CC BY
0
Для корреспонденции
Береснева Ольга Николаевна - кандидат биологических
наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической
физиологии почек НИИ нефрологии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ
им. И.П. Павлова Минздрава России
Адрес: 197022, Российская Федерация, г. Санкт-Петербург,
ул. Л. Толстого, д. 17, корп. 54
Телефон: (812) 346-39-26
E-mail: beresnevaolga@list.ru
https://orcid.org/0000-0002-7532-2405
Береснева О.Н.1, Парастаева М.М.1, Иванова ГГ.2, Зарайский М.И.1, Богданова Е.О.1, Огнев О.Г.3, Иванова А.Н.4, Кучер А.Г.1
Постгеномные и структурные изменения в миокарде крыс Wistar, получавших рацион с высоким содержанием соли
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 197022, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук, 199034, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет», 196601, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет», 199034, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russian Federation, 197022, St. Petersburg, Russian Federation Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences, 199034, St. Petersburg, Russian Federation
St. Petersburg State Agrarian University, 196601, St. Petersburg, Russian Federation St. Petersburg State University, 199034, St. Petersburg, Russian Federation
Финансирование. Работа выполнена при финансировании Российского фонда фундаментальных исследований (грант 19-015-00221). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Береснева ОН., Кучер А.Г.; сбор и обработка данных - Береснева ОН., Парастаева М.М., Иванова Г.Т., Зарайский М.И., Богданова Е.О., Огнев О.Г., Иванова А.Н.; статистическая обработка данных - Береснева О.Н., Огнев О.Г.; написание текста - Береснева О.Н., Иванова Г.Т., Парастаева М.М.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Благодарности. В работе было использовано оборудование РЦ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ. Для цитирования: Береснева ОН., Парастаева М.М., Иванова Г.Т., Зарайский М.И., Богданова Е.О., Огнев О.Г., Иванова АН., Кучер А.Г. Постгеномные и структурные изменения в миокарде крыс Wistar, получавших рацион с высоким содержанием соли // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 6. С. 73-82. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-6-73-82 Статья поступила в редакцию 28.08.2023. Принята в печать 30.10.2023.
Funding. This work was supported by Russian Foundation for Basic Research (project No. 19-015-00221). Conflict of interest. Authors declare no conflict of interests.
Contribution. The concept and design of the study - Beresneva O.N., Kucher A.G.; data collection - Beresneva O.N., Parastaeva M.M., Ivanova G.T., Zaraiskii M.I., Bogdanova E.O., Ognev O.G., Ivanova A.N.; writing the text - Beresneva O.N., Ivanova G.T., Parastaeva M.M.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Beresneva O.N., Parastaeva M.M., Ivanova G.T., Zaraiskii M.I., Bogdanova E.O., Ognev O.G., Ivanova A.N., Kucher A.G. Postgenomic and structural changes in the myocardia of Wistar rats fed a high-salt diet. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (6): 73-82. DOI: https:// doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-6-73-82 (in Russian) Received 28.08.2023. Accepted 30.10.2023.
Postgenomic and structural changes in the myocardia of Wistar rats fed a high-salt diet
Beresneva O.N.1, Parastaeva M.M.1, Ivanova G.T.2, Zaraiskii M.I.1, Bogdanova E.O.1, Ognev O.G.3, Ivanova A.N.4, Kucher A.G.1
2
3
4
2
3
4
Высокое содержание соли в пищевом рационе - одна из причин роста артериального давления (АД) и прогрессирования сердечно-сосудистых нарушений. В ремоделировании миокарда могут участвовать различные микроРНК (миРНК), которые модулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. Однако их роль в этом процессе до конца не изучена. Дальнейших исследований требует и выявление структурных изменений в миокарде в условиях длительного потребления высокосолевого рациона.
Цель исследования - оценить уровни экспрессии нуклеарного фактора транскрипции кВ (NF-kB), миРНК-21 и структурные изменения в миокарде при длительном потреблении крысами Wistar рациона с высоким (8%) содержанием поваренной соли.
Материал и методы. Половозрелые самцы крыс стока Wistar с исходной массой тела 280,5±42,7 г были разделены на 2 группы по 10 животных. В течение 4 мес животные контрольной группы (NS) получали стандартный рацион (0,34% NaCl), животные другой группы - аналогичный высокосолевой рацион (8% NaCl) (HS). Через 4 мес у крыс измеряли систолическое АДманжеточным методом на хвосте, после препарирования оценивали индекс массы миокарда, проводили гистологическое и электронно-микроскопическое исследование миокарда, определяли уровни экспрессии миРНК-21 и NF-kB в миокарде.
Результаты и обсуждение. Потребление рациона с высоким содержанием хлорида натрия в течение 4 мес не оказывало влияния на уровень систолического АД у нормотензивных крыс Wistar, однако приводило к росту индекса массы миокарда на 25,0% (p<0,05). В группе HS выявлены гипертрофия кардиомиоцитов и увеличение толщины стенки артериальных сосудов. Площадь периваскулярного фиброза у крыс группы HS была почти в 1,8раза выше, чем у животных группы NS. У животных, получавших высокосолевой рацион, повышались относительные уровни экспрессии NF-kB (более чем в 2 раза) и миРНК-21 (почти в 6 раз) по сравнению с контролем. Можно полагать, что негативное воздействие на сердечно-сосудистую систему высокосолевых рационов частично реализуется через NF-кВ-ассоциированные сигнальные пути и активацию миРНК-21.
Заключение. Длительное использование пищевого рациона с высоким содержанием соли у крыс Wistar приводит к ремоделированию миокарда, не связанному с изменением уровня АД. При этом неблагоприятное воздействие высокого потребления соли на миокард опосредуется, в частности, постгеномными механизмами, а именно повышением уровней экспрессии NF-kB и миРНК-21.
Ключевые слова: высокосолевая диета; артериальное давление; ремоделирование миокарда; экспрессия микроРНК; нуклеарный фактор транскрипции кВ, крысы
The relationship between dietary sodium, hypertension, and cardiovascular injury is far from clear. One of the important links in this process can be microRNAs that have the ability to modulate gene expression at the post-transcriptional level. However, their role in this process has not been fully studied. In addition, further studies require the identification of structural changes in the myocardium in conditions of long-term consumption of a high-salt diet.
The aim of the study was to evaluate the expression levels of nuclear transcription factor кВ (NFkB), microRNA (miRNA)-21 and structural changes in the myocardium during long-term consumption of a diet containing 8% (high) sodium chloride in Wistar rats. Material and methods. 20 Wistar rats with initial body weight 280.5±42.7 g were divided into two equal groups. The high salt (HS) group received 8% NaCl in the diet, the control (NS) group received the standard diet (0.34% NaCl). After 4 months, systolic blood pressure was measured in rats using the cuff method on the tail; the myocardial mass index was assessed after dissection; histological and electron microscopic examination of the myocardium was performed, and the expression levels of miRNA-21 and NFkB in the myocardium were determined.
Results and discussion. Consumption of a diet high in sodium chloride for 4 months did not significantly affect the level of systolic blood pressure in normotensive Wistar rats, but led to an increase in myocardial mass index by 25.0% (p<0.05). In the HS group, hypertrophy of cardiomyocytes and an increase in the wall thickness of arterial vessels were revealed. The area of perivascular fibrosis in rats of the HS-group was almost 1.8 fold higher than in the NS-group. In animals of HS-group, the relative levels of expression of NFkB (more than 2 times) and miRNA-21 (almost 6 times) increased compared with the control. It can be assumed that the negative impact on the cardiovascular system of high-salt diets is partially realized through NFkB-associated signaling pathways and miRNA-21 activation.
Conclusion. In Wistar rats, long-term use of a high-salt diet results in myocardial remodeling that is not associated with changes in blood pressure. At the same time, the adverse effects of high salt intake on the myocardium are mediated, in particular, by postgenomic mechanisms, namely an increase in the expression levels of NFkB and microRNA-21.
Keywords: high-salt diet; blood pressure; myocardial remodeling; miRNA expression; nuclear transcription factor кВ; rats
Высокое содержание соли (ЫаС!) в пищевом рационе является одной из причин роста артериального давления (АД) и прогрессирования сердечно-сосудистых нарушений [1, 2]. В настоящее время существенно вырос интерес к изучению морфофункциональных изменений органов и тканей, в частности миокарда, при избыточном потреблении ЫаС!, которые развиваются независимо от динамики АД. Несмотря на большое количество проведенных клинических наблюдений и исследований на экспериментальных моделях, конкретные механизмы ремоделирования сосудов и миокарда остаются до
конца не ясными [3-5]. Первоначально считали, что основной механизм влияния высокосолевого рациона связан с задержкой воды, что приводит к росту АД [6]. Однако полученные в последние годы данные изменили традиционные представления о механизмах влияния высокосолевой диеты на миокард. Существует мнение, что ЫаС! может воздействовать непосредственно на органы, приводя, в частности, к ремоделиро-ванию сосудов микроциркуляторного русла. Кроме того, морфофункциональные изменения сосудов кожи также могут стать причиной роста АД, независимо от увели-
чения объема жидкости [3]. В то же время необходимо учитывать и сложные взаимосвязи между содержанием соли в рационе, уровнем АД и изменением структуры и функции кардиоваскулярной системы. Так, в литературе имеются сведения о негативном влиянии значительного ограничения потребления натрия на организм [5], что обусловлено важной ролью данного катиона в регуляции физиологических процессов [7].
В качестве механизмов негативного влияния избытка хлорида натрия на миокард и сосуды рассматривают: профибротический эффект, опосредованный гиперэкспрессией трансформирующего фактора роста р1 (TGF-P1) и провоспалительных цитокинов [8, 9]; эндоте-лиальную дисфункцию, вызванную нарушением образования оксида азота [10, 11], повышение продукции эндо-телина-1 [12]; ингибирование экспрессии рецепторов АТ2 [13]; повреждение гликокаликса и клеток эндотелия [14]. Возможно, значительная часть этих эффектов контролируется изменением экспрессии микроРНК (миРНК) [15, 16], представляющих собой некодирующие РНК и регулирующие экспрессию генов на посттранскрипционном уровне.
Известно, что миРНК играют значительную роль в различных биологических процессах, включая клеточный цикл, пролиферацию, апоптоз, и могут оказывать как протективное, так и повреждающее воздействие. Роль различных миРНК (в том числе и миРНК-21) в процессах ремоделирования миокарда на фоне большого поступления натрия с пищей остается практически не изученной.
Цель исследования - оценить уровни экспрессии нуклеарного фактора транскрипции кВ (NF-kB), миРНК-21 и структурные изменения в миокарде при длительном потреблении крысами Wistar рациона с высоким (8%) содержанием поваренной соли.
Материал и методы
Исследование выполнено на половозрелых самцах крыс стока Wistar с исходной массой тела 280,5± 42,7 г. Животные получены из Центра коллективного пользования «Биоколлекция» Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Все эксперименты проведены в соответствии с принципами Базельской декларации, одобрены этической комиссией ИФ РАН (№ 03/27 от 27 марта 2023 г.) и этическим комитетом ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России.
Для исследования крысы были распределены на 2 группы по 10 особей в каждой. Во время эксперимента животные получали лабораторный корм (28-30 г/сут), различающийся только по содержанию NaCl. Крысы 1-й группы потребляли корм с высоким содержанием соли (8% NaCl, HS-группа). Животные 2-й (контрольной, NS) группы - стандартный пищевой рацион (ПК-120-2 по ГОСТ Р34566-2019, АО «Гатчинский ККЗ», Россия), содержащий 0,34% NaCl. Фактическая потребляемость крысами высокосолевого корма значимо не отличалась
от потребляемости корма в контрольной группе. Доступ к воде был свободным. Крыс содержали по 5 особей в клетке при температуре воздуха в помещении 20-22 °C. Световой режим поддерживали в пределах 12 ч свет/12 ч темнота. Эксперимент длился 4 мес.
Перед началом эксперимента, а также за сутки до его окончания у бодрствующих животных измеряли систолическое артериальное давление (АД) манже-точным методом на хвосте, используя электроманометр (ELEMA, Швеция). Среднее трех последовательных измерений считали величиной АД. За несколько дней до выведения из эксперимента у крыс собирали суточную мочу, фиксировали ее объем. В образцах мочи и сыворотки крови, собранной во время выведения животных из эксперимента, определяли содержание натрия на биохимическом анализаторе Cobas E Mira (Roche Diagnostics GmbH, Германия).
После эвтаназии у крыс извлекали сердце, препарировали и рассчитывали индекс массы миокарда, мг/г) как отношение массы миокарда (мг) к массе крысы (г).
Для проведения электронно-микроскопических исследований фрагменты миокарда фиксировали в течение 4 ч в смеси 2,5% глутарового альдегида, 2% парафор-мальдегида на 0,1 M фосфатном буфере pH 7,4. Далее материал отмывали 0,1 М фосфатным буфером, фиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия на том же буфере в течение 1 ч и отмывали водой. Обработку фрагментов 2% ацетатом урана, обезвоживание в серии спиртов и ацетоне, пропитку эпоксидной смолой Epon EmBed проводили в автоматическом микроволновом тканевом процессоре для электронной микроскопии Leica EM AMW (Leica Microsystems GmbH, Германия). Срезы толщиной 60-70 нм изготавливали с помощью ультрамикротомов Leica EM UC6 и Leica EM UC7 и контрастировали последовательно 2% раствором ацетата урана и 3% раствором цитрата свинца. Срезы изучали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Jeol Jem 1400 (Jeol, Япония), оснащенного камерой Olympus-SIS Veleta.
Для гистологических исследований фрагменты миокарда каждого животного помещали в формалин (рН 7,4) на 24 ч при комнатной температуре (22 °С). После стандартной обработки фрагментов (обезвоживание и пропитка) из парафиновых блоков изготавливали серийные срезы толщиной 1,5-2 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, трихром по Массону. Выраженность морфологических изменений оценивали методом количественной морфометрии в программе «Видео ТесТ-Морфология 5.2» (ООО «Видеотест», Россия). В каждом препарате анализировали 10 полей зрения. Толщину кардиомиоцитов измеряли в микрометрах (окуляр х10 и объектив х40) на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. В каждом поле зрения выполняли не менее 20 измерений. Площадь фиброза в миокарде определяли на срезах, окрашенных по Массону (при окуляре х10, объективе х20).
Для определения относительного уровня экспрессии гена NFkB в миокарде тотальную РНК выделяли фенол-
CS
«-s
о -S
Щ to
S to
_ ^
га -SS E "p
cd о
^ Jb
4,5-, 43,532,521,510,5-
p<0,05
HS
NS
Рис. 1. Индекс массы миокарда крыс, получавших диету с высоким (HS, 8%) и нормальным (NS, 0,34%) содержанием соли
Fig. 1. Myocardial mass index of rats fed a diet with high (HS, 8%) and normal (NS, 0.34%) salt content
хлороформным методом с помощью набора «РИБО-золь-А» согласно прилагаемой методике («АмплиСенс», Россия). Приготовление «копийной» ДНК проводили с помощью реакции обратной транскрипции в модификации для рандомизированных олигопраймеров, с использованием обратной транскриптазы М-М^У. Реакцию амплификации и детекцию результатов проводили с использованием амплификатора детектирующего ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия). Для каждой пробы ставили по 2 раздельные реакции - для генов
NFkBp65 и GAPDH соответственно. Для ПЦР-анализа использовали реакционную смесь с интеркалирующим красителем SYBR GREEN. Последовательности используемых праймеров для определения относительного уровня экспрессии NFkB и GAPDH были следующие:
• NFkB p65F: 5-GTTCACAGACCTGGCATCC-3;
• NFkB p65R: -TGTCACTAGGCGAGTTATAGC-3;
• GAPD H-F: 5-TGGAAATCCCATCACCATCT-3;
• GAPD H-R: - GTCTTCTG G GTG G CAGTGAT-3.
МикроРНК-21 выделяли с помощью набора miRNeasy
Mini Kit (Qiagen, США). Реакцию обратной транскрипции для приготовления «копийной» ДНК проводили по технологии <^ет Loop» для исследуемой миРНК с использованием следующих праймеров: миРНК-21 - 5'-GTC GTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACTCAAC -3' и U6 - 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC GAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAA TATG-3' (рассматривали как ген сравнения). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в присутствии интеркали-рующего красителя ЕvaGrееn для реализации протокола учета результатов в режиме реального времени на амплификаторе DTLte-4 (ДНК-Технология, Россия). В ПЦР использовали следующие праймеры: миРНК-21 - 5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3' и U6 - 5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'.
При расчетах применяли полуколичественную оценку уровня экспрессии миРНК и NF-kB (в относительных единицах - ОЕ) по протоколу 2-AACt при лабораторном референте 0,09.
Статистическую обработку данных выполняли в пакете статистических программ Statistica 8. Данные представлены в виде средних значений и их стан-
0
А / А Б / B
Рис. 2. Микрофотографии миокарда крыс, получавших рацион с нормальным (A) и высоким (Б) содержанием соли. Окрашивание гематоксилином и эозином, х400
Fig. 2. Micrographs of the myocardium of rats fed a diet with normal (A) and high (B) salt content. Hematoxylin and eosin, х400
А / А
Рис. 3. Микрофотографии стенок сосудов и периваскулярного фиброза в миокарде крыс, получавших рацион с нормальным (A) и высоким (Б) содержанием соли. В - диаметр артерии (1) и толщина медии (2). Трихром по Массону, х400
Fig. 3. Micrographs of vessel walls and perivascular fibrosis in the myocardium of rats fed normal (A) and high (B) salt diets. C - the diameter of the artery (1) and the thickness of the media (2). Masson trichrome staining, х400
дартного отклонения (M±a). При проведении статистического анализа использовали f-критерий Стьюдента и тест Манна-Уитни. Различия считали значимыми при р<0,05.
Результаты
Избыточное количество NaCl (8%) в рационе крыс не оказало значимого влияния на массу тела животных (370,5±32,0 г в группе HS, 393,0±21,4 г в NS-группе, p>0,05) и систолическое АД у нормотензивных крыс Wistar. Так, в группе, получавшей высокосолевую диету, АД составляло в среднем 134,5±8,9 мм рт.ст., в контроле - 134,8±5,2 мм рт.ст. (p>0,05). Следует отметить, что в начале эксперимента также не выявлено значимых межгрупповых различий по данному показателю (129,1 ±7,1 и 122,4±8,3 мм рт.ст. соответственно). Суточное потребление воды у животных группы HS в среднем на 33% было выше, чем в контрольной группе,
В / C
возрастали также суточный диурез (10,5±5,7 против 5,7±2,9 мл в группе Ыв, р<0,001) и содержание натрия в моче (81,25±28,72 против 161,18±42,57 ммоль/л в группе Ыв, р<0,0001). По содержанию натрия в сыворотке крови животных различий между группами на данном сроке эксперимента (4 мес) не наблюдалось (группа Ыв - 146,2±3,9 ммоль/л, группа Нв - 144,8±2,6 ммоль/л, р>0,05). Однако у животных, получавших высокосолевой рацион, отмечено увеличение индекса массы миокарда (рис. 1).
Морфологическое исследование миокарда показало, что по сравнению с контрольной группой у животных, получавших рацион с высоким содержанием соли, были выявлены гипертрофия кардиомиоцитов (рис. 2, см. таблицу), потеря поперечной исчерченности, белковая дистрофия, умеренный межмышечный отек. В миокарде крыс данной группы наблюдались также периваскулярный фиброз и увеличение толщины стенки артерий за счет гипертрофии гладкомышечных клеток (рис. 3). Проведенный морфометрический анализ
Морфологические показатели миокарда крыс, получавших рацион с нормальным или высоким содержанием соли (M±a) Morphological parameters of the myocardium of rats fed a diet with normal or high salt content (M±a)
Показатель Indicator Группа животных / Group of animals p
NS (0,34% NaCl) HS (8% NaCl)
Толщина кардиомиоцитов, мкм /Thickness of cardiomyocytes, ¡rm 12,97±1,53 20,28±1,90 <0,001
Площадь периваскулярного фиброза, мкм2 / Perivascular fibrosis area, ¡rm2 8426,0±3012,2 14876±3803,7 <0,03
Толщина стенок сосудов, мкм / Vessel wall thickness, ¡rm 20,42±3,53 27,61 ±4,93 <0,01
В / C Г / D
Рис. 4. Репрезентативные микрофотографии ультраструктуры кардиомиоцитов крыс, получавших рацион с нормальным (А, Б) и высоким (В, Г) содержанием соли (электронная микроскопия, х3600)
М - митохондрии, стрелками отмечена дезинтеграция миофибрилл.
Fig. 4. Representative micrographs of the ultrastructure of cardiomyocytes in rats fed a diet with normal (A, B) and high (C, D) salt content (electron microscopy, х3600)
M - mitochondria, disintegration of myofibrils is marked with arrows.
показал, что площадь периваскулярного фиброза у крыс, получавших высокосолевой рацион, была почти в 1,8 раза выше, чем у животных, потреблявших стандартный корм (см. таблицу).
Электронно-микроскопические исследования выявили у крыс, потреблявших диету с содержанием соли
8%, набухание кардиомиоцитов с образованием вакуолей, содержащих электронно плотные включения, фестончатость сарколеммы (рис. 4В). В данной экспериментальной группе отмечены также признаки дезинтеграции (чередование тонких и толстых участков) и нарушения укладки миофибрилл. В миокарде крыс
0,18-, 0,160,140,120,1 -0,080,060,040,020-
р<0,001
HS
NS
60 50
40
G
=|
? 30
)
^ 20-1
<N §
о: р
ш о_
10-
р<0,001
HS
NS
Рис. 5. Относительный уровень экспрессии нуклеарного фактора транскрипции кВ в миокарде крыс, получавших рацион с нормальным (NS) или высоким (HS) содержанием соли
Fig. 5. Relative level of expression of nuclear transcription factor к В in the myocardium rats, fed normal (NS) or high (HS) salt diets
Рис. 6. Относительный уровень экспрессии микроРНК-21 в миокарде крыс, получавших рацион с нормальным (NS) или высоким (HS) содержанием соли
Fig. 6. Relative level of expression of microRNA-21 in the myocardium rats, fed normal (NS) or high (HS) salt diets
0
контрольной группы миофибриллы лежат параллельно (рис. 4А, Б). В миокарде животных, получавших высокосолевой рацион, они располагаются рыхло и волнообразно (см. рис. 4В, Г).
В миокарде крыс, потреблявших рацион с высоким содержанием натрия, были отмечены не только структурные, но и постгеномные изменения. У животных данной группы существенно повышались относительные уровни экспрессии ЫР-кВ (более чем в 2 раза; рис. 5) и миРНК-21 (почти в 6 раз; рис. 6) по сравнению с соответствующими показателями контрольных крыс.
Обсуждение
Результаты исследования на нормотензивных крысах Wistar показали, что достаточно длительное (4 мес) потребление рациона с 8% содержанием соли не оказывало гипертензивного влияния, уровень АД значимо не отличался от показателя контрольных животных. Данный факт характерен не только для крыс, ранее он подтвержден нами для яванских макак [17, 18]. Кроме того, представленные данные согласуются с нашими результатами, полученными на гипертензивных крысах линии вНЯ [19], а также с данными литературы [20]. Вероятно, сольрезистентность может встречаться и у других видов животных, а также человека. В то же время в настоящем исследовании высокое потребление поваренной соли сопровождается ремодели-рованием миокарда. В частности, у животных группы Нв были отмечены как увеличение индекса массы миокарда, так и структурные изменения в миокарде (периваскулярный фиброз, гипертрофия кардиоми-оцитов). Вероятно, ремоделирование миокарда на данном сроке эксперимента связано с вовлечением различных постгеномных механизмов, в том числе ЫР-кВ-ассоциированных сигнальных путей, о чем сви-
детельствует увеличение относительного уровня экспрессии гена NFкB в миокарде у крыс, получавших высокосолевую диету. Интересно, что повышение экспрессии гена NFкB происходит не только в миокарде, но и в других тканях. Например, активация экспрессии NFкB была выявлена нами ранее в почках как крыс Wistar, так и спонтанно гипертензивных крыс линии вНЯ, получавших 2 мес рацион с высоким (8%) содержанием соли [21].
В последние годы активно обсуждается участие некоторых миРНК в патофизиологических процессах. В литературе имеются данные о том, что миРНК могут модулировать различные этапы развития фиброза [22]. В частности, это относится и к миРНК-21, которая в настоящее время наиболее изучена. Свое действие она оказывает через сигнальные пути TGР-p1/вmad, усиливая индуцированный TGР-p1 эпителиально-мезенхимальный переход, т.е. способствуя повышению уровня а-гладкомышечного актина и снижению уровня Е-кадгерина вследствие ингибирования сигнального пути smad7/p-smad7 и дальнейшей непрямой стимуляции smad3/p-smad3 [23]. Следует отметить, что данный механизм является ведущим в активации процессов развития фиброза во многих тканях и органах, в частности в миокарде [24-26]. На данном сроке эксперимента в нашем исследовании у крыс группы Нв уровень экспрессии миРНК-21 в миокарде был значительно выше, чем у крыс контрольной группы. Возможно, что и в условиях высокосолевого рациона данная миРНК принимает участие в ремоделировании миокарда. Следует иметь в виду, что миРНК-21, кроме своего профибротического действия, оказывает влияние на пролиферацию клеток различных тканей, вызывает воспаление, ангиогенез, способствует повреждению иммунной системы. Можно также предположить, что ЫР-кВ опосредует активацию миРНК-21 в миокарде при высоком потреблении соли по ана-
логии с окислительным стрессом [27]. Показано, что миРНК-21 участвует в формировании фиброза в почках, при этом у пациентов с нарушением функции почек отмечается увеличение ее уровня экспрессии в плазме крови [28].
Таким образом, полученные результаты можно рассматривать как подтверждение гипотезы о том, что высокое потребление натрия хлорида с пищей приводит к ремоделированию миокарда, не связанному с повышением АД. Не исключено, что при избыточном потреблении соли изменяется также структура сосудов в миокарде, что может усиливать нарушение функции сердца. В данный момент этот вопрос остается открытым. Для его решения необходимы дальнейшие исследования, в том числе на молекулярно-генетическом уровне.
Сведения об авторах
Заключение
Длительное использование рациона с высоким содержанием соли у нормотензивных крыс приводит к ремо-делированию миокарда, не связанному с изменением АД. При этом неблагоприятное воздействие высокого потребления соли на миокард опосредуется, в частности, постгеномными механизмами, а именно повышением уровней экспрессии NF-kB и миРНК-21. Таким образом, полученные результаты показывают, что организм крыс Wistar некоторое время способен поддерживать нормальный уровень АД при высоком потреблении NaCl, а изменения экспрессии миРНК-21 и NF-kB в миокарде в условиях данного эксперимента независимы от уровня АД.
Береснева Ольга Николаевна (Olga N. Beresneva) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической физиологии почек НИИ нефрологии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: beresnevaolga@list.ru https://orcid.org/0000-0002-7532-2405
Парастаева Марина Магрезовна (Marina M. Parastaeva) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической физиологии почек НИИ нефрологии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: marina_parastaeva@list.ru https://orcid.org/0000-0002-4526-8671
Иванова Галина Тажимовна (Galina T. Ivanova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии сердечно-сосудистой и лимфатической систем ИФ РАН (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: ivanovagt@infran.ru https://orcid.org/0000-0003-0188-5173
Зарайский Михаил Игоревич (Mikhail I. Zaraiskii) - доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: mzaraiski@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-7605-4369
Богданова Евдокия Олеговна (Evdokia O. Bogdanova) - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биохимического гомеостаза НИИ нефрологии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: eudokiabogdanova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-1969-1959
Огнев Олег Геннадьевич (Oleg G. Ognev) - доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой прикладная механика, физика и инженерная графика ФГБОУ ВО СПбГАУ (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: ognew.og@mail.ru https://orcid.org/0009-0004-0843-7597
Иванова Александра Николаевна (Alexandra N. Ivanova) - специалист ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» научного парка СПбГУ (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: alyx@bk.ru
https://orcid.org/0000-0002-7034-0962
Кучер Анатолий Григорьевич (Anatoly G. Kucher) - доктор медицинских наук, профессор кафедры пропедевтики внутренних болезней ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация)
E-mail: prof.kucher@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-5616-3488
Литература
1. Kurtz T.W., Pravenec M., DiCarlo S.E. Mechanism-based strategies to 2. Ertuglu L.A., Elijovich F., Laffer C.L., Kirabo A. Salt-sensitivity of prevent salt sensitivity and salt-induced hypertension // Clin. Sci. (Lond.). blood pressure and insulin resistance // Front. Physiol. 2021. Vol. 12.
2022. Vol. 136, N 8. P. 599-620. DOI: https://doi.org/10.1042/CS20210566 Article ID 793924. DOI: https://doi.org/10.3389/fphys.2021.793924
3. Kanbay M., Chen Y., Solak P., Sanders P.W. Mechanisms and consequences of salt sensitivity and dietary salt intake // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2011. Vol. 20, N 1. P. 37-43. DOI: https://doi.org/10.1097/ 17. MNH.0b013e32834122f1
4. Mishra S., Ingole S., Jain R. Salt sensitivity and its implication in clinical practice // Indian Heart J. 2018. Vol. 70, N 4. P. 556-564. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.ihj.2017.10.006
5. Mente A., O'Donnell M., Yusuf S. Sodium intake and health: what should we recommend based on the current evidence? // Nutrients. 2021. 18. Vol. 13, N 9. P. 3232. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13093232
6. Maaliki D., Itani M.M., Itani H.A. Pathophysiology and genetics of salt-sensitive hypertension // Front. Physiol. 2022. Vol. 13. Article ID 1001434. DOI: https://doi.org/10.3389/fphys.2022.1001434
7. O'Donnell M., Mente A., Alderman M.H., Brady A.J.B., Diaz R., 19. Gupta R. et al. Salt and cardiovascular disease: insufficient evidence
to recommend low sodium intake // Eur. Heart J. 2020. Vol. 41, N 35. P. 3363-3373. DOI: https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehaa586
8. Li K., Song H., Wei F., Liu D., Zhao Y., Yin H. et al. High salt 20. intake damages myocardial viability and induces cardiac remodeling via chronic inflammation in the elderly // Front. Cardiovasc. Med. 2022. Vol. 9. Article ID 95269. DOI: https://doi.org/10.3389/ fcvm.2022.952691
9. Namai-Takahashi A., Sakuyama A., Nakamura T., Miura T., Takaha- 21. shi J., Kurosawa R. et al. Xanthine oxidase inhibitor, febuxostat ameliorates the high salt intake-induced cardiac hypertrophy and fibrosis
in Dahl Salt-Sensitive rats // Am. J. Hypertens. 2019. Vol. 32, N 1. P. 26-33. DOI: https://doi.org/10.1093/ajh/hpy143
10. Li J., White J., Guo L., Zhao X., Wang J., Smart E.J. et al. Salt inactivates endothelial nitric oxide synthase in endothelial cells // 22. J. Nutr. 2009. Vol. 139, N 3. P. 447-451. DOI: https://doi.org/10.3945/ jn.108.097451
11. Li Y., Wu X., Mao Y., Liu C., Wu Y., Tang J. et al. Nitric oxide alleviated 23. high salt-induced cardiomyocyte apoptosis and autophagy independent
of blood pressure in rats // Front. Cell Dev. Biol. 2021. Vol. 9. Article ID 646575. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2021.646575
12. Xiao H., Lu H., Xue Y., Jia Z., Dai M., He K., Zhao R. Deleterious effect in endothelin receptor-mediated coronary artery smooth 24. muscle contractility in high-salt diet rats // Nutr. Metab. Cardiovasc.
Dis. 2023. Vol. 33, N 1. P. 234-244. DOI: https://doi.org/10.1016/j. numecd.2022.10.010
13. Gonzalez M., Lobos L., Castillo F., Galleguillos L., Lopez N.C., 25. Michea L. High-salt diet inhibits expression of angiotensin type 2 receptor in resistance arteries // Hypertension. 2005. Vol. 45, N 5.
P. 853-859. DOI: https://doi.org/10.1161/01.HYP.0000161990.98383.ad
14. Patik J.C., Lennon S.L., Farquhar W.B., Edwards D.G. Mechanisms 26. of dietary sodium-induced impairments in endothelial function and potential countermeasure // Nutrients. 2021. Vol. 13, N 1. P. 270. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13010270
15. Zhu Q., Hu J., Wang L., Wang W., Wang Z., Li P.L. et al. Overexpression 27. of MicroRNA-429 transgene into the renal medulla attenuated saltsensitive hypertension in Dahl S rats // Am. J. Hypertens. 2021. Vol. 34,
N 10. P. 1071-1077. DOI: https://doi.org/10.1093/ajh/hpab089
16. Improta-Caria A.C., Aras M.G., Nascimento L., De Sousa R.A.L., 28. Aras-Júnior R., Souza B.S. MicroRNAs regulating renin-angio-tensin-aldosterone system, sympathetic nervous system and left ventricular hypertrophy in systemic arterial hypertension // Biomol-
ecules. 2021. Vol. 11, N 12. P. 1771. DOI: https://doi.org/10.3390/ biom11121771
Орлов С.В., Береснева О.Н., Зарайский М.И., Карал-Оглы Д.Д., Парастаева М.М., Иванова Г.Т. и др. Изменения экспрессии микроРНК в моче яванских макак (Macaca fascicularis) при высоком потреблении поваренной соли // Вопросы питания.
2021. Т. 90, № 4. С. 94-102. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-94-102
Kulikov A.N., Beresneva O.N., Ivanova G.T., Parastaeva M.M., Bogda-nova E.O., Kayukov I.G. et al. Cardioprotective effect of soy protein on a high-salt diet in cynomolgus monkeys // J. Evolut. Biochem. Physiol. 2023. Vol. 59. P. 969-981. DOI: https://doi.org/10.1134/S00220 93023030286
Парастаева М.М., Береснева О.Н., Иванова Г.Т., Швед Н.В., Кучер А.Г., Зубина И.М. и др. Артериальная гипертензия и потребление соли: вклад в ремоделирование сердца // Нефрология. 2016. Т. 20, № 5. С. 97-105.
Grigorova Y.N., Wei W., Petrashevskaya N., Zernetkina V., Ju-hasz O., Fenner R. et al. Dietary sodium restriction reduces arterial stiffness, vascular TGF-ß-dependent fibrosis and marinobufagenin in young normotensive rats // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19, N 10. P. 3168. DOI: https://doi.org:10.3390/ijms19103168
Beresneva O., Parastaeva M., Ivanova G., Zaraiski M., Khasun M., Kucher A. et al. Change in the level of NFkBP65 gene expression in the myocardium and kidneys of Wistar rats and spontaneously hypertensive rats (SHR) that received diet rich in NaCl // Nephrol. Dial. Transplant.
2022. Vol. 37, suppl. 3. P. i134. DOI: https://doi.org/10.1093/ndt/ gfac066.099
Mirzaei H., Ferns G.A., Avan A., Mobarhan M.G. Cytokines and MicroRNA in coronary artery disease // Adv. Clin. Chem. 2017. Vol. 82. P. 47-70. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.acc.2017.06.004 Wang J.Y., Gao Y.B., Zhang N., Wang P., Zhu Z.Y., Li J.Y. et al. MicroRNA-21 overexpression enhances TGF-ß1-induced epithelial-to-mesenchymal transition by target smad7 and aggravates renal damage in diabetic nephropathy // Mol. Cell. Endocrinol. 2014. Vol. 392, N 1-2. P. 163-172. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mce.2014.05.018 Yuan J., Chen H., Ge D., Xu Y., Xu H., Yang Y. et al. Mir-21 promotes cardiac fibrosis after myocardial infarction via targeting Smad7 // Cell Physiol. Biochem. 2017. Vol. 42, N 6. P. 2207-2219. DOI: https://doi. org/10.1159/000479995
Loboda A., Sobczak M., Jozkowicz A., Dulak J. TGF-ß1/Smads and miR-21 in renal fibrosis and inflammation // Mediators Inflamm. 2016. Vol. 2016. Article ID 8319283. DOI: https://doi. org/10.1155/2016/8319283
Zhong X., Chung A.C., Chen H.Y., Meng X.M., Lan H.Y. Smad3-medi-ated upregulation of miR-21 promotes renal fibrosis // J. Am. Soc. Nephrol. 2011. Vol. 22, N 9. P. 1668-1681. DOI: https://doi.org/10.1681/ ASN.2010111168
Wei С., Li L., Kim I.K, Sun P., Gupta S. NF-zB mediated miR-21 regulation in cardiomyocytes apoptosis under oxidative stress // Free Radic. Res. 2014. Vol. 48, N 3. P. 282-291. DOI: https://doi.org/10.3109/10715 762.2013.865839
Fouad M., Salem I., Elhefnawy K., Raafat N., Faisal A. MicroRNA-21 as an early marker of nephropathy in patients with type 1 diabetes // Indian J. Nephrol. 2020. Vol. 30, N 1. P. 21-22. DOI: https://doi. org/10.4103/ij n.UN_80_19
References
Kurtz T.W., Pravenec M., DiCarlo S.E. Mechanism-based strategies to prevent salt sensitivity and salt-induced hypertension. Clin Sci (Lond). 2022; 136 (8): 599-620. DOI: https://doi.org/10.1042/CS20210566 Ertuglu L.A., Elijovich F., Laffer C.L., Kirabo A. Salt-sensitivity of blood pressure and insulin resistance. Front Physiol. 2021; 12: 793924. DOI: https://doi.org/10.3389/fphys.2021.793924 Kanbay M., Chen Y., Solak P., Sanders P.W. Mechanisms and consequences of salt sensitivity and dietary salt intake. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2011; 20 (1): 37-43. DOI: https://doi.org/10.1097/ MNH.0b013e32834122f1
Mishra S., Ingole S., Jain R. Salt sensitivity and its implication in clinical practice. Indian Heart J. 2018; 70 (4): 556-64. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ihj.2017.10.006
Mente A., O'Donnell M., Yusuf S. Sodium intake and health: what should we recommend based on the current evidence? Nutrients. 2021; 13 (9): 3232. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13093232 Maaliki D., Itani M.M., Itani H.A. Pathophysiology and genetics of saltsensitive hypertension. Front Physiol. 2022; 13: 1001434. DOI: https:// doi.org/10.3389/fphys.2022.1001434
O'Donnell M., Mente A., Alderman M.H., Brady A.J.B., Diaz R., Gupta R., et al. Salt and cardiovascular disease: insufficient evidence
to recommend low sodium intake. Eur Heart J. 2020; 41 (35): 3363-73. DOI: https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehaa586 Li K., Song H., Wei F., Liu D., Zhao Y., Yin H., et al. High salt intake damages myocardial viability and induces cardiac remodeling via chronic inflammation in the elderly. Front Cardiovasc Med. 2022; 9: 95269. DOI: https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.952691 Namai-Takahashi A., Sakuyama A., Nakamura T., Miura T., Taka-hashi J., Kurosawa R., et al. Xanthine oxidase inhibitor, febuxostat ameliorates the high salt intake-induced cardiac hypertrophy and fibrosis in Dahl Salt-Sensitive rats. Am J Hypertens. 2019; 32 (1): 26-33. DOI: https://doi.org/10.1093/ajh/hpy143
Li J., White J., Guo L., Zhao X., Wang J., Smart E.J., et al. Salt inactivates endothelial nitric oxide synthase in endothelial cells. J Nutr. 2009; 139 (3): 447-51. DOI: https://doi.org/10.3945/jn.108.097451 Li Y., Wu X., Mao Y., Liu C., Wu Y., Tang J., et al. Nitric oxide alleviated high salt-induced cardiomyocyte apoptosis and autophagy independent of blood pressure in rats. Front Cell Dev Biol. 2021; 9: 646575. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2021.646575
Xiao H., Lu H., Xue Y., Jia Z., Dai M., He K., Zhao R. Deleterious effect in endothelin receptor-mediated coronary artery smooth muscle contractility in high-salt diet rats. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2023; 33 (1): 234-44. DOI: https://doi.org/10.1016/j.numecd.2022.10.010
8
2
9
4
6
7.
13. Gonzalez M., Lobos L., Castillo F., Galleguillos L., Lopez N.C., Michea L. High-salt diet inhibits expression of angiotensin type 2 receptor in resistance arteries. Hypertension. 2005; 45 (5): 853—859. 21. DOI: https://doi.org/10.1161/01.HYP.0000161990.98383.ad
14. Patik J.C., Lennon S.L., Farquhar W.B., Edwards D.G. Mechanisms of dietary sodium-induced impairments in endothelial function and potential countermeasure. Nutrients. 2021; 13 (1): 270. DOI: https://doi. org/10.3390/nu13010270
15. Zhu Q., Hu J., Wang L., Wang W., Wang Z., Li P.L., et al. Overexpres- 22. sion of MicroRNA-429 transgene into the renal medulla attenuated
salt-sensitive hypertension in Dahl S rats. Am J Hypertens. 2021; 34 (10): 1071-7. DOI: https://doi.org/10.1093/ajh/hpab089 23.
16. Improta-Caria A.C., Aras M.G., Nascimento L., De Sousa R.A.L., Aras-Júnior R., Souza B.S. MicroRNAs regulating renin-angiotensin-aldosterone system, sympathetic nervous system and left ventricular hypertrophy in systemic arterial hypertension. Biomolecules. 2021;
11 (12): 1771. DOI: https://doi.org/10.3390/biom11121771 24.
17. Orlov S.V., Beresneva O.N., Zaraysky M.I., Karal-Ogly D.D., Paras-taeva M.M., Ivanova G.T., et al. Urinary miRNA expression in cyno-molgus macaques (Macaca fascicularis) fed high salt rations. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (4): 94-102. DOI: https://doi. 25. org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-94-102 (in Russian)
18. Kulikov A.N., Beresneva O.N., Ivanova G.T., Parastaeva M.M., Bogda-nova E.O., Kayukov I.G., et al. Cardioprotective effect of soy protein 26. on a high-salt diet in cynomolgus monkeys. J Evolut Biochem Physiol. 2023; 59: 969-81. DOI: https://doi.org/10.1134/S0022093023030286
19. Parastaeva M.M., Beresneva O.N., Ivanova G.T., Shwed N.V., Ku- 27. cher A.G., Zubina I.M., et al. Arterial hypertension and salt intake: contribution to cardiac remodeling. Nefrologiya [Nephrology]. 2016;
20 (5): 97-105. (in Russian)
20. Grigorova Y.N., Wei W., Petrashevskaya N., Zernetkina V., Juhasz O., 28. Fenner R., et al. Dietary sodium restriction reduces arterial stiffness, vascular TGF-ß-dependent fibrosis and marinobufagenin in young
normotensive rats. Int J Mol Sci. 2018; 19 (10): 3168. DOI: https://doi. org:10.3390/ijms19103168
Beresneva O., Parastaeva M., Ivanova G., Zaraiski M., Khasun M., Kucher A., et al. Change in the level of NFkBP65 gene expression in the myocardium and kidneys of Wistar rats and spontaneously hypertensive rats (SHR) that received diet rich in NaCl. Nephrol Dial Transplant. 2022; 37 (suppl 3): i134. DOI: https://doi.org/10.1093/ndt/ gfac066.099
Mirzaei H., Ferns G.A., Avan A., Mobarhan M.G. Cytokines and
MicroRNA in coronary artery disease. Adv Clin Chem. 2017; 82: 47—70.
DOI: https://doi.org/10.1016/bs.acc.2017.06.004
Wang J.Y., Gao Y.B., Zhang N., Wang P., Zhu Z.Y., Li J.Y.,
et al. MicroRNA-21 overexpression enhances TGF-ß1-induced epithe-
lial-to-mesenchymal transition by target smad7 and aggravates renal
damage in diabetic nephropathy. Mol Cell Endocrinol. 2014; 392 (1—2):
163-72. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mce.2014.05.018
Yuan J., Chen H., Ge D., Xu Y., Xu H., Yang Y., et al. Mir-21
promotes cardiac fibrosis after myocardial infarction via targeting
Smad7. Cell Physiol Biochem. 2017; 42 (6): 2207-19. DOI: https://doi.
org/10.1159/000479995
Loboda A., Sobczak M., Jozkowicz A., Dulak J. TGF-ß1/Smads and miR-21 in renal fibrosis and inflammation. Mediators Inflamm. 2016; 2016: 8319283. DOI: https://doi.org/10.1155/2016/8319283 Zhong X., Chung A.C., Chen H.Y., Meng X.M., Lan H.Y. Smad3-medi-ated upregulation of miR-21 promotes renal fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2011; 22 (9): 1668-81. DOI: https://doi.org/10.1681/ASN.2010111168 Wei C., Li L., Kim I.K, Sun P., Gupta S. NF-^B mediated miR-21 regulation in cardiomyocytes apoptosis under oxidative stress. Free Radic Res. 2014; 48 (3): 282-91. DOI: https://doi.org/10.3109/10715762.2013. 865839
Fouad M., Salem I., Elhefnawy K., Raafat N., Faisal A. MicroRNA-21 as an early marker of nephropathy in patients with type 1 diabetes. Indian J Nephrol. 2020; 30 (1): 21-2. DOI: https://doi.org/10.4103/ij n.IJN_80_19
