CC BY
79
1. Атраментова Л. О.Статистические методы в биологии: учебник [для студ. высш. уч. зав.] / Атраментова Л. О. Утевская О. М. - Горловка: ЧП «Видавництво Ліхтар>>, 2008. - 248с.
2. Божокин С. В. Фракталы и мультифракталы / С. В. Божокин, Д. А. Пашин. - Ижевск:НИЦ <<РХД>>, 2001.-128 с.
3. Комплекс для фрактальной морфометрии микроциркуляторного русла in vivo/ Луценко Д. Г.,
Марченко Н. В., Марченко В. С. [ и др.] //Проблемы криобиологии. -2005.-Т.15, № 3.-С. 516-518.
4. Ломакин И. И. Экспериментальная модель алкоголизма в условиях воздействия низких температур / И. И. Ломакин, Г. А. Бабийчук, В. В. Мамонтов //Проблемы криобиологии. -2005.-№ 3. -
С. 499-503.
5. Судаков К. В. Основы физиологии функциональных систем / Судаков К. В. - М.: Медицина ,1983.-272с.
6. Фрактальный анализ процессов, структур и сигналов / Под редакцией Р. Э. Пащенко.-Х. : ЭкоПерспектива, 2006.-348 с.
7. Фрактальна організація мікроциркуляторного русла при штучній гіпотермії/ Луценко Д. Г., Слета І. В., Марченко В. С. [ и др.] // Науковий вісник національного аграрного університету.-Київ,2008.-С. 75-80.
8. Шабанов П. Д.Основы наркологии/ Шабанов П. Д. - Санкт-Петербург, 2002.- 560с.
9. Sampling variability of computer-aided fractal-corrected measures of liver fibrosis in needle biopsy
specimens. /Grizzi F, Russo C, Franceschini B [at al] //World J. Gastroenterol.-2006,Dec 21 .-12(47).-Р.7660-7665.
ФУНКЦІОНАЛЬНА АНГІОАРХІТЕКТОНІКА МОЗКУ ПРИ ДІЇ НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР В УМОВАХ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ МОДЕЛІ ХРОНІЧНОГО АЛКОГОЛІЗМУ Ломакін І.І., Луценко Д.Г., Марченко В.С., Марченко Л.М.
Відображено особливості організації' функціональної ангіоархітектоніки мозку при загальному екстремальному охолодженні (-120оС). Подається порівняльний аналіз змін фрактальної розмірності мікроциркуляторного руслу мозку щурів в нормі та за умов хронічної алкоголізації. Також наводяться результати морфологічного аналізу гіпоталамусу піддослідних тварин при хронічній алкогольній інтоксикації з наступним загальним екстремальним охолодженням.
Ключові слова: мозок, низькі температури, хронічний алкоголізм.
FUNCTIONAL BRAIN ANGIOARCHITECTONICS AFTER EXTREME COOLING IN EXPERIMENTAL MODEL OF A CHRONIC ALCOHOLISM Lоmakin I.I., Lutsenko D.G., Marchenko V.S., Marchenko L.N.
In the article we show the characteristics of the functional brain architectonics after extreme cooling (about -120oC). We give a comparative analysis of changes in the fractal dimension of brain microcirculatory bed in rats in control and after chronic alcoholization. Also we give a morphological analysis of rat hypothalamus after chronic alcoholization and following extreme cooling.
Key words: brain, extreme cooling, chronic alcoholization.
УДК 615.361.018.46.014.41
ПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КЛЕТОК ПЛАЦЕНТЫ, КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ В РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ
Работа выполнена в рамках темы 2.2.6.38 № Госрегистрации 0107U006893.
Использование клеток плаценты рассматривается в настоящее время как одно из перспективных направлений терапии аутоиммунных заболеваний. Обоснованием такого подхода является способность этих клеток продуцировать широкий спектр иммуномодулирующих активностей. Так, показано изменение клетками трофобласта баланса регуляторных Т-хелперов в сторону противовоспалительного компартмента [11, 20], установлена продукция клетками цитотрофобласта супрессорных активностей в виде ТФРбета и ИЛ-10 [17], гигантскими трофобластическими клетками - фермента IDO [18]. Обсуждается участие макрофагов плаценты в поглощении иммунных комплексов [22],
регуляции апоптотических процессов [3] и т.д. Применение клеток плаценты с терапевтической целью предусматривает необходимость использования криоконсер-вированного материала, а следовательно, изучения особенностей влияния факторов криоконсервирования на этот биологический объект [ 3, 6, 12]. В ряде работ показано, что факторы криоконсервирования могут проявлять различное действие на разные клетки и их функции [5,6,10]. В связи с этим весьма интригующим является рассмотрение вопроса возможного селективного действия криоконсервирования и сохранения в гетерогенных клеточных (тканевых) пулах определенных популяций или свойств клеток после замораживания. Такой эффект отмечен в отношении дендритных клеток при криоконсервировании периферической крови [19], регуляторно-акцессорных клеток костного мозга [1], кроветворных предшественников из костного мозга и фетальной печени [4,16], пула антигенпрезентирующих клеток в тканевых трансплантатах щитовидной железы [7]. Вопрос количественного и качественного изменения состава суспензии плаценты под действием факторов криоконсервирования и возможности селективного действия замораживания остается малоизученным.
Целью работы была оценка характера влияния различных условий криоконсервирования на популяционный состав и структурно-функциональное состояние клеток в суспензии плаценты мышей.
Материал и методы исследования. В работе были использованы мыши линии СВА/Н массой 18-20г. Все экспериментальные процедуры с животными были выполнены согласно Международным принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных (Страсбург, 1985).
Клетки выделяли из хориального участка плаценты на 18-19 сутки гестации по методу [9]. Кратко: выделенную ткань отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) от крови и слизи, измельчали в гомогенизаторе Поттера в растворе ЗФР, фильтровали через нейлоновый фильтр. Морфологический состав суспензии клеток нативной и криоконсервированной плаценты определяли с помощью световой микроскопии мазков, фиксированных метанолом и окрашенных по Романовскому-Гимзе.
Криоконсервирование суспензии клеток плаценты осуществляли в криопробирках (Nunk, Roskilde, Denmark) в объеме 0,5 мл. Время эквилибрации суспензии клеток с криопротекторами до этапа замораживания было 15 мин. Криоконсервирование КП осуществляли под защитой диметилсульфоксида (ДМСО) в 5% или 10% концентрации (КД-1 и КД-2 соотв.) или пропандиосахароля (ПДС) в таких же концентрациях (КП-1 и КП-2 соотв.) на программном замораживателе УОП-1 (ОП ИПКиК НАН Украины). Клетки были отогреты при 420С на водяной бане в течение 1-2 мин.
Для определения количества адгезирующих клеток (АК) суспензию плаценты инкубировали в 2 мл ЗФР в пластиковых чашках диаметром 35мм (Spectar, Сербия) при температуре 370С 1 час. Неприкрепившиеся клетки удаляли мягким смыванием. Процент АК рассчитывали по разнице между количеством клеток, внесенных в чашку и количеством неприкрепившихся клеток. Важной молекулой, участвующей в процессах адгезии, межклеточной кооперации является CD54 структура. Анализ количества клеток, экспрессирующих маркер CD54, осуществляли на проточном цитофлюориметре FACS Calibur (Becton Dickenson, USA) с помощью моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцеин изоционатом.
Статистическую обработку данных проводили по методу Стьюдента-Фишера с использованием программы Exel. Результаты представлены как средняя величина ± стандартная ошибка, для сравнения выборок использовали параметрические методы статистики (t критерий Стьюдента).
Результаты исследования и их обсуждение. Криолабильность (криостабильность) различных клеток в гетерогенной популяции представляет существенный интерес в связи с использованием криоконсервированного материала как компонента клеточной терапии, в диагностических целях, для трансплантации и возможности изменения его структурнофункционального статуса после такой процедуры [5, 21]. В исходной суспензии плаценты идентифицированы клетки цитотрофобласта, ядра синцития и возможно разрушенных при гомогенизации других клеток трофобласта, макрофагальные клетки Кащенко-Гофбауэра, лимфоциты, фибробласты, гранулоциты [2]. Как свидетельствуют представленные нами в
табл.1 данные, все выбранные условия криоконсервирования приводят к перераспределению популяционного состава в суспензии клеток плаценты по сравнению с нативным образцом.
Количество клеток цитотрофобласта и ядер не зависело от вида криопротектора, но определялось его концентрацией. С увеличением концентрации количество этих клеток в суспензии возрастало и не отличалось от нативного образца. Важно заметить, однако, что при малых концентрациях криопротекторов сохранялись преимущественно клетки цитотрофобласта и ядра. При этом, содержание ядер при этих концентрациях существенно превышало нативный контроль, что вероятно отражает выраженное разрушение в этих условиях различных клеток.
Важно, что сохранность клеток Кащенко-Хофбауэра в значительной степени также определялась видом криопротектора и его концентрацией. Использование ПДС обеспечило более высокую, чем ДМСО их сохранность, причем с увеличением концентрации криопротекторов количество этих клеток достоверно повышалось. Существенно, что только режим КД-2 обеспечивал сохранность присутствующих и в нативном материале фибробластных клеток и контаминирующих лимфоцитов, причем в более высокой концентрации криопротектора.
Эти данные согласуются с результатами [14], подчеркивающими необходимость различных условий экспозиции с криопротекторами для разных популяций клеток (например, стволовых и эндотелиальных). Кроме того, подтверждаются результатами, свидетельствующими о возможности использования определенной концентрации криопротектора (ДМСО) для обеспечения жизнеспособности и экспрессии маркеров дендритных клеток при криоконсервировании периферической крови [19].
Многие исследователи отмечают, что наряду с изменением популяционного состава криоконсервирование может затрагивать и функциональные свойства клеток. Оценка состояния клеток плаценты с адгезивными свойствами с патогенетической точки зрения оправдано, подчеркивая важность этой функциональной характеристики, определяющей их коммуникабельность с другими клетками и межклеточным матриксом. Качественные или количественные вариации молекул адгезии в процессах межклеточной сигнализации могут определять селективную миграцию клеток в участки воспаления. В общем, адгезивные свойства клеток плаценты могут определять их терапевтический потенциал.
Таблица 1
Морфологический состав суспензии клеток плаценты до и после криоконсервирования
Мате- риал Клетки цитотрофобласта, (%) Ядра клеток трофобласта, (%) Макрофаги Кащенко-Гофбауэра, (%) Лимфоциты, (%) Фибробласты, (%) Г рануло-циты,(%)
НКП 66,31 ±4,8 13,49±2,2 11,52±1,1 3,11±1,1 2,45±1,1 3,12±1,8
КД-1 57,0±3,8’ 41,0±6,3’ 1,01 ±1,2’ 1,10±1,1’ - -
КД-2 73,12±1,6ж 9,61 ±3,1ж 5,62±2,8* ж 8,01±3,8* ж 5,23±3,1 -
КП-1 50,38± 4,8 43,51± 1,4’ 6,11± 0,8’ о - - -
КП-2 74,08±6,6 х 9,14±1,4 х 16,78±2,4* # х - - -
Примечание: * - достоверные различия при сравнении с материалом НКП, о - различия достоверны при
сравнении КД-1 и КП-1, - различия достоверны при сравнении КД-2 и КП-2, ж - различия достоверны при
сравнении КД-1 и КД-2, х - различия достоверны при сравнении КП-1 и КП-2, р<0,05.
Как свидетельствуют полученные данные (рис.1), при любых условиях криоконсервирования содержание АК в суспензиях увеличивалось. Тем не менее, четко прослеживался дозозависимый эффект концентрации криопротектора: его увеличение повышало количество АК. Ранее [8] также обнаружены различной степени изменения содержания АК в криоконсервированном костном мозге в зависимости от выбранной концентрации ДМСО. Однако для клеток костного мозга была отмечена обратная зависимость от концентрации криопротектора. Такие особенности могут объясняться различным популяционным составом клеток костного мозга и плаценты, и, возможно, различным репертуаром молекул адгезии на них. В общем, это еще раз подчеркивает значимость выбора условий криоконсервирования в изменении тех или иных характеристик различных клеток. Для многих типов клеток, включая клетки цитотрофобласта, особую значимость имеет адгезивная иммуноглобулиноподобная молекула ОР54 [13]. После криоконсервирования содержание СД54+ клеток в суспензии существенно изменялось. Однако, если при использовании ПДС концентрация их достоверно повышалась в
сравнении с нативной суспензией, то в суспензии крионсервированной с ДМСО - достоверно снижалась (рис. 2). Интересно, что при использовании ДМСО корреляция между количеством АК и количеством СД54+ клеток отсутствовала, тогда как при криоконсервировании с ПДС отмечено увеличение как адгезивных свойств, так и количества СД54+ клеток. Известно, что экспрессия СД54 молекулы повышается в присутствии
ФНОальфа, являющегося одним из маркеров воспалительного процесса, в том числе манифестируемого и при АИЗ. Усиление экспрессии СД54 молекулы в свою очередь приводит к индукции хемокинов (РДЫТЕБ) и активации воспаления.
Рис. 1 Содержание АК в суспензии клеток Рис.2 Количество СД54 клеток в суспензии
плаценты. плаценты. *- достоверные различия при сравнении с
материалом НКП, р<0,05.
Установлено, также, что в условиях экспозиции с ИФНгамма и ФНОальфа активированные моноциты адгезируют к синтициотрофобласту посредством взаимо-действия 1_РД/1СДМ, что приводит к апоптозу и его разрушению [15]. В связи с этим, присутствие СД54 структур и увеличение количества клеток, несущих эти молекулы, при использовании КП-2, может повысить за счет таких взаимодействий коммуникабельность введенной суспензии.
1. Клеточный состав суспензии плаценты существенно изменяется в зависимости от выбранного режима криоконсервирования. Количество клеток цитотрофобласта после криоконсервирования в большей степени определяется концентрацией криопротекторов, а не их видом. Вместе с тем, сохранность клеток Кащенко-Хофбауэра и контаминирующих клеток зависит как от используемого криопротектора, так и его концентрации.
2. Использование различных режимов криоконсервирования дает возможность обогащения суспензии теми или иными элементами: режим КД-1- клетками цитотрофобласта, режим КП-2 - клетками Кащенко-Хофбауэра.
3. Криоконсервирование плаценты с высокими концентрациями как ДМСО, так и ПДС повышает в суспензии содержание АК. При этом увеличение содержания АК при криоконсервировании в режиме КП-2, в отличие от режима КД-2, может быть обусловлено повышением количества СД54+ клеток.
4. Полученные результаты свидетельствуют о том, что условия криоконсервирования могут служить селективным фактором, избирательно влияющим на те или иные популяции (субпопуляции) клеток в суспензии плаценты и их рецепторный репертуар, играющий важную роль в проявлении терапевтического потенциала криоконсервированного материала.
1. Возможности криобиологии в решении иммуноконфликтных проблем при пересадке гистонесовместимого костного мозга / Гольцев А. Н., Луценко Е.Д., Останкова Л.В., Дубрава Т.Г. // Проблемы криобиологии.-1996.- №2.-С.3-10.
2. Говорка Є. Плацента человека / Говорка Є. - Варшава: Польское госуд. мед. изд-во, 1970. - 471 с.
3. Гольцев А. Н. Перспективы использования препаратов плаценты как модуляторов апоптотических процессов при аутоиммунных заболеваниях / Гольцев А. Н., Рассоха И. В. // Сучасні аспекти репродуктології, перінатальної медицини та кріобіології : Зб. наук. робіт науково-практичної конференції .- Харків.- 2003.-С.24.
4. Гольцев А. Н. Идентификация фенотипических характеристик и оценка влияния различных режимов криоконсервирования на функциональный потенциал клеток фетальной печени / Ямпольская Е. Е., Дубрава Т. Г. // Вісник харк. націон. університету ім.В.Н.Каразіна. - Серія біологія.-2006.-Вип.4.-С. 748.
5. Грищенко В. И. Трансплантация продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса. От понимания механизма действия к повышению эффективности применения / Грищенко В. И., Гольцев А. Н. // Проблемы криобиологии.- 2002.- №2.-С.54-84.
6. Заготівля, кріоконсервування суспензії і екстрактів фетальних тканин та їх клінічне застосування : [метод. рекомендації /наук. ред. Грищенко В.І. та ін.].- Харків.- 2000.-12 с.
7. Криоконсервирование как фактор модификации иммунологических характеристик тканевых трансплантатов / Грищенко В. И., Гольцев А. Н., Юрченко Т. Н., Луговой С. В. // Проблеми ендокринної патології.- 2005.- №4.-С.88-97.
8. Козлова Ю. О. Вивчення впливу факторів кріоконсервування на клітини гемопоетичної системи в умовах розвитку аутоімунних захворювань: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. б. наук: спец. 03.00.19 «Кріобіологія».- Харків.- 2005.- 20, [і] с.
9. Приготування, зберігання та клінічне використання кріоконсервованої суспензії плаценти : [метод. рекоменд. /наук. ред. Грищенко В.І. та ін.].- Харків.-1997.-10 с.
10. Репин Н. В. Влияние криоконсервирования на сохранность ультраструктуры плаценты / Репин Н. В. Говоруха Т. П., Строна В. И. // Проблемы криобиологии.-2004.-№4.- С.67-72.
11. Талаев В. Ю.. Действие клеток цитотрофобласта на созревание и функцию Т-лимфоцитов, продуцирующих цитокины / Талаев В. Ю., Ломунова М.А., Заиченко И.Е. // Иммунология.-2006.-№2.-С.68-73.
12. Шепітько В. І. Структурно-функціональні показники кріоконсервованої плаценти і вплив її трансплантації на морфофункціональний стан ряду внутрішніх органів : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня докт. мед. наук: спец. 14.01.35 «Кріомедицина».-НАНУ ІПКіК.- Харків.- 2004.- 40 с.
13. Bailo M. Engraftment Potential of human amnion and chorion cells derived from term placenta / Bailo M., Soncini M., Vertua E. // Transplantation.-2004.-Vol.78.,№10.- P.1439-1448.
14. Benson J. D. Water and solute permeability of human cord blood endothelial progenitor cells / Benson J.
D. Woods E. J., Mead L. // Programs and abstracts of the 41st annual meeting of the society for cryobiology .-Beijing, China.-2004.-P.26.
15. Garcia-Lioret M. I. Monocytes adhering by LFA-1 to placental syncytiotrophoblasts induce local apoptosis via release of TNF-a. A model for hematogenious initia tion of placental inflammations / Garcia-Lioret M. I., Winkler-Lowen B //J.Leukocyte Biology.-2000.-Vol. 68.-P.903-907.
16. Goltsev A. N. Cryopreservation as a method for regulating the functional potential of bone marrow hemopoietic stem cells / Goltsev A. N., Kozlova Y.A., Dubrava T.G // Cell preservation technology.-Vol.5, №1 .-P.33-40.
17. Griesinger G. Production of pro- and anti-inflammatory cytokines of human placental trophoblasts in response to pathogenic bacteria / Griesinger G. // Journal of the Society for Gynecologic Investigation.-2000.-Vol.8.-P. 334-340.
18. Kudo Y. Tryptophan degradation by human placental indoleamine 2,3-dioxygenase regulates lymphocyte proliferation / Kudo Y., Boyd C.A.R., Sargent I.L. // Phisiol.-2001.-Vol.535.-P.207-215.
19. Makino M. A cryopreservation method of human peripheral blood mononuclear cells for afficient production of dendritic cells / Makino M., Baba M.// Scand. J Immunol.- 1997.- Vol. 45, №6.- 618-22.
20. Saito S. Distribution of Th1, Th2, and Th0 and the Th1/Th2 cell rations in human peripheral and endometrial T cells / Saito S., Tsukaguchi N. // Am.J.Reprod. Immunol.-1999.-Vol.42.-P.240-245.
21. Shreffler W. Standardization and performance evaluation of mononuclear cell cytokine secretion assays in a multicenter study / Shreffler W., Visness C., Burger M. // BMC Immunol.-2006.-Vol.7.-P.29.
22. Sutton L. N. Isolation and characterization of human fetal macrophages from placenta / Sutton L. N., Mason D. Y. // Clin. Exp. Immunol.- 1989.- Vol.78.-P.437-443.
ПОПУЛЯЦІЙНИЙ СКЛАД І ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ ПОТЕНЦІАЛ КЛІТИН ПЛАЦЕНТИ, КРІОКОНСЕРВОВАНОЇ В РІЗНИХ РЕЖИМАХ Луценко О.Д.
Встановлено, що певні режими кріоконсервування виявляють селективну дію відносно популяційного складу та функціональних властивостей клітин плаценти, що може мати важливе значення в проявленні терапевтичного потенціалу кріоконсервованого матеріалу.
Ключові слова: клітини плаценти, режим кріоконсервування.
POPULATIONAL CONTENT AND FUNCTIONAL POTENTIAL OF PLACENTA CELLS CRYOPRESERVATED BY VARIOUS MODES Lutsenko E.D.
Obtained results testify to the fact that certain cryopreservation modes may manifest a selective effect in respect cell of populational content and functional properties of placenta cells, and therby regulate therapeutic properties of cryopreserved material.
Key words: placenta cells, cryopre-
servation modes.
