrBP. Докладчик аргументировал, что дальнейшие исследования в этом направлении, с одной стороны, могут привести к резкому удешевлению и значительному повышению эффективности действия лекарственных средств, с другой - к снижению нежелательных побочных эффектов.
Доклад Н.Ю. Анисимовой, кандидата биологических наук, старшего научного сотрудника Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина РАМН, были рассмотрены фармакологически значимые биомишени для терапии рака предстательной железы (РПЖ), а также действующие на них таргетные препараты. РПЖ занимает 3-4 место в мировой структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужского населения. При этом в США ситуация тревожнее всего - 1 место по заболеваемости (около 300 тыс. больных в год), в Западной Европе 1-2 место (около 200 тыс. больных в год). В России РПЖ занимает 4 место в структуре заболеваемости и 1 место по приросту заболеваемости за последние 10 лет. Основными факторами риска возникновения РПЖ являются генетическая предрасположенность, возраст, расовая принадлежность, воспалительные процессы, малоподвижный образ жизни, «западная» диета, насыщенная жирами животного происхождения и углеводами. Наибольшую проблему для терапии представляет гормонорезистентный РПЖ..
В докладе Н.Ю. Анисимовой обсуждались механизмы развития гормонорезистентности, а также были рассмотрены фармакологически наиболее значимые мишени для действия низкомолекулярных лекарственных веществ (НЛВ). Используемые или перспективные НЛВ для терапии гормонорезистентного РПЖ могут быть условно разделены на ингибиторы андрогенных рецепторов, ингибиторы факторов роста, а также ингибиторы ключевых мишеней клеточного цикла. Весьма перспективен комбинированный подход - совместное использование ингибитора фактора роста и ингибитора клеточного цикла. Значительное внимание в докладе было уделено системам доставки лекарственных веществ, а также вопросам иммунотерапии РПЖ.
Разработка новых лекарственных средств осуществляется авторами в рамках партнерского проекта с Министерством Энергетики США (проект МНТЦ № 3548). В рамках проекта синтезируется и исследуется несколько тысяч потенциальных НЛВ.
Раковая опухоль переходит в фазу безудержного роста и метастазирования благодаря эффективному взаимодействию раковых клеток с элементами стромы, включающей компоненты неоангиогенеза и воспалительных реакций (как проявление имунного ответа организма хозяина на опухоль). Как известно, опу-холь-ассоциированные лейкоциты (особенно макрофаги), могут не только ингибировать, но и стимулировать опухолевый рост. Поэтому комплексная система тестирования препаратов с предполагаемой противоопухолевой и/или иммуномодулирующей активно-
стью может быть чрезвычайно полезна для оценки как прямого, так и опосредованного действия исследуемых лекарственных субстанций на все вышеперечисленные компоненты опухоли, включая спонтанный рак молочных желез (РМЖ) и лимфолейкоз (ЛЛ) самок мышей линий BLRB/BYRB- и CBRB -Rb(8.17)1IEm. Разработке именно такой системы тестирования посвящена работа Е.В. Моисеевой, кандидата биологических наук, научного сотрудника Института биоорганической химии РАН.
В соответствии с разработанной методикой, процесс тестирования включает 4 последовательных этапа. Нулевой цикл -тестирование противоопухолевых препаратов (ПП) in vitro на краткосрочных культурах РМЖ и ЛЛ, с одной стороны, и на культурах иммунных клеток как интактных мышей, так и опухоленосителей, с другой. Параллельно ПП тестируют на 1 этапе in vivo: на стартовых (летальных и полулетальных), предстартовых и терапевтических перевиваемых сингенных моделях РМЖ и ЛЛ. При получении обнадеживающих результатов тестирование проводят на 2-м этапе уже на спонтанных моделях РМЖ. В качестве заключительного этапа проводят тестирование ПП на предопухолевых моделях: самках мышей линий BLRB/BYRB с 90/95% частотой РМЖ и 10/5% частотой ЛЛ. Последний этап особенно рекомендуется для субстанций с иммуномодулирующей активностью, так как, естественно, состояние иммунного статуса пожилого организма хозяина может повлиять на время возникновения спонтанного РМЖ и/или ЛЛ.
Следует отметить, что Е.В. Моисеева зарегистрирована в международном списке (Великобритания) и на сайте Джексеновской лаборатории (США) как держатель оригинальной коллекции мышей. В настоящее время эта коллекция состоит из 5 линий мышей с частотой РМЖ от 90/95% у родственных линий BLRB/BYRB до 10-5% у линий A/JSnCitMoise и BALB/cJCitMoise при промежуточной, 50% частоте злокачественного РМЖ у мышей линии CBRB. При этом практически все самки линии CBRB к 12месячному возрасту демонстрируют доброкачественные опухоли - множественные лактирующие аденомы и к 18-месячному возрасту - эпителиальные опухоли яичника и матки.
Поиск противоопухолевых препаратов на основе новых технологий генерации знаний
Текущий этап развития исследований в области создания новых лекарственных препаратов характеризуется интенсивным накоплением эмпирических дан-
ных. К сожалению, их еще нельзя отождествлять со знаниями, так как последние представляют из себя результат детального анализа, систематизации и обработки экспериментальных фактов. Ввиду значительных объемов и сложной структуры имеющихся в настоящее время химико-биологических данных, процесс генерации знаний представляет из себя нетривиальный, но чрезвычайно важный этап современных исследований. Именно этой проблеме была посвящена последняя научная сессия конференции, включающая в себя четыре научных доклада.
В докладе доктора биологических наук В.В. По-ройкова, заместителя директора по научной работе, заведующего лабораторией структурнофункционального конструирования лекарств ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, была поднята тема компьютерного поиска противоопухолевых препаратов мультитаргетного действия. Основная парадигма создания новых лекарств в XX веке базировалась на
представлении об избирательном действии препарата на определенную молекулярную мишень, которое должно приводить к нормализации патологического процесса; при этом взаимодействие с другими мишенями в организме обычно связывали с возникновением нежелательных побочных эффектов и токсичности. С развитием постгеномных исследований стало ясно, что многие заболевания имеют сложную этиологию, и возникла концепция лекарств множественного действия, которые обладают преимуществами по сравнению с препаратами, селективно действующими на единственную мишень. Поиск таких лекарств может базироваться на прогнозе спектра биологической активности с использованием компьютерной системы PASS, разработанной докладчиком и его коллегами (Poroikov et al. 2003). Эта программа способна предсказывать более 3000 видов биологической активности и молекулярных механизмов действия со средней точностью около 95% (Geronikaki et al. 2004). В качестве иллюстрации на рис. 5. представлен вид поисковой панели программы PASS с результатами поиска потенциальных мультитаргет-ных препаратов, активаторов апоптоза. В докладе обсуждались возможности определения перспективных наборов молекулярных мишеней методами биоинформатики и выявления прототипов лекарств множественного действия в базах данных доступных образцов химических соединений.
Рис. 5. Результаты поиска активаторов апоптоза при помощи программы PASS
Кандидат биологических наук Г.Н. Апрышко, руководитель груп-ппы Банка данных по противоопухолевым веществам отдела экспериментальной химиотерапии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического центра (РОНЦ) им. Н.Н. Блохина РАМН, представила в своем докладе специализированную базу данных РОНЦ РАМН. За более чем полувековую деятельность этого крупного научного центра по поиску и разработке лекарств для лечения рака были изучены тысячи синтетических и природных веществ. В результате этих исследований были не только внедрены в клиническую практику эффективные противоопухолевые лекарства, но и накоплен большой объем информации по результатам экспериментов. Результаты были получены в унифицированных условиях одного и того же учреждения, преимущественно не опубликованы или публиковались в изданиях, имеющих ограниченное распространение. Эта информация была организована в Банк данных, содержащий архив первичных документов, картотеку паспортов на вещества и компьютерную Базу данных (Апрышко и Решетникова 2007). В Базе данных представлены химические структуры, номенклатурные характеристики, физико-химические свойства, качественные и количественные данные по результатам первичного тестирования и углубленного изучения цитотоксичности и противоопухолевой активности в различных тест-системах около 12000 синтетических веществ и природных экстрактов, изученных в РОНЦ РАМН и ряде других отечественных научных учреждений. В докладе была представлена структура Базы данных, основные химические классы веществ. Были рассмотрены возможности использования Базы данных для информационного обеспечения работ по созданию новых противоопухолевых лекарств и в аналитических исследованиях в области экспериментальной химиотерапии опухолей, а также для формирования обучающих массивов при компьютерном прогнозировании на этапе доэксперименталь-ного скрининга цитостатической активности in vitro и противоопухолевой активности in vivo с помощью системы PASS и ДСМ-метода.
Последние два доклада конференции были представлены молодыми исследователями, работающими в области компьютерного конструирования лекарств. Одна из наиболее актуальных задач поиска новой противоопухолевой терапии - идентифицировать белки, которые участвуют в возникновении и развитии злокачественных новообразований и отобрать среди них наиболее перспективные мишени.
О.Н. Коборова, лаборант-исследователь ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, студентка пятого курса факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоно-сова, рассказала о разработке нового компьютерного алгоритма выявления молекулярных биомишеней для действия противоопухолевых соединений. Предложенный алгоритм моделирует сети регуляции клеточного цикла логическими сетями. Входными данными являются состояния вершин сети (белков и/или генов) в начальный момент времени; выходными - набор состояний вершин в разные моменты времени - траектории. Для выявления белков, воздействие на которые наиболее существенно изменяет траектории желательным образом (например, стимуляция апоптоза раковых клеток без влияния на здоровые), состояние вершин фиксируется согласно виду предполагаемого воздействия, например, ингибирование соответствующего белка или белков.
Метод был апробирован на примере рака молочной железы с использованием молекулярной сети, состоящей из 85 вершин: 73 белков, 7 белковых комплексов и 5 генов из базы данных ТИАКБРАТН (http://www.biobase.de), и данных об экспрессии, содержащих список гипо- и гиперэкспрессированных белков из базы данных Суе1о^
(http://cyc1onet.bioum1.org). Было обнаружено, что при ингибировании Р1Ш или одновременном ингибировании пары PLK1 и MDM2, траектория изменяется в сторону наступления апоптоза раковых клеток. При этом для белков PLK1 и MDM2 уже известны лиганды, которые находятся на стадии доклинических тестирований, в то время как для новой мишени Р1Ш требуется экспериментальное подтверждение ее перспективности.
Последний доклад рабочей программы конференции представил А.Э. Воронков, научный сотрудник химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. В продолжение темы поиска новых ингибиторов каскадов эмбрионального развития, поднятой С. Кра-уссом, молодой российский исследователь продемонстрировал свежие данные компьютерного моделирования взаимодействий между компонентами Wnt сигнального каскада. В ходе работы была сконструиро-
вана пространственная модель комплекса Wnt белка с димерным CRD-доменом рецептора Frizzled; формирование указанного комплекса является критически важным событием для передачи сигнала по Wnt каскаду. Были выявлены критические аминокислотные остатки, необходимые для эффективного связывания, и построена докинг-модель, пригодная для отбора потенциальных ингибиторов Wnt-Frizzled взаимодействий. При помощи последней был произведен компьютерный отбор 500 соединений из 10 000 соединений. Отобранные вещества в настоящее время проходят биологическое тестирование.
Тенденции
Анализ представленных на конференции докладов позволяет выявить некоторые общие тенденции в современных исследовательских программах, посвященных разработке противоопухолевых агентов. По мнению большинства исследователей, наиболее принципиальные проблемы связаны с возникновением лекарственной устойчивости опухолевых клеток и чрезвычайно комплексными механизмами жизнедеятельности клеток в патологическом состоянии. В качестве инструментов для решения этих проблем предлагаются различные подходы: поиск и всесторонние исследования опухолевых биомишеней; создание адекватных экспериментальных моделей; развитие методов синтеза и тестирования химических соединений; использование передовых компьютерных алгоритмов и баз данных.
Исследования, посвященные поиску наиболее перспективных для терапевтического воздействия биомишеней, занимают заметное место в современных научных работах. Не удивительно, что абсолютное большинство докладов на конференции было посвящено - прямо или косвенно - именно опухолевым биомишеням (Я.В. Лавровский, С. Краусс, А.А. Штиль, С.А. Лакатош, В.И. Казей, А.Н. Куимов, С.Н. Новиков, Н.Ю. Анисимова, В.В. Поройков, О.Н. Ко-борова, А.Э. Воронков). Современные разработчики используют обширный арсенал средств - анализ генной экспрессии, методы хемогеномики и протеомики, компьютерный анализ данных и моделирование взаимодействий лиганд-биомишень.
Эффективные исследования по-прежнему немыслимы без целенаправленных усилий химиков-синтетиков, необходимых практически на всех этапах создания новых лекарств. Арсенал методов синтетической химии постоянно совершенствуется, позволяя проводить направленные модификации сложных структур натуральных соединений (А.А. Штиль), получать комплексные конъюгаты низкомолекулярных лекарств с биомолекулами (Е.Л. Водовозова), а также синтезировать большие массивы соединений при помощи передовых методов комбинаторной химии (С.А. Лакатош, В.И. Казей).
Чрезвычайно важной задачей является создание адекватных экспериментальных моделей, позволяющих изучать механизмы развития опухолей, а также
исследовать химические соединения, влияющие на эти процессы. Для решения этой задачи привлекают современные технологии генной инженерии, позволяющие создавать, например, генетически измененные линии животных, являющихся наиболее приближенными к человеку моделями (Е.В. Моисеева). Все большую роль играют экспериментальные in vitro модели, позволяющие осуществлять высокопроизводительный скрининг библиотек химических соединений на активность по отношению к опухолевым биомишеням (Я.В. Лавровский, В.И. Казей).
Нанотехнологические разработки позволяют реализовывать новые подходы к терапии опухолей. Так, чрезвычайно интересные разработки на эту тему были представлены Я.В. Лавровским (биодградируемые полимерные системы, Нанотаксол), а также Е.Л. Водовозовой (липосомальные системы доставки противоопухолевых лекарств). Перспективы нанотехнологических подходов в лечении рака предстательной железы обсуждались в докладе Н.Ю. Анисимовой.
Наконец, еще одной тенденцией, на которую хотелось бы обратить внимание, это все более интенсивное использование компьютерных систем моделирования (А.Э. Воронков) и анализа данных (В.В. Поройков, О.Н. Коборова, В.И. Казей), в том числе основанных на специализированных базах данных (Г.Н. Апрышко), имеющих целью направленный, рациональный поиск новых лекарств. Подобные системы становятся неотъемлемой частью современных исследовательских программ.
Таким образом, можно резюмировать, что прошедшая конференция в очередной раз продемонстрировала определяющую роль «постгеномных» технологий в сфере разработки противоопухолевых лекарственных субстанций. Ситуация в этой, а также большинстве других областей исследований в мировой фармацевтической индустрии в настоящее время характеризуется интенсивной эксплуатацией новейших технологий исследований, включая дисциплины геномики, протеомики, комбинаторного синтеза, биологического и компьютерного скрининга.
* * *
Многочисленные опухолевые патологии остаются одними из самых коварных и непредсказуемых заболеваний, вносящих, по данным Всемирной Организации Здравоохранения, наибольший вклад в смертность населения планеты. Вместе с тем, колоссальные усилия ученых и врачей во всем мире привели к существенному прогрессу в выяснении механизмов развития опухолей, а также к выработке новых эффективных методов противодействия этим процессам. Полученные результаты позволяют более оптимистично оценивать перспективы разработки противоопухолевых лекарств нового поколения.
По мнению многих участников конференции, высказанному в ходе докладов и многочисленных дискуссий, а также проведенного организаторами анкетирования, состоявшийся форум отличался высоким
научным и организационным уровнем. Например, д-р Я.В. Лавровский (ChemDiv, Inc., США) так оценил состоявшийся форум: «Технологии исследований, основанные на достижениях «геномной революции», способны дать огромный эффект. Сегодня мы увидели целый ряд работ, которые в скором будущем приведут к реальным лекарствам на аптечном прилавке. Прекрасный конгресс, поздравляю организаторов!». По словам ученого секретаря конференции, д.х.н. К.В. Балакина (ЦВТ ХимРар), «потенциал исследований, основанных на передовых достижениях геномики и протеомики, пока еще не реализуется в полной мере... Организуя этот конгресс, мы ставили задачу более активного внедрения этих концепций в теорию и практику современной фармакологии».
С научной программой конференции, пресс-релизами и сопутствующей информацией читатели могут познакомиться на специализированном Интернет-сайте http://www.chemrar.ru/files/k6.html.
ЛИТЕРАТУРА
Апрышко Г.Н., Решетникова В.В. Регистрационно-номенклатурный и химический модули электронной базы данных Информационной системы по противоопухолевым агентам. Научно-техническая информация 2007, 6, 24-31.
Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Гаенко Г.П., Молотковский Юл.Г. Липосомы с диглицеридным конъюгатом метотрексата: активность в культуре ме-тотрексат-резистентных клеток лейкемии. Биоорг. Химия 2007, 33 (4): 470-473.
Новиков С.Н. Перспективы интраназальной формы 2,3,5,6-тетраметилпиразина (лигустразина) в прикладной медицине. Материалы 2-1 международной конференции «Наука, бизнес и образование», 10-13 мая 2005 г., Пущино, стр. 89.
Cohen P. Protein kinases - the major drug targets of the twenty-first century? Nat. Rev. Drug. Disc., 2002, 1, 309.
Dynek JN, Smith S. Resolution of sister telomere association is required for progression through mitosis. Science 2004, 304(5667), 97-100.
Geronikaki A.A., Dearden J.C., Filimonov D., Galaeva I., Garibova T.L., Gloriozova T., Krajneva V., Lagunin A., Macaev F.Z., Molodavkin G., Poroikov V.V., Pogrebnoi S.I., Shepeli F., Voronina T.A., Tsitlakidou M., Vlad L. Design of new cognition enhancers: from computer prediction to synthesis and biological evaluation. J Med Chem. 2004, 47(11), 2870-2876.
Kiselyov A.S., Tkachenko S.E., Balakin K.V., Iva-chtchenko A.V. Small molecule modulators of Hh and Wnt signaling pathways. Expert Opin. Ther. Targets, 2007, 11(8), 1-15.
Otto H, Reche PA, Bazan F, Dittmar K, Haag F, Koch-Nolte F. In silico characterization of the family of PARP-like poly(ADP-ribosyl)transferases (pARTs). BMC Genomics 2005, 6, 139.
Poroikov V.V., Filimonov D.A., Ihlenfeldt W.D., Gloriozova T.A., Lagunin A.A., Borodina Y.V., Stepan-chikova A.V., Nicklaus M.C. PASS biological activity spectrum predictions in the enhanced open NCI database browser. J. Chem. Inf. Comput. Sci., 2003, 43, 228-236.
Simonova V.S., Samusenko A.V., Filippova N.A., Tevyashova A.N., Lyniv L.S., Kulik G.I., Chekhun V.F., Shtil A.A. Olivomycin induces tumor cell apoptosis and suppresses p53-induced transcription. Bull. Exp. Biol. Med. 2005, 139(4), 455-459.
Shebzukhov Y.V., Lavrik I.N., Karbach J., Khlgatian S.V., Koroleva E.P., Belousov P.V., Kashkin K.N., Knuth A., Jager E., Chi N.W., Kuprash D.V., Nedospasov SA. Human tankyrases are aberrantly expressed in colon tumors and contain multiple epitopes that induce humoral and cellular immune responses in cancer patients. Cancer Immunol. Immunother. 2007, in press.
Taipale J. & Beachy P.A. The Hedgehog and Wnt signaling pathways in cancer. Nature 2001, 411(6835), 349-354.
