Последствия ишемии головного мозга на фоне введения Перфторана у гипертензивных крыс SHR Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ПОСЛЕДСТВИЯ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ ПЕРФТОРАНА У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС SHR

© Туховская Е.А.*

Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина иЮ.А. Овчинникова РАН, г. Пущино

Исследовали нейропротекторную активность кровезаменителя с функцией переноса кислорода Перфторана на модели глобальной ишемии головного мозга у спонтанно гипертензивных крыс SHR. Глобальную ишемию продуцировали окклюзией обеих сонных артерий. Перфторан, введенный крысам SHR внутривенно в объеме 20 % от ОЦК в период острой ишемии головного мозга. Изучали поведенческие функции и морфологию наиболее чувствительных к ишемии нейронов CA1 области гиппокампа по истечении 6 суток. Было установлено, что Пер-фторан оказывает протекторное действие на отделы головного мозга, ответственные за поведение, двигательную активность и увеличивает вероятность сохранения функций головного мозга после ишемической атаки, а также сохраняет целостность пирамидальных нейронов СА-1 области гиппокампа, наиболее чувствительных к гипоксии.

Известно, что при реперфузии головного мозга после окклюзирующих событий возникают поэтапные нарушения перфузии церебральной ткани: гиперемия и, затем, постишемическая гипоперфузия. Чем длительнее до-репер фузионный период, тем выше риск дополнительного реперфузионно-го повреждения церебральной ткани: оксидантного, обусловленного включением кислорода в свободнорадикальное окисление, и осмотического, вызванного нарастанием цитотоксического отека [5, 6]. Гемодилюция является одним из наиболее известных и исторических методов увеличения церебральной перфузии. При ишемическом инсульте гемодилюция способствует улучшению мозгового кровотока как в пораженном, так и в кон-тралатеральных полушариях. Перфторан является кровезаменителем с газотранспортной функцией. Показаниями к применению Перфторана являются гиповолемия, нарушения микроциркуляции, противоишемиче-ская защита органов, отключаемых временно от кровотока или предназначенных к трансплантации и т.д. [2]. Как было показано в ряде исследований [1, 4], он оказывает противоишемическое действие даже в небольших дозах. В плановой терапии Перфторан получил распространение при лечении окклюзии дистальных отделов сосудов нижних конечностей, диабе-

* Научный сотрудник, кандидат фармацевтических наук.

тической ангиопатии. хронических язв желудочно-кишечного тракта, конечностей, гнойных обширных ран, постгипоксических энцефалопатий, в аппаратах для искусственного кровообращения, при гипо- и гипертермии.

Возможность применения Перфторана, как переносчика кислорода к ишемизированным тканям, в качестве агента, частично восстанавливающего энергетический баланс церебральной ткани, определило цель нашего исследования: оценить защитные эффекты Перфторана на последствия ишемии головного мозга у гипертензивных крыс SHR.

Эксперименты были выполнены на бодрствующих самцах гипертензивных крыс SHR (возраст 3-4 месяца). Животные делились на три группы: опытная группа, получающая Перфторан на фоне ишемии (группа Перфторан), n = 7; опытная группа, подвергающаяся ишемии, получающая 0,9 % NaCl (группа Контроль); n = 7; итактные (ложнооперирован-ные) животные (интактная группа), n = 6.

Животным всех трех групп за сутки до эксперимента имплантировали венозный катетер в яремную вену и окклюдеры на общий ствол правой и левой сонных артерий. Имплантацию катетера и окклюдеров осуществляли под общим наркозом. Через 24 часа на бодрствующих животных 1 и 2 групп проводилась окклюзия сонных артерий путем их пережатия. Одновременно с окклюзией животным из группы Перфторан вводился Перфторан, а контрольной группе - физиологический раствор через катетер, имплантированный в яремную вену в объеме 20 % от ОЦК со скоростью 5 мл/час. Через 12 минут проводили реперфузию. Ложнооперированные животные не подвергались процедуре окклюзии-реперфузии. Затем животные оставлялись на 5 суток в стандартных условиях содержания.

На 6-сутки после окклюзии у животных всех трех групп оценивали основные рефлексы - зрачковый (сужение зрачка в ответ на световой раздражитель), ушной (отдергивание ушной раковины в ответ на прикосновение к ней с внутренней стороны стержнем от ручки), реакция на звук и прикосновение (прикосновение к боку животного), сгибание конечностей и разгибание конечностей. Проявление и выраженность признаков оценивали по бальной системе (от 1 до 5), при этом проявление таких признаков как реакция на свет, ответ на прикосновение, а также сгибание и разгибание конечностей оценивали в 1 балл.

Оценка болевой чувствительности в проводилась с помощью прибора Hot Plate Analgesia Meter (Columbus Instruments, USA). Животные помещались на термостатируемую поверхность прибора нагретого до 55 °С. Отмечалось латентное время облизывания передних и задних лап, а также латентное время подпрыгиваний.

Анализ локомоторной активности осуществляли с помощью актомет-ра Opto-Varimex ATM3 AutoSystem. При испытании животное помещали в центр и в течении трех минут регистрировалось пройденное расстояние и количество стоек животного.

Уровень тревожности оценивали в тесте «Крестообразный приподнятый лабиринт» - наблюдали за поведением животных на приподнятой установке, состоящей из крестообразно расходящихся от центральной площадки под прямым углом 4-х рукавов: два противоположных, открытых, без стенок и два закрытых, темных. В течение 5 минут регистрировали время пребывания животных в открытых, закрытых рукавах, а также на центральной площадке, количество заходов в открытые и закрытые рукава [3].

После проведения поведенческих тестов взвешивали и эвтаназировали в С02-камере.

Манипуляционное тестирование выявило у контрольных животных значимую разницу в реакции на световой раздражитель (рис. 1), в наличии разгибательного рефлекса (рис. 2), в визуальном восприятии (рис. 3), и в реакции на прикосновение к ушной раковине (рис. 4) по сравнении с интакт-ной группой и группой Перфторан. Ослабленный рефлекторный ответ у животных в группе Контроль свидетельствует о том, что периферические нейроны, вовлеченные в тестируемый рефлекс возможно повреждены.

1,5 1

к

щ

0,5

0

контроль Перфторан интактные

1

_ 0,8 = 0.6 ю о,*

о,: о

Рис. 2. Разгибательный рефлекс

При оценке других неврологических показателей (реакции на резкий звук, наличии сгибательного рефлекса и ответа на прикосновение к туловищу) не выявилось достоверно различимой разницы в показателях между контрольной группой, группой, получавшей Перфторан и интактными животными.

Рис. 1. Зрачковый рефлекс

контроль Перфторан интактные

Локомоторная активность, изученная с помощью автоматического акто-метра Орй-Уаптех АТМ3 Аио8у81ет, не выявила различий ме^ду показателями у животных всех групп, а лишь определила тенденции к повышенной двигательной активности животных, получавших Перфторан по сравнению с контрольными животными. Локомоторная активность является отражением функционированием комплекса сенсорных модальностей, нервно-мышечных рефлексов и ЦНС. Увеличение двигательной активности животных служит показателем нейропротективного действия Перфторана. в 5 4

3 з 2 1 О

контроль Перфторан IIIГ11К ГНЫ'"

Рис. 3. Визуальное восприятие

_ 0,8 д

10 0.4 0

контроль Перфторан интактные

Рис. 4. Ушной рефлекс

Примечание: На рис. 1-4 * - достоверно значимые отличия показателей относительно контрольной труппы по АЫОУА-1 (Р < 0.05).

Анализ тревожности в крестовидном приподнятом лабиринте показал увеличение времени груминга в группе Перфторан. Это говорит о повышенном эмоциональном фоне животных по сравнению с контрольной группой и интактными животными (рис. 5).

контроль Перфторан интактные

Рис. 5. Время груминга в крестовидном приподнятом лабиринте

Примечание: * - достоверно значимые отличия показателей относительно контрольной труппы по АЫОУА-1 (Р < 0.05).

Такие показатели как время пребывания в открытых рукавах и загля-дывание вниз во всех групп достоверно не отличались. Но также наблюдалась тенденция к увеличению времени пребывания в открытых рукавах и заглядывании вниз у животных группы Перфторан, что отражает снижение уровня тревожности. Анализ болевой чувствительности в тесте Hot Plate выявил увеличение латентного времени облизывания передних лап и подпрыгивания в контрольной группе по сравнению с интактной группой и группой Перфторан (рис. 6). То есть Перфторан способствовал сохранности ноцицептивных реакций.

о о ли ] ы в а ни е п е редн их ла п о олп з ыв а ни е з адн их лап, прыжок

Рис. 6. Изменение показателей болевой чувствительности в тесте Hot Plate

Примечание: * - достоверно значимые отличия показателей относительно контрольной труппы по ANOVA-1 (Р < 0.05).

Перед эвтаназией всех животных взвесили и обнаружили, что потеря массы от исходной животных контрольной группы составила 17%, тогда как дефицит массы в группе Перфторан составил лишь 10% (рис.7). У интактных животных снижение веса не наблюдали.

Рис. 7. Потеря в массе от исходной, в %

Примечание:

достоверно значимые отличия показателей относительно контрольной труппы по ANOVA-1 (Р < 0.05).

Влияние Перфторана на морфологию клеток СА1 зоны гиппокампа.

Анализ гистологических срезов, проведенный на 6-сутки после билатеральной окклюзии общих стволов сонных артерий, показал, что Перфторан может сохранять целостность пирамидальных нейронов СА1 зоны гиппокампа. Подтверждением этого явились особенности морфологической картины в группе, получавшей препарат (рис. 86). В сравнении с кон-

трольными животными, у которых нейроны подвергались некрозу с пик-нозом ядер и превращением в клетки-тени (рис. 8а), воспалительных реакций у животных, получивших Перфторан на фоне ишемии головного мозга, не наблюдалось.

ч „ б) группа Перфторан (Срез 5цм,

а) КОНТРОЛЬНОИГРУППЫ ^ 1-11- г '

окраска гематоксилин-эозин, 100х) Рис. 8. Пирамидальные нейроны СА1 области гиппокампа

Таким образом, на основании проведенного исследования, можно сделать следующие выводы.

Перфторан, введенный крысам 8НЯ внутривенно в объеме 20% от ОЦК в период острой ишемии головного мозга по истечении 6 суток оказывает протекторное действие на отделы головного мозга, ответственные за поведение, двигательную активность и увеличивает вероятность сохранения функций головного мозга после ишемической атаки;

Перфторан сохраняет целостность пирамидальных нейронов СА-1 области гиппокампа, наиболее чувствительных к гипоксии.

Список литературы:

1. Воробьев С.И., Ладилов Ю.В.,Образцов В.В., Иваницкий Г.Р. Предварительное введение эмульсии перфторуглеродов - новый метод проти-воишемической защиты миокарда // Бюлл. эксперимент, биол. и медицины

- 1990. - № 6. - C. 19-21.

2. Перфторан-кровезаменитель с газотранспортной функцией: инструкция для врачей клиник. - СПб.: СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, 2001.

3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. -М., 2000.

4. Kolluri S., Heros R.C., Hedley-Whyte E.T., Vonsattel J.P., Miller D., Zervas N.T. Effect of Fluosol on oxygen availability, regional cerebral blood flow, and infarct size in a model of temporary focal cerebral ischemia // Stroke.

- 1986. - V. 17 (5). - P. 976-1180.

5. Kidwell C.S., Saver J.C., Mattiello J. // Neurology. - 1999. - P. 52-53.

6. Li F., Tatlisumak T. // Ann Neurol. - 1999. - V. 46. - P. 333-342.