CC BY
110
УДК 611-018.5.013.8:615.01441
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК КОРДОВОЙ КРОВИ ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ
ЛЛ. БАБИИЧУК П.1У1. ЗУБОВ О.Д. МИХАЙЛОВА В.В. РЯЗАНЦЕВ
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
e-mail: mixolya@mail.ru
Разработанный метод криоконсервирования ядросодержащих клеток кордовой крови, основанный на применении 596 ДМСО и новой четырехэтапной программы замораживания, позволяет минимизировать отрицательное воздействие физикохимических факторов криоконсервирования и сохранить до 8596 С1Н5+- и до 9496 СБ34+-клеток в жизнеспособном состоянии, не вызывая активации образования АФК в клетках. Установлено, что основные потери ядросодержащих клеток происходят за счет популяции 1-ранулоцитов.
Ключевые слова: кордовая кровь, ядросодержащие клетки, криоконсервирова-ние, жизнеспособность, активные формы кислорода, апоптоз.
Введение. Кордовая кровь (КК), как источник репопулирующих гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), в настоящее время достаточно часто используется в клинической практике для лечения патологий различного генеза [l, 2]. Преимущества в использовании препаратов КК, по сравнению с другими источниками ГСК, заключаются в высоком содержании некоммитированных гемопоэтических клеток, обладающих большим потенциалом пролиферации и экспансии, чем взрослый костный мозг, легкости получения данного материала, полной безопасность для матери и ребенка, а также отсутствии каких либо этических противоречий [3].
В связи с высокой востребованностью в препаратах КК возникает необходимость создания банков, в которых образцы хранятся в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-19б°С) в течение длительного времени без потери их биологических свойств. Успешность функционирования криобанков во многом будет определяться используемыми методами сепарации клеток, их криоконсервирования и долгосрочного хранения. А оценка структурнофункционального состояния клеток позволит прогнозировать терапевтическую эффективность каждого препарата.
Исходя из выше сказанного целью работы была разработка эффективных методов сепарации, криоконсервирования и хранения клеток КК, а также комплексная оценка структурнофункциональной полноценности и жизнеспособности получаемого препарата на каждом этапе различными методами.
Объекты II методы исследования. Объект исследования - ядросодержащие клетки (ЯСК) кордовой крови человека, заготовленной на глюкозо-цитратном растворе. Сбор КК производили после получения информированного согласия у роженицы.
Выделение фракции ЯСК из КК проводили методом седиментации в растворе декстрана Д-бо. В качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 5%. Криоконсервирование клеток проводили в замораживателе фирмы Cryosan по специально разработанной нами четырехэтапной программе. Отогрев осуществляли на водяной бане при 37°С.
Количество сохранных ЯСК определяли стандартным методом с помощью камеры Горяева.
Фенотипирование ЯСК (CD45+) кордовой крови, в том числе и стволовых гемопоэтических (CD34+), их жизнеспособность (по связыванию с ДНК красителем 7-аминоактиномицином D (7AAD)) и оценку стадий апоптоза клеток (комбинация 7AAD и AnnexinV-FITC) до и после криоконсервирования проводилось методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитометре FACS Calibur фирмы Becton Dickinson (BD) (США) с использованием реагентов BD. Оценку продукции активных форм кислорода (АФК) в ЯСК определяли с использованием флуоресцентного зонда DCFH2-DA. Данные проточной цитометрии оценивали с помощью программного обеспечения фирмы BD - CELLQuest Pro.
Данные представлены в виде M±SE, достоверность различий между выборками оценивали с помощью t-критерия Стьюдента с уровнем значимости 5%. Объем выборки составлял не менее 5 экспериментов.
Результаты и их обсуждение. Учитывая небольшие объемы КК (в среднем, не более 100 мл), очень важным являются как заготовка максимального количества крови, так и наиболее полное выделение ядросодержащих клеток (ЯСК) (в том числе и стволовых гемопоэтиче-ских) при сепарации с сохранением их структурно-функциональной полноценности. Поэтому с целью концентрирования ЯСК и удаления эритроцитов мы использовали седиментацию в по-лиглюкине, так как данный декстран имеет ряд преимуществ перед другими веществами (фи-колл, желатин, гидроксиэтилкрахмал и др.), применяющимися для выделения клеток. По-лиглюкин, во-первых, как и аутологичная плазма КК, является наиболее благоприятной средой для функционирования ЯСК; во-вторых это легко доступный препарат, широко используемый в трансфузиологии и не требующий отмывания клеток перед применением.
Используемый в нашей работе метод седиментации полиглюкином позволил выделять более 8о% ЯСК и ГСК из цельной КК (рис. 1).
Рис. 1. Количество выделенных СБ45+- и ('I У]4 -клеток из цельной кордовой крови
Следует указать на то, что одним из важных параметров оценки эффективности метода выделения кроме «количественного выхода» клеток является оценка их жизнеспособности. В настоящее время в мировой практике наибольшее признание получил метод оценки жизнеспособности с использованием специальных ДНК красителей и проточной цитофлуориметрии.
Как видно из рис. 2, количество жизнеспособных (7-ААБ_) СБ34+- и СБ45+-клеток после седиментации в декстране практически не отличается от количества жизнеспособных клеток в цельной кордовой крови.
Рис. 2. Жизнеспособность СГ>34+- и С045*-клеток в цельной кордовой крови (И) и после выделения декстраном (Е—1)
В настоящее время широко используемым методом для криоконсервирования ЯСК КК является использование в качестве криопротектора ДМСО в конечной концентрации 7,5-10%. Однако, ДМСО должен удаляться перед инфузией в силу своей токсичности. Удаление криопротектора после размораживания клеточной взвеси существенно усложняет процедуру полу-
чения качественных деконсервированных клеток и приводит к потере части клеток, в том числе и ГСК (до 20%) в процессе отмывания, что в свою очередь снижает клиническую эффективность препаратов КК. В связи с вышеизложенным, для криоконсервирования ЯСК КК необходимо использовать ДМСО в минимально допустимых концентрациях, что позволит избежать токсические проявления и вводить клеточную суспензию реципиентам без отмывания от криопротектора.
Разработанный нами метод криоконсервирования ЯСК КК заключается в предварительном концентрировании клеточной суспензии и медленном добавлении на холоду раствора ДМСО [4]. Разработанная четырехэтапная программа замораживания в сочетании с предлагаемым методом предобработки суспензии клеток позволяет снизить концентрацию ДМСО до 5% и получить после размораживания высокий процент жизнеспособных клеток [5].
Было показано (рис. 3), что обработка криопротектором практически не снижала сохранность и жизнеспособность ЯСК и ГСК: более 90% клеток оставались в жизнеспособном состоянии. Последующее замораживание - отогрев позволяло сохранить порядка 8о% СБ45-клеток и до 90% СБз4-клеток. При этом, жизнеспособность как ЯСК, так и ГСК оставалась на высоком уровне (ис.з).
обработки ДМСО (2) и замораживания-отогрева (3)
При оценке качества клеточных препаратов, кроме контроля количественных и качественных показателей популяции ГСК, не меньшее внимание должно быть уделено и состоянию других популяций ЯСК: лимфоцитам, моноцитам и гранулоцитам. Поскольку известно, что функциональная полноценность ГСК в значительной степени определяется гуморальными регуляторами (цитокины, гликозаминогликаны и др), вырабатываемыми клетками гемопоэ-зиндуцирующего микроокружения (лимфоцитами, макрофагами, нейтрофилами и т.п.) [6, 7].
Анализ перераспределения популяционного состава СБ45+-клеток показал, что процессы выделения и обработки криопротектором не приводят к достоверному изменению процентного содержания популяций в пробах (рис. 4). В то время как после замораживания основные потери клеток происходят в основном за счет гранулоцитов, а относительное содержание лимфоцитов и моноцитов увеличивается (рис. 4).
В следующей серии экспериментов была проанализирована жизнеспособность популяций ЯСК после криоконсервирования. Видно (рис. 5), что снижение данного показателя у общей популяции СБ45+-клеток происходило в основном за счет гранулоцитов, жизнеспособность которых составляла б9.8±3-7%. Жизнеспособность мононуклеаров при этом составляла 94-98%.
100%
90%
6х 80%
X 70%
60%
о со 50%
§ 40%
X 30%
¡2 20%
10%
0%
Рис. 4. Содержание лимфоцитов (®), моноцитов (ОI) и гранулоцитов (^*) кордовой крови
до и после криоконсервирования.
Примечание: 1 — ЯСК цельной КК, 2 — ЯСК, выделенные декстраном, 3 — ЯСК, обработанные ДМСО, 4 - ЯСК после замораживания-отогрева.
Рис. 5- Жизнеспособность лимфоцитов (!■), моноцитов (I—I) и гранулоцитов (И1) кордовой крови
до и после криоконсервирования.
Примечание: 1 - ЯСК цельной КК, 2 - ЯСК, выделенные декстраном, з - ЯСК, обработанные ДМСО,
4 - ЯСК после замораживания-отогрева
Процесс криоконсервирования как на стадии обработки криопротектором, так и непосредственно при замораживании-отогреве, помимо разрушения плазматической мембраны с последующим некрозом, вызванным формирование внутриклеточного льда и действием осмотического стресса, может вызывать гибель клеток и путем апоптоза. В связи с этим, в наших дальнейших исследованиях был применен метод оценки стадий апоптоза/некроза клеток, основанный на использовании комбинации АппехтУ с окрашиванием витальным красителем 7ААБ [8]. Данный метод позволяет идентифицировать четыре типа клеток: живые клетки (АппехтУ уААБ -клетки), клетки находящиеся на начальной стадии апоптоза (АппехтУ^ААБ -клетки), мертвые клетки, находящиеся на стадии позднего апоптоза/некроза (АппехтУ+7ААБ+) и мертвые некротические клетки (АппехтУ 7ААБ+) [8].
Оценка стадий апоптоза/некроза в ЯСК КК показала, что после выделения декстраном и обработки клеток криопротектором исследуемые показатели практически не отличались от таковых в цельной кордовой крови (табл.).
Таблица
Количество клеток, находящееся на различных стадиях апоптоза/некроза после
замораживания-отогрева, %.
———- Стадии апоптоза AnnexinV AnnexinV+ AnnexinV+ AnnexinV
Группы ЯСК ' ———__ 7AAD 7AAD 7AAD+ 7AAD+
ЯСК цельной КК 9б.79± 0.71 1.18± 0-5 o.4i± 0.17 l.6l± O.18
ЯСК, выделенные декстраном 95-45± 0.25 l.68± 0-35 i.c>4± 0.58 l.83± O.41
ЯСК, обработанные ДМСО 95.11± 0.83 2.7б± 0-53 -H гч rr\ £ i.99± 0-55
ЯСК после замораживания - 79.28 ± 5-19± 2.16± i3-37±
отогрева 1.24 1.23 0.88 1.30
Примечание: данные представлены в виде M±SE.
После замораживания-отогрева ЯСК видно (табл.), что большая их часть оставалась неповрежденной (AnnexinV 7AAD -клетки).
Анализ поврежденных клеток в препарате показал, что у большей их части наблюдалось нарушение целостности мембраны и фрагментацией ДНК при сохранении в ней упорядоченности фосфолипидов, что характерно для стадии некроза (AnnexinV 7AAD+). Таким образом, видно, что основные потери клеток происходят в результате их быстрой гибели под влиянием повреждающих факторов замораживания-отогрева, на которые клетки не могут или же не успевают отреагировать с помощью своих защитных систем.
В физиологически полноценной клетке АФК образуются постоянно, но их уровень в норме невысокий, так как клетка инактивирует их с помощью антиоксидантной системы. Поэтому, АФК, образующиеся в процессе нормального клеточного метаболизма, в основном из-за небольшой утечки электронов в дыхательной цепи митохондрий, а также других окислительновосстановительных реакций в органеллах и цитоплазме, не вызывают повреждения клетки. Однако уровень АФК, превышающий защитные возможности клетки, может вызывать нарушения митохондрий и, как следствие, истощение АТФ и активацию ферментов лизосом, что приводит к разрушению клетки.
В связи с этим, в дальнейшей серии экспериментов была проведена оценка уровня АФК на всех этапах криоконсервирования. Поскольку в физиологически стабильной клетке содержание АФК находится на постоянном уровне, то любые изменения интенсивности флуоресценции в исследуемых группах ЯСК сопоставлялись с базовым уровнем АФК в нативных клетках цельной КК (контроль).
Проведенный анализ показал, что интенсивность флуоресценции DCF ЯСК после выделения существенно не отличалась от показателей цельной КК (рис.6).
10 000
Ой
о
л tu
Н О
о О
S 5
S
0
1
<D
Р 1 S
X
х
о
=г
о
о
о.
о
-i-
000
100
10
lili
Рис. 6. Интенсивность флуоресценции DCF в процессе криоконсервирования Примечание: 1 - ЯСК цельной КК, 2 - ЯСК, выделенные декстраном, 3 - ЯСК, обработанные ДМСО, 4 -ЯСК после замораживания-отогрева.
Обработка концентрата ЯСК криопротектором приводила к повышению уровня внутриклеточных АФК, что выражалось в изменении интенсивности свечения DCF в исследуемых клеточных препаратах по сравнению с уровнем до обработки.
Интенсивность флуоресценции DCF после криоконсервирования ЯСК была ниже по сравнению с показателями после обработки и соответствовала контрольным значениям в цельной КК. Данное снижение количества АФК в клетках после замораживания-отогрева может быть связано как с активацией ферментов антиоксидантной защиты (каталаза, GS-пероксидаза, СОД), в результате чего процесс образования АФК в клетке замедляется [9], так и с нарушением эстеразной энзиматической активности внутри клетки, в результате чего DCFH2-DA не преобразуется в активную форму DCFH2. Кроме того, возможно увеличение скорости рециклинга NADPH/NADP при участии NADP-оксидазы в данных экспериментальных условиях, что снижает цитозольную концентрацию АФК, поскольку известно, что клеточное окисление DCFH2-DA осуществляется двумя энзиматическими Н202 -генерирующими системами - глюкооксидазной и ксантиноксидазной [9, ю].
Заключение. Метод криоконсервирования ЯСК КК, основанный на применении 5% концентрации проникающего криопротектора ДМСО и специально разработанной четырехэтапной программы замораживания, позволяет минимизировать отрицательное воздействие физико-химических факторов криоконсервирования и сохранять до 85% CD45+- и до 94% СБз4+-клеток в жизнеспособном состоянии и не приводит к активации образования АФК в клетке. При этом основные потери ЯСК происходят за счет популяции гранулоцитов.
Оценка стадий апоптоза/некроза в ЯСК КК, криоконсервированных разработанным методом, показала, что 8о% клеток остаются неповрежденными (AnnexinV 7AAD -клетки), а основная гибель клеток происходит путем некроза (AnnexinV 7AAD+-клетки).
1. Long G.D., Laughlin M., Madan B. et al. Unrelated umbilical cord blood transplantation in adult patients // Biol. Blood Marrow Transplant. - 2003. -Vol. 9, № 12. - P. 772-780.
2. Gluckman E. Broxmeyer H.A., Auerbach A.D. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with
Vol. 321, № 17. - P. 1174-1178.
3. Абдулкадыров K.M., Романенко H.A. Заготовка плацентарной крови. Особенности ее клеточного состава и гемоиоэтического потенциала // Трансфузиология. - 2003. - Т. 4, № 1.- С. 15-334. Пат. 92227 Україна, МПК А 01 N 1/02. Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі стовбурових гемопоетичних клітин / Л.О. Бабійчук, В.І. Грищенко, Т.М. Гуріна та ін.; заявник та патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - №200814009; заявл. 05.12.2008; опубл. 11.10.2010, Бюл.№і9, 2010.
5. Бабийчук Л.А., Зубов П.М., Рязанцев В.В., Зубова О.Л. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток кордовой крови для клинической практики // Вестник неотложной и восстановительной медицины. - 2012. - Том 13, № 1. - С. 19-22.
6. Гольцев А.Н., Луценко Е.Д. Криоконсервирование как возможный метод оценки роли компонентного состава миелотрансплантата в проявлении функциональной активности кроветворных клеток // Пробл. криобиологии. - 1994. - № 1. - С. 3-13.
etic progenitor cells and accessory cells // Br. J. Haematol. - 1993. - Vol. 4, № 1. - P. 365-373.
8. Abrahamsen J.F., Bakken A.M., Bruserud O. et al. Flow cytometric measurement of apoptosis and necrosis in cryopreserved РВРС concentrates from patients with malignanL diseases // Bone Marrow Transplant. -2002. - Vol. 29. - P. 165-171.
9. Дамбаева С. В., Мазуров Д. В., Пинегин Б. В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека // Иммунология. -2001. - № 6. - С. 58-61.
by neutrophils: a graded response to membrane stimulation // J. Immunol.- 1983. - Vol. 130. - № 4. -P. 1910-1917.
Литература
Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling // N. Engl. J. Med. - 1989.
7. Cicuttini F.M., Loudovaris M., Boyd A.W. Interactions between purified human cord blood haemopoi-
10. Bass D. A., Parce J. W., Dechatelet L. R. et al. Flow cytometric studies of oxidative product formation
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STATE AND VIADILITY OF CORD DLOOD NUCLEATED CELLS AFTER CRYOPRESERVATION
Institute for Problems of Cryobiology the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov
0.0. MYKHAILOVA V.V. RYAZANTSEV
L.A. BABIJCHUK P.M. ZUBOV
The developed method for cord blood nucleated cells cryopreserva-tion, based on the application of 596 DMSO and new four-step freezing program, allows to minimize negative effects of physical and chemical factors of cryopreservation and save up to 8596 CD45+- and 9496 CD34+-cells in a viable state without causing reactive oxygen species activation. It was established that the major loss of nucleated cells occurred due to a population of granulocytes.
e-mail: mixolya@mail.ru
Keywords: cord blood, nucleated cells, cryopreservation, viability, reactive oxygen species, apoptosis.
