CC BY
11
Литература:
1. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Cell. 2007. V. 131. P. 861-872.
2. Новосадова Е.В., Андреева Л.А., Арсеньева Е.Л. и др. Пат. РФ № 2646446 от 05 марта 2018г.
3. Novosadova E., Antonov S., Arsenyeva E. et al. Neurotoxicology. 2021. V. 82. P. 108-118.
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРИОГЕННО-СТРУКТУРИРОВАННОГО ГИДРОГЕЛЯ НА ОСНОВЕ ЖЕЛАТИНА ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
A.М. Григорьев1, Ю.Б. Басок, А.Д. Кириллова,
B.А. Сургученко, Н.П. Шмерко1,
В.К. Кулакова2, Р.В. Иванов2, В.И. Лозинский2, А.М. Суббот3, В.И. Севастьянов1
1 ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБУН Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, Россия
3 ФГБНУ НИИ глазных болезней, Москва, Россия e-mail: Bear-38@yandex.ru
Ключевые слова: криогенно-структурированный гидрогель, желатин, макропористая губка, тканевая инженерия, печень.
Согласно прогнозам на ближайшие годы, острый дефицит донорских органов будет расти, что делает необходимым поиск альтернативных технологий, в том числе, технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины, основанных на имплантации клеточно-инженер-ных конструкций (КИК), включающих матрицы-носители, нагруженные стволовыми и/или специализированными клетками [1]. При создании КИК предпочтительными формами матриц являются макропористые системы из твердотельных полимеров или гидрогелей [2].
Целью работы было исследование биологических свойств матрицы из криогенно-структурированного гидрогеля в форме макропористой желатиновой губки, а также возможности создания на ее основе КИК, с различными клеточными компонентами.
Основными компонентами синтеза криогенно-структурированного гидрогеля были желатин (тип А), 1\1-(3-диметиламинопропил)-1\Г-этилкарбодиимид, (ЭДК) и мочевина (все — Sigma-Aldrich, США). Морфологию поверхности исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Степень набухания в воде образцов определяли гравиметрически. Цитотоксичность оценивали на фибробластах мыши линии NIH 3T3 и ме-зенхимальных стромальных клетках жировой ткани человека (МСКЖТч) с использованием IncuCyteZOOM (EssenBioscience, США). В качестве клеточной компоненты КИК были выбраны МСКЖТч, клетки гепатоцел-люлярной карциномы HepG2 или эндотелиальные клетки пупочной вены человека линии EA.hy926. Содержание альбумина в культуральной среде определяли методом иммуноферментного анализа. Скорость метаболизма аммиака оценивали после 90 минут инкубации с 1 mM хлоридом аммония (Sigma-Aldrich, США), разведенным в культуральной среде на 15 сутки эксперимента.
Получение криоструктурированного гидрогеля в форме макропористой губки включало замораживание водного раствора смеси желатина и мочевины, удаление поликристаллов растворителя лиофилизацией,
экстракцию мочевины этанолом и обработку крио-структурата этанольным раствором ЭДК. СЭМ позволила выделить три типа пор на поверхности носителя: крупные (109 ± 17 мкм), средние (39 ± 10 мкм) и малые (16 ± 6 мкм). Степень набухания в воде образцов матрицы составила 3,8 ± 0,2 г Н2О на 1 г сухого полимера. Установлена способность макропористой желатиновой губки в составе КИК поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч, клеток линии EA.hy926 и HepG2 в течение 28, 15 и 9 суток, соответственно. Доказано наличие секреции альбумина и метаболизма аммиака при культивировании клеток HepG2 на желатиновой губке.
Таким образом, на примере КИК печени показана перспективность использования матрицы из макропористого криогенно-структурированного гидрогеля на основе желатина для технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Литература:
1. Трансплантология и искусственные органы: учебник / под ред. акад. РАН СВГотье. М.: Лаборатория знаний; 2018. — 319 с.: ил. ISBN 978-5-00101-107-1.
2. Zhao P, Wang J, Li Y, Wang X, Chen C, Liu G. Microfluidic Technology for the Production of Well-Ordered Porous Polymer Scaffolds. Polymers (Basel). 2020;12(9):1863. doi: 10.3390/ polym12091863. PMID: 32825098; PMCID: PMC7564514.
ПОРИСТЫЕ МАТРИКСЫ
С БИОМИМЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРОЙ
И СВОЙСТВАМИ
Т.Е. Григорьев1, Ю.Д. Загоскин1, К.И. Луканина1,
Т.К. Токаев2, М.В. Синицын2, Е.А. Храмцова4,
В.И. Севастьянов3, С.Н. Чвалун1
1 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 НМИЦ ФПИ Минздрава России, Москва, Россия
3 НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова Минздрава России, Москва, Россия
4 Институт биохимической физики им Н.М. Эмануэля РАН, Москва, Россия
e-mail: timgrigo@yandex.ru
Ключевые слова: пористость, трехмерная структура, модуль
упругости, биоразлагаемые материалы, биосовместимость
Создание трехмерных биосовместимых носителей — матриксов, обладающих заданной морфологией и регулируемыми функциональными физико-химическими свойствами, является актуальной задачей науки о полимерах. Многопараметрическое управление характеристиками таких матриксов, разработка фундаментальных методик их получения определяют перспективу дальнейшего развития регенеративной медицины. Наряду с биосовместимостью и пористой структурой матрикс должен обладать также биоадекватными физико-механическими характеристиками: как микромеханические характеристики оказывают влияние на процессы адгезии и диф-ференцировки клеток, так и прочностные характеристики материала влияют на биосовместимость и общую функциональность матрикса.
В докладе отражены основные подходы к созданию пористых материалов с настраиваемой структурой и свойствами: волокнистых нетканых, губчатых и ги-дрогелевых. Систематически исследована структура и биомеханическое поведение ряда тканей и органов, нативных и децеллюляризованных: кожи, трахеи, диафрагмы, аорты, желчного протока, легких, сердца, почек.
Показано влияние процессов децеллюляризации и ре-целлюляризации на стабильность к циклическим нагрузкам: при удалении клеточных компонент ткань теряет способность претерпевать многократные циклические деформации без потери прочности. Проведено сравнение биомеханического поведения синтетических и на-тивных матриксов. С применением различных моделей высокоэластичности показано влияние структурных элементов матрикса на его физико-механическое поведение. Показана эффективность использования хитозана и хитина для модификации свойств коллагеновых губчатых материалов. Также систематически исследовано структурообразование принципиально новых высокопористых композиционных материалов — губчато-во-локнистых на основе природных полимеров и нетканых волокон, полученных электроформованием. Работа поддержана НИЦ «Курчатовский институт» в области разработки губчатых и гидрогелевых матриксов, НМИЦ ФПИ в области in vivo тестирования биологических свойств губчатых полилактидных материалов, грантом РНФ № 21-13-00321 в области получения и исследования губчато-волокнистых матриксов.
МЕХАНИЗМЫ ПОДАВЛЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МИОФИБРОБЛАСТОВ С ПОМОЩЬЮ ИНДУКЦИИ АДИПОГЕНЕЗА: УПРАВЛЕНИЕ РАЗВИТИЕМ ФИБРОЗА
О.А. Григорьева2, Н.А. Басалова1 2, М.А. Виговский1, 2, У.Д. Дьячкова1, А.Ю. Ефименко1, 2
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт регенеративной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: go.grigorievaolga@gmail.com
Ключевые слова: фиброз, дифференцировка, миофибро-бласты, транскриптом единичных клеток.
Процессы дифференцировки стволовых и прогени-торных клеток, а также трансдифференцировки терминально дифференцированных клеток лежат в основе механизмов обновления и регенерации ткани, поддержания гомеостаза. Нарушение регуляции этих процессов может приводить к накоплению клеточных типов, патологически изменяющих функционирование тканей. Управление процессом дифференцировки и трансдиф-ференцировки, в частности, позволяет предотвратить, а в будущем и обратить накопление в ткани миофибро-бластов — основных эффекторных клеток при развитии фиброза. Один из исследуемых способов изменения дифференцировочной программы миофибробластов — стимуляция сигнального пути PPARy с помощью индукторов адипогенной дифференцировки.
Анализируя транскриптом единичных мезенхимных стромальных клеток (МСК), выделенных из жировой ткани человека, мы обнаружили гены, экспрессия которых разнонаправленно изменяется при стимуляции дифференцировки миофибробластов либо при индукции адипогенной дифференцировки. Полученные данные были валидированы с помощью анализа уровня экспрессии представленных генов с помощью ПЦР в реальном времени. Далее мы разработали in vitro модель TGFß-индуцированной дифференцировки легочных фибробластов человека в миофибробласты. В данной модели добавление индукторов адипогенеза приводило
к снижению уровня альфа-гладкомышечного актина (aSMA), количества стресс-фибрилл в клетках, кроме того, снижалась способность клеток сжимать коллагено-вый гель, характерная для миофибробластов. При этом в клетках значительно рос уровень экспрессии генов, характерных для адипогенеза — PPARY и FABP4.
ПЦР-анализ образов, полученных в разработанной модели, показал, что гены, выявленные в результате предварительного биоинформатического анализа образцов МСК человека ^N1 (фибронектин-1), CHD3 (хеликазный хромодомен ДНК-связывающего белка 3), NTM (нейро-тримин), VCAN (версикан), RHD10 (ретинолдегидроге-наза-1 0)), также разнонаправленно экспрессируются и в фибробластах легких человека. Уровень экспрессии этих генов рос в модели TGFp-индуцированной диффе-ренцировки в миофибробласты и снижался в клетках после воздействия адипогенных индукторов.
Полученные данные позволят лучше понять механизмы трансдифференцировки миофибробластов и выявить новые перспективные мишени для лекарственной терапии фиброза.
Исследование поддержано грантом РФФИ № 21-315-70002.
РЕГЕНЕРАТИВНЫЙ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
Т.М. Гринчук, М.А. Шорохова, Н.Н. Никольский
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия e-mail: grintat@bk.ru
Ключевые слова: эндометриальные мезенхимные стволовые клетки, кариотип, хромосомные аберрации
Необходимым условием использования стволовых клеток (СК) в регенеративной медицине является генетическая безопасность клеточного материала. Важным тестом, позволяющим оценить генетическую безопасность на уровне клетки и на уровне популяции, является детальный цитогенетический анализ, основанный на изучении морфологии хромосом в пределах карио-типического набора. На настоящий день наиболее исследованы и востребованы в медицинской практике ме-зенхимные клетки (МСК) костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови. Установлено, что разнотипные МСК в системе in vitro в ряде случаев характеризуются утратой генетической стабильности. На уровне кариотипа это выражается в появлении анеуплоидных клеточных вариантов, межхромосомных ассоциаций, способствующих изменению структуры кариотипического набора и разнотипных хромосомных перестроек, в том числе транслокаций, инверсий, кольцевых хромосом, приводящих к изменению положения генов с возможной активацией про- и онкогенов.
Анализ физиологических и генетических особенностей ряда линий эндометриальных мезенхимных стволовых клеток (эМСК), полученных в лаборатории внутриклеточной сигнализации и транспорта ИНЦ РАН, показал, что по ряду характеристик, а именно, доступности донорского материала, неинвазивному выделению, наличию высокого пролиферативного потенциала, низкой иммуногенности, способности секретировать большое количество факторов, играющих ключевую роль в восстановлении и регенерации тканей, они превосходят МСК из других источников.
