CC BY
130
УДК Б1Б.379-008.Б4:Б12.397/.398
«ПОРОЧНЫЙ КРУГ» ВЗАИМОСВЯЗИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-ГО ТИПА
О.В. Занозина, Ю.А. Сорокина, Н.Н. Боровков, Т.Г. Шербатюк,
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Занозина Ольга Владимировна - e-mail: [email protected]
Настоящее исследование основано на результатах наблюдений 28 больных, страдающих сахарным диабетом 2-го типа. Современными методами оценивались молекулярные продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) и активность ферментативной антиоксидантной системы. Показано, что активация свободнорадикального окисления (СРО) присутствует даже при компенсированном недлительно текущем СД2, содержание ранних маркёров окислительной деструкции белка выше как в покое (АДФГс) - на 33% (p=0,001), так и индуцированных (АДФГи) - на 75% (р=0,018Б). Полученные нами данные позволяют, вероятно, говорить об этапности развития СРО, а также подтверждают мысль о том, что в спокойном состоянии (без индукторов, которыми являются свободные радикалы) окислено модифицированные белки являются нейтральными в плане дальнейшего углубления ОС. При дальнейшей генерации радикалов (вследствие гипергликемии, гликозилирования, ослабления антиоксидантной защиты) происходит активация ОМБ, которая стимулирует ПОЛ, служит дополнительным источником СР, инактивирует антиоксидантные ферменты, что формирует так называемый «порочный круг СРО».
Ключевые слова: сахарный диабет 2-го типа, окислительный стресс, компенсация углеводного обмена, окислительная модификация белков,
перекисное окисление липидов.
We performed a comparing analysis of 28 subjects suffering from T2DM. Molecular products of peroxide oxidation of lipids and oxidatively modified proteins and activity of enzymatic antioxidant systems were examined with modern technology. The activation of free - radical oxidation occurs even when non long-term T2DM is under glycemic control, amount of markers of early protein destruction - alde-hydedinitrophenylhydrazones spontaneous (ADPhH-s) - is bigger in 33% (p=0,001) as well as induced (ADPhH-i) in 75% (p-0,0188) than in normal group. We have come to conclusion that there is staging of free - radical oxidation. It is confirmed that oxidatively modified proteins are indifferent and neutral to the oxidation process without inductors which are free radicals. In the further free radicals generation (due to hyperglycemia, glycosylation, weak antioxidant system) appear more oxidatively modified proteins, which enable peroxide oxidation of lipids, provides new free radicals, deactivate antioxidative enzymes, these processes form so called «Vicious circle of free - radical oxidation».
Key words: diabetes mellitus type 2, oxidative stress, good glycemic control, oxidatively modified proteins, peroxide oxidation of lipids.
Сахарный диабет (СД) является прогрессирующим сердечно-сосудистым заболеванием [1]. В настоящее время общепризнана роль хронической гипергликемии в развитии поздних осложнений СД. Гипергликемия натощак и в постпрандиальном периоде, а также острые колебания содержания глюкозы приводят к избыточному гли-козилированию и активации окислительного стресса (ОС), что способствует развитию и прогрессированию осложне-
ний сахарного диабета [2-3]. Общепринято, что при декомпенсации СД 2-го типа выраженность ОС максимальна [4-8], но не все признают активацию ОС при компенсированном СД 2-го типа.
Согласно данным А.И. Ляйфер и др. (1993), при СД компенсация обменных процессов не нормализует реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ), но благоприятно влияет на систему противоперекисной защиты [9]. Это под-
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
держивается и другими авторами. [10]. Если вопрос о выраженности ПОЛ у больных СД 2-го типа в период декомпенсации в настоящее время ни у кого не вызывает сомнения, то относительно содержания окислительно модифицированных белков (ОМБ) у больных СД 2-го типа до недавнего времени не существовало единого мнения. Согласно данным С. Dominguez et al. (1998), I. Grattaglianoet al. (1998), D. Suzuki et al. (1998), содержание окисленных белков при СД повышалось. По данным К. Krapfenbauer et al. (1998), М. Portero—Olin et al. (1999) количество модифицированных белков не изменялось [11]. М.А. Флёров и соавт. (2003) показали, что у детей, больных СД 1-го типа, отмечено повышение индуцированных окислено модифицированных белков на 73% и спонтанных - на 50% [12]. При наличии нефропатии уровень ОМБ увеличивался вдвое по сравнению с больными детьми без нефропатии и в 5 раз по сравнению с нормой [12]. Существование сложной 3-уровневой антиоксидантной защиты в нормальных условиях сводит до минимума опасность свободнорадикальной агрессии [10]. Тем не менее, было показано, что снижение активности СОД более чем на 50% приводит к неуправляемому свободнорадикальному окислению и гибели клетки [10].
Цель исследования: уточнить взаимосвязь перекисно-го окисления липидов и окислительной модификации белков у больных сахарным диабетом при небольшой длительности заболевания при удовлетворительной компенсации углеводного обмена.
Материалы и методы
Настоящее исследование основано на результатах наблюдений 28 больных, страдающих сахарным диабетом 2-го типа. Средний возраст - 51 [49; 59] год, длительность заболевания - около 1 года. Гликированный гемоглобин -6,9%. Группу контроля составили 14 пациентов, сопоставимых по полу и возрасту, но не страдающих сахарным диабетом. Диагноз СД 2 и степень компенсации углеводного обмена устанавливались согласно рекомендациям ВОЗ (1999 г.) и Национальным стандартам оказания медицинской помощи больным сахарным диабетом [13].
Гликозилированный гемоглобин (HbA1c) определялся на жидкостном хроматографе Bio-Rad со стандартными наборами (France). Интегральную интенсивность (Imax) и общую антиоксидантную активность (ОАА) определяли методом индуцированной хемилюминесценции. Imax, максимальная интенсивность свечения, косвенно свидетельствующая об активности радикалообразования, измерялась в mV, ОАА - в относ. ед. Диеновые конъюгаты (ДК), триеновые конъюгаты (ТК), малоновый диальдегид (МДА) определялись на аппарате Helios (Thermo Spectronic, USA) и измерялись в ед. опт. пл/г.о.л. Для определения окислительной модификации белков (ОМБ) был использован метод, предложенный Levine (1990) в модификации метода Е.Е. Дубининой (1995). Оценивали ОМБ по уровню карбонильных производных, выявляемых в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином: альдегид-
динитрофенилгидразоны (АДФГ) и кетон-динитрофенилгидразоны (КДФГ). Анализировали спонтанную и металлзависимую (индуцированную) окислительную модификацию белков. Оптическая плотность образовавшихся соединений регистрировалась при дли-
нах волн 270 и 363 нм, измерение проводилось в относ. ед. [14]. Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) использовался метод, разработанный №Ыатн (1972), в адаптации Е.Е. Дубининой и др. (1988). Для определения активности каталазы (КАТ) использовался метод, разработанный АеЫ (1970), в адаптации Королюк и др. (1988), Чевари и др. (1991). Определение активности глута-тионпероксидазы проводили по методике А.Г. Гаврилова (1986). Активность выражали в ед. активности на мг гемоглобина в минуту (ед. акт./мг НЬ мин.) [14].
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались статистически общепринятыми методами статистики на компьютере 1ВМ РС при помощи пакета прикладных программ для обработки медицинской и биологической информации БТАТ1БТ1СА 6.0 (StatSoft,Inc.,США). Осуществлялось определение средней (М), стандартного отклонения №). Характер распределения определялся при помощи критериев Шапиро-Вилко и Колмогорова-Смирнова. Параметрические данные описывались в виде средней (М) и стандартного отклонения №) в формате М+SD. Непараметрические данные описывались в виде медианы, нижнего квартиля (25 процентиль) и верхнего квартиля (75 процентиль) в формате (Ме [25р; 75р]). При нормальном распределении переменных для определения различий между двумя зависимыми и независимыми группами использовался парный и непарный ^критерий Стьюдента, а при непараметрическом - критерий Вилкоксона и Манна-Уитни соответственно [15].
Результаты и их обсуждение
Нами показано, что активация свободно-радикального окисления (СРО) присутствует даже при компенсированном не длительно текущем СД 2. Интенсивность СРО в этой группе больных была статистически значимо увеличена (р<0,001), а общая антиоксидантная активность снижена (р=0,004) по сравнению с контролем (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1.
Интегральная интенсивность свободнорадикального окисления и общая антиоксидантная активность у больных СД 2-го типа (М±SD)
Показатель Компенсированный СД 2-го тип (n=28) Контроль (n=14)
I max, mV 1,891+0,062 1,691+0,141 р<0,001
ОАА, относ. ед. 0,043+0,005 0,047+0,005 р=0,004
При оценке молекулярных продуктов перекисного окисления липидов оказалось, что содержание ДК, ТК, МДА, ОШ у больных СД 2-го типа также статистически значимо превышало содержание аналогичных показателей у пациентов из группы контроля (таблица 2).
Доказано, что наличие дефицита активности антиокси-дантных ферментов является одной из важных причин развития окислительного стресса [16], компенсация углеводного обмена у СД 2-го типа сопровождается безусловным снижением интенсивности СРО [10]. По сравнению с контролем, у больных с недлительно текущим и компенсированным СД 2-го типа активность СОД снижена на 33,1% (р=0,041), что требует дополнительного терапевтического воздействия.
ТАБЛИЦА 2.
Молекулярные продукты ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов у больных СД 2 (М±SD)
Показатель Компенсированный СД 2-го типа (n=28) Контроль (n=14)
ДК, ед. опт. пл/ г.о.л 0,27±0,04 0,13±0,007 р=0,032
ТК, ед. опт. пл/ г.о.л 0,031±0,007 0,008±0,003 р=0,027
МДА, ед. опт. пл/ г.о.л 2,46±0,541 0,173± 0,050 р=0,006
ОШ, отн. ед./г.о.л 49,13±8,24 36,21±5,69 р<0,001
СОД, ед. акт./мг Hb мин. 64,92±8,02 86,43± 4,491 р=0,041
КАТ, ед. акт./мг Hb мин. 0,125±0,019 0,112±0,024 р=0,473
ГП, ед. акт./мг Hb мин. 25,62±2,84 24,4±0,81 р=0,13
Примечание: ДК - диеновые конъюгаты, ТК - триеновые конъюгаты, МДА - малоновый диальдегид, ОШ - основания Шиффа, СОД - супер-оксиддисмутаза, КАТ - каталаза, ГП - глутатионпероксидаза, ед. опт. пл/г ол - единицы оптической плотности на грамм общих липидов.
Окислительная модификация белков признаётся в настоящее время одним из ранних, но наиболее надёжных индикаторов поражений ткани при СРО [17, 18]. Нами отмечено, что у пациентов, не длительно страдающих СД 2-го типа и в настоящий момент имеющих компенсацию углеводного обмена, по сравнению с контролем статистически значимо повышено содержание ранних маркёров окислительной деструкции белка как в покое (АДФГс) - на 33% (р=0,001), так и индуцированных (АДФГи) - на 75% (р=0,0186). У данных пациентов содержание поздних маркёров окислительной деструкции белка (КДФГ) даже в покое в среднем превышает таковую в группе сравнения на 80% (р<0,001), а при индукции возрастает в 2 раза (р=0,003) ( таблица 3).
ТАБЛИЦА 3.
Содержание ОМБ у больных СД 2-го типа в различных группах М [25p;75p]); (М±SD)
Показатель Компенсированный СД 2-го типа (n=21) Контроль (n=14) P
АДФГс, отн. ед. 0 0 О R 00 °,^ 00 0 ,0 0 0,000 [0,0002;0,0003] 0,001
АДФГи, отн. ед. 0,001 [0,0006;0,0007] 0,000 [0,0003;0,0008] 0,019
КДФГс, отн. ед. 0,0036±0,00084 0,0004±0,00001 <0,001
КДФГи, отн. ед. 0,0039±0,0011 0,0019±0,0009 0,003
Уровень АДФГс (наиболее ранний маркёр повреждения, свидетельствующий о нарушении окислительного потенциала клетки) статистически значимо коррелировал с активностью СОД (г=0,52; р =0,004) и отрицательно с ДК (г=-0,43, р=0,01) и МДА (г=-0,43, р= 0,01). Взаимосвязь АДФГи и СОД была также очевидной (г=0,51; р=0,003). При сопоставлении коэффициентов корреляции значимых различий между ними найдено не было (р=0,32), что свидетельствовало о том, что эти данные не являются случайными, а отражают патогенетические взаимосвязи между составляющими окислительного равновесия на самых ранних этапах заболевания. Вероятно, при небольшой длительности заболевания ОМБ выполняют и антиокси-
дантную функцию, способствуя восстановлению окислительного потенциала клетки за счёт активации СОД, тем самым ограничивая СРО.
Следует сказать, что между АДФГс и АДФГи, а также между КДФГс и КДФГи существует тесная взаимосвязь (г=0,055, р=0,001 и г=0,81, р<0,001 соответственно), в то время как между АДФГс и КДФГс статистически значимой связи нами не обнаружено (г=0,048, р=0,804). Индуцированные АДФГ значимо коррелируют с индуцированными КДФГ (г=0,651, р<0,001). Вероятно, окислено модифированные белки иницируют генерацию радикалов, вследствие чего уровень ДК возрастает в 1,5 раза (р=0,029), содержание ТК увеличивается в 1,6 раза (р=0,049).
Полученные нами данные позволяют, вероятно, говорить об этапности развития СРО, а также подтверждают мысль о том, что в спокойном состоянии (без индукторов, которыми являются свободные радикалы) окислено модифицированные белки являются нейтральными в плане дальнейшего углубления ОС. При дальнейшей генерации радикалов (вследствие гипергликемии, гликозилирова-ния, ослабления антиоксидантной защиты) происходит активация ОМБ, которая стимулирует ПОЛ, служит дополнительным источником СР, инактивирует антиоксидант-ные ферменты, что служит источником для активизации СРО и формирует так называемый «порочный круг СРО».
Схему возможной взаимосвязи ОМБ и ПОЛ можно представить в виде «порочного круга» (рис.).
/ "Ч Потенциальная взаимосвязь ОМБ и ПОЛ ( порочный KDvr)
со V © с I Гипергг V CF \у \/ Ц АДФГ с ' гЧ, АДФГи ft \ (ДК.ТК N
РИС.
Потенциальная взаимосвязь ОМБ и ПОЛ (порочный круг). Примечание: СР - свободные радикалы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дедов И.И., Шестаков М.В. Сахарный диабет: руководство для врачей. М.: Универсум Паблишинг, 2003. 456 с.
2. Monnier L., Colette С., Owens D.R. Integrating glycaemic variability in the glycaemic disorders of type 2 diabetes: a move towards a unified glucose tetrad concept. Diabetes Metab. Res. Rev. 2009. Vol. 25. P. 393-402.
3. Zaccardi F., Pitocco D., Ghirlanda G. Glycemic risk factors of diabetic vascular complications: the role of glycemic variability. Diabetes Metab. Res. Rev. 2009. Vol. 25. P. 199-207.
4. Baynes J.W. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes. 1991. Vol. 40. P. 405-412.
03
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
5. Giugliano D., Ceriello А., Paolisso G. Oxidative stress and diabetic vascular complication. Diabetes Care. 1996. Vol. 19. P. 257-267.
6. Haidara М.А. et al. Role of oxidative stress in development of cardiovascular complications in diabetes mellitus. Curr.Vasc. Pharmacol. 2006. Vol. 4. № 3. P. 215-227.
7. Evans J. et al. Oxidative Stress and Stress-Activated Signaling Pathways: A Unifying Hypothesis of type 2 Diabetes. Endocrine Reviews. 2002. Vol. 23. № 5. P. 599-622.
8. Ceriello A. Hyperglycaemia: the bridge between non-enzymatic glycation and oxidative stress in the pathogenesis of diabetic complication. Diabetes Nutr. Metab.
1999. Vol. 12. P. 42-46.
9. Ляйфер А.И., Солун М.Н. Система перекисного окисления липидов -антиоксидантная защита и роль её нарушений в патогенезе сахарного диабета и ангиопатий. Пробл. эндокринол. 1993. № 1. С. 57-59.
10. Недосугова Л. В. Окислительный стресс при сахарном диабете типа 2 и возможности его медикаментозной коррекции: Автореф. дис. ...докт. мед. наук: 14.00.03; 03.00.04. Москва, 2006. 375 с.
11. Бондарь И.А., Климонтов В.В., Поршенников И.А. Окислительная модификация белков при диабетических микроангиопатиях. Сахарный диабет.
2000. № 1. С. 24-28.
12. Флеров М.А., Смирнов Н.Н., Светлова З.В. Перекисное окисление белков плазмы крови больных сахарным диабетом типа 1. Проблемы эндокринологии. 2003. Т. 49. № 4. С. 3-4.
13. Дедов И.И., Шестакова М.В. « Алгоритмы лечения больных сахарным диабетом» методические рекомендации. М.: МедиаСфера, 2011. 84 с.
14. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. СПб.: Фолиант,
2000. 104 с.
15. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2006. 312 с.
16. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков ЮН. Антиоксиданты в комплексной
терапии атеросклерозарго et contra: пособие для врачей. М.: Медпрактика, 2003. 40 с.
17. Губский Ю.И. и др. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях (обзор литературы). Современные проблемы токсикол. 2005. № 3. С. 20-26.
18. Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В. Окислительная модификация протеинов, её роль при патологических состояниях. Укр. бiохiм журн. 2008. Т. 80. № 6. С. 5-18.
