ПОЛУЧЕНИЕ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ НОРОВИРУСА (CALICIVIRIDAE: NOROVIRUS), СОДЕРЖАЩИХ БЕЛОК VP1 ЭНТЕРОВИРУСА ECHOVIRUS 30 (PICORNAVIRIDAE: ENTEROVIRUS: ENTEROVIRUS B)

Новиков Д. В.; Мелентьев Д. А.; Мохонов В. В.; Кашников А. Ю.; Новикова Н. А.; Лапин В. А.; Мохонова Е. В.; Новиков В. В.

НАУЧНАЯ СТАТЬЯ

DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-79 © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021

Получение вирусоподобных частиц норовируса (Caliciviridae: Norovirus), содержащих белок VP1 энтеровируса Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B)

Новиков Д.В.1, Мелентьев Д.А.12, Мохонов В.В.1, Кашников А.Ю.1, Новикова Н.А.1, Лапин В.А.12, Мохонова Е.В.1, Новиков В.В.12

1ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор), 603950, Нижний Новгород, Россия;

2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» Министерства науки и высшего образования (Минобрнауки) России, 603950, Нижний Новгород, Россия

Введение. Энтеровирусная (неполио) инфекция имеет широкое распространение во всём мире, регистрируется в форме спорадической заболеваемости и масштабных вспышек и может быть причиной такого тяжёлого поражения, как серозный менингит. Эпидемиологические исследования показали, что на территории Российской Федерации у больных энтеровирусным менингитом наиболее часто выявляется вариант энтеровируса (ЭВ) (Picornaviridae; Enterovirus) Echovirus 30 (Е30). Однако вакцины для профилактики заболевания, вызванного этим возбудителем, до настоящего времени не разработаны. Одним из перспективных современных направлений в плане создания вакцинных препаратов является использование вирусоподобных частиц (ВпЧ), в т.ч. химерных - содержащих биологические структуры вирусов, принадлежащих к различным видам. Цель настоящей работы - получение ВпЧ норовируса (Caliciviridae; Norovirus), содержащих на своей поверхности белок VP1 Е30.

Материал и методы. В работе использовали нуклеотидные последовательности генов белков VP1 норовируса генотипа GII.4 и VP1 вируса E30 генотипа h, циркулирующих на территории России. На их основе сконструирован белок SN-VP1E30, в котором оболочечный (S) и шарнирный (hinge) регионы VP1 норовируса слиты в одну молекулу с полноразмерным VP1 E30. Данный белок экспрессировали в E. coli, очищали методом аффинной хроматографии, после чего характеризовали с использованием электрофореза в поли-акриламидном геле (ПААГ) и иммуноблоттинга. ВпЧ визуализировали методом электронной микроскопии. Результаты. Белок SN-VP1E30 экспрессировался в E. coli в нерастворимой форме. Подбор условий для получения его растворимой формы показал, что использование высоких концентраций сахарозы существенно повышает эффективность ренатурации. При сравнении электрофоретической подвижности денатурированного и неденатурированного препаратов SN-VP1E30 установлено, что большинство мономеров образуют соединения со значительной молекулярной массой. С помощью электронной микроскопии показано, что ренатурированный белок SN-VP1E30 самопроизвольно формирует in vitro полые ВпЧ диаметром ~50 нм. Заключение. Показана возможность получения in vitro химерных ВпЧ норовируса, содержащих на своей поверхности белок VP1 циркулирующего на территории РФ варианта E30. Полученные частицы в дальнейшем могут быть использованы в разработке вакцинных препаратов для профилактики серозного менингита и других заболеваний, вызванных данным ЭВ.

Ключевые слова: вирусоподобные частицы; белок VP1 норовируса; белок VP1 энтеровируса Echovirus 30; химерные белки; вакцины

Для цитирования: Новиков Д.В., Мелентьев Д.А., Мохонов В.В., Кашников А.Ю., Новикова Н.А., Лапин В.А., Мохонова Е.В., Новиков В.В. Получение вирусоподобных частиц норовируса (Caliciviridae: Norovirus), содержащих белок VP1 энтеровируса Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B). Вопросы вирусологии. 2021; 66(5): 383-389. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-79

Для корреспонденции: Новиков Дмитрий Викторович, канд. биол. наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии, ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор), 603950, Нижний Новгород, Россия. E-mail: [email protected]

Участие авторов: Новиков Д.В. - проведение экспериментальных работ, написание текста статьи; Мелентьев Д.А. -проведение экспериментальных работ; Мохонов В.В. - проведение экспериментальных работ; Кашников А.Ю. - проведение экспериментальных работ; Новикова Н.А. - проведение экспериментальных работ, написание текста статьи; Лапин В.А. - проведение экспериментальных работ; Мохонова Е.В. - проведение экспериментальных работ; Новиков В.В. -проведение экспериментальных работ, написание текста статьи.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Поступила 27.08.2021 Принята в печать 07.10.2021 Опубликована 31.10.2021

ORIGINAL RESEARCH

ORIGINAL ARTICLE

DOI: https://doi.oig/10.36233/0507-4088-79

Construction of norovirus (Caliciviridae: Norovirus) virus-like particles containing VP1 of the Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B)

Dmitry V. Novikov1, Dmitriy A. Melentev12, Vladislav V. Mokhonov1, Alexander Yu. Kashnikov1, Nadezhda A. Novikova1, Vladislav A. Lapin12, Ekaterina V. Mokhonova1, Viktor V. Novikov12

1FSBI «Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor), 603950, Nizhny Novgorod, Russia;

2FSAEI HE «National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod» of the Ministry of Education and Science of Russia, 603950, Nizhny Novgorod, Russia

Introduction. Enterovirus (nonpolio) infection is widespread all over the world, registered as sporadic cases and large-scale outbreaks and can cause severe lesions such as serous meningitis. Epidemiological studies have shown that enterovirus (Picornaviridae; Enterovirus) variant Echovirus 30 (E30) is the most frequently detected variant in patients with enterovirus meningitis in the Russian Federation. However, no vaccines to prevent the disease caused by this pathogen have been developed so far. One of the promising modern trends in terms of creating vaccine preparations is the use of virus-like particles (VLPs), including chimeric ones containing the biological structures of viruses belonging to different species.

The aim of this work was to obtain norovirus (Caliciviridae; Norovirus) VLPs displaying enterovirus Echovirus E30 full-length VP1 on the surface.

Material and methods. The nucleotide sequences of VP1 protein of norovirus genotype GII.4 and VP1 E30 of genotype h circulating in Russia were used. The SN-VP1E30 protein was constructed, in which the shell (S) and the hinge regions of the norovirus VP1 are fused into one molecule with the full-length VP1 of the E30 virus. The protein was expressed in E. coli, purified using affinity chromatography, and characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and immunoblotting. VLPs were visualized by electron microscopy. Results. The SN-VP1E30 protein expressed in E. coli as insoluble form, so the conditions for SN-VP1E30 solublisation were defined. Sucrose has been shown to significantly increase the efficiency of renaturation. Electrophoretic mobility comparison of denatured and non-denatured SN-VP1E30 demonstrated that most monomers form high molecular weight compounds. Electron microscopy showed that renatured SN-VP1E30 spontaneously forms empty virus-like particles about 50 nm in diameter.

Conclusion. Chimeric protein SN-VP1E30 self-assemble into VLPs displaying the VP1 protein of E30 variant that is highly prevalent in Russia. Further immunological research is necessary to characterize VLPs potential for development of the vaccine for enteroviral meningitis prevention.

Key words: virus-like particles; norovirus VP1 protein; Echovirus 30 VP1 protein; chimeric proteins; vaccines For citation: Novikov D.V., Melentev D.A., Mokhonov V.V., Kashnikov A.Yu., Novikova N.A., Lapin V.A., Mokhonova E.V., Novikov V.V. Construction of norovirus (Caliciviridae: Norovirus) virus-like particles containing VP1 of the Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B). Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2021; 66(5): 383-389 (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-79

For correspondence: Dmitry V. Novikov, Ph.D. (Biol.), Associate Professor, Lead Researcher of the Immu-nochemistry Laboratory, FSBI «Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor), 603950, Nizhny Novgorod, Russia. E-mail: [email protected] Information about the authors: Novikov D.V., https://orcid.org/0000-0001-7049-6935 Melentev D.A., https://orcid.org/0000-0002-2441-6874 Mokhonov V.V., https://orcid.org/0000-0002-8542-5723 Kashnikov A.Yu., https://orcid.org/0000-0003-1033-7347 Novikova N.A., https://orcid.org/0000-0002-3710-6648 Lapin V.A., https://orcid.org/ 0000-0002-5905-5722 Mokhonova E.V., https://orcid.org/0000-0002-9742-7646 Novikov V.V., https://orcid.org/0000-0002-2449-7213

Contribution: Novikov D.V. - performing the experiments, writing of the text; Melentev D.A. - performing the experiments; Mokhonov V.V. - performing the experiments; Kashnikov A.Yu. - performing the experiments; Novikova N.A. -performing the experiments, writing of the text; Lapin V.A. - performing the experiments; Mokhonova E.V. - performing the experiments; V.V. Novikov - performing the experiments, writing of the text.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Funding. The research was funded by the State budget. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 27 August 2021 Accepted 07 October 2021 Published 31 October 2021

Введение

Энтеровирусы (ЭВ) (род Enterovirus, семейство Pi-cornaviridae, порядок Picornavirales) - многочисленная группа безоболочечных РНК-содержащих вирусов, циркуляция которых показана во всём мире [1]. Неполиомиелитные ЭВ способны вызывать различные по клинической картине и степени тяжести заболевания преимущественно у детей первых лет жизни. Энтеровирусная инфекция может проявляться в форме экзантемы полости рта и конечностей (hand, foot and mouth disease, HFMD), герпангины, менингита, менингоэнцефалита, энцефалита, полинейропатии, вялого паралича, миокардита и др. Тяжесть течения болезни варьирует от умеренного ухудшения самочувствия с субфебрильным повышением температуры тела до мультисистемных проявлений с поражением сердечно-сосудистой и центральной нервной систем. Часто ЭВ имеют эпидемическое распространение, охватывающее большие группы детского населения [2].

На основе генетических характеристик и антигенных свойств ЭВ разделены на 4 вида (A-D), среди которых наиболее распространены вирусы, относящиеся к видам Enterovirus A (ЭВ-А) и Enterovirus В (ЭВ-В) [3]. Из них ЭВ-А (Enterovirus A71; Coxsackievirus A6, A10, A16 и др.) наиболее часто вызывают HFMD у детей младшего возраста. Подавляющее большинство заболевших полностью выздоравливают через 7-10 сут. Однако в некоторых случаях развиваются выраженные осложнения, вызванные поражением центральной нервной системы; описаны единичные летальные исходы. Представители вида ЭВ-В (Coxsackievirus B3, В5; Echovirus 25, 30) чаще связаны с такими серьёзными заболеваниями, как миокардит, асептический менингит, энцефалит и гепатит, нередко приводящими к инвалидности или смерти [4]. В этой группе особо выделяются вирусы ECHO (англ. enteric cytopathic human orphan viruses, букв. - кишечные цитопатогенные человеческие орфанные вирусы), поскольку они являются причиной асептического менингита и энцефалита не только у детей, но и у взрослых [5].

ЭВ регистрируются повсеместно, однако в странах Юго-Восточной Азии наибольшее эпидемическое значение имеют ЭВ-А, а в государствах, расположенных на территориях Европы и Северной Америки, - ЭВ-В [6, 7]. Эпидемиологические исследования распространённости ЭВ на территории Российской Федерации показали, что в последнее время у детей и взрослых, больных энтеровирусным менингитом, наиболее часто выявляется Echovirus 30 (E30) [8].

В мировой практике с целью профилактики энтеро-вирусной инфекции разрабатываются вакцины главным образом для предотвращения экзантемных поражений, вызванных Enterovirus А71, Coxsackievirus А6, А10, А16. В отношении ЭВ-В подобные разработ-

ки направлены на Coxsackievirus В3, являющийся основной причиной миокардита [9]. В то же время в мире и в России часто регистрируются эпидемические подъёмы заболеваемости, обусловленные вариантом E30 [10], однако вакцина для профилактики вызываемых им заболеваний отсутствует.

Ранее была предложена универсальная платформа на основе белка VP1 норовируса (Caliciviridae; Norovirus) для презентации вирусных антигенов (АГ). Такой подход позволяет получать вирусоподобные частицы (ВпЧ), на поверхности которых представлены различные АГ, пригодные для использования в составе вакцинных препаратов. Показано, что полученные в E. coli белки, состоящие из аминокислотной последовательности S-домена VP1, слитого в одну молекулу с фрагментами аналогичных последовательностей VP8 ротавируса (Reoviridae; Sedoreovirinae: Rotavirus), гемагглютинина вируса гриппа А (Orthomyxoviridae: Influenza A virus) (H7N9) или капсидного белка вируса гепатита Е (Hepeviridae; Hepevirus: Hepatitis E virus), способны формировать ВпЧ, имеющие на своей поверхности добавленные пептиды. Иммунизация лабораторных животных химерными структурами, созданными согласно данному принципу, приводила к продукции нейтрализующих антител в высоких титрах [11, 12]. Цель настоящей работы - получение ВпЧ норовируса, содержащих на поверхности белок VP1 Е30.

Материал и методы

Конструирование слитого белка. В работе использовали нуклеотидные последовательности генов белков VP1 норовируса генотипа GII.4 (GenBank No. MZ958411) и VP1 E30 генотипа h (GenBank No. КР090772), штаммов, циркулирующих на территории РФ. Конструирование слитого гена проводили на основе анализа нуклеотидных последовательностей с использованием пакета программ Lasergene (Dnastar, Inc., США). Оптимизацию кодонов осуществляли на основе информации, представленной в базе данных Codon usage database (http://www.kazusa.or.jp/ codon/). ДНК синтезировали в ООО «Люмипроб РУС» (Россия) и клонировали в составе плазмиды pET22b (Novagen, США).

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка. Для экспрессии рекомбинантного белка использовали штамм E. coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen, США), клетки которой трансформировали плазмидой, кодирующей рекомбинантный белок, с применением мультипоратора Eppendorf (Германия). E. coli выращивали при 37 °С в среде LB (lysogeny broth) (1% триптон, 2% дрожжевой экстракт, 0,9% NaCl и 100 мкг/мл ампициллина) до оптической плотности 0,7. Экспрессию индуцировали добавлени-

ORIGINAL RESEARCH

ем изопропил^^-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до концентрации 0,5 мМ, после чего культуру инкубировали на протяжении 6 ч при 30 °С. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, однократно отмывали в 0,9% NaCl и лизировали с использованием реагента BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen, США) согласно рекомендациям производителя. Лизат разделяли центрифугированием при 12 000 g в течение 15 мин на растворимую и осадочную белковые фракции. Последнюю с целью очистки рекомбинантного белка растворяли в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, 6 М гуанидина гидрохлорида, 150 мМ NaCl (pH 7,5), и затем выполняли аффинную хроматографию с использованием сорбента IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Швеция) согласно рекомендациям производителя для денатурирующих условий. Ренатурацию белка осуществляли методом диализа против 3000 объёмов буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl и 20%, 10% или 5% сахарозы (C12H22O11).

Определение концентрации белка. Концентрацию белка в растворе определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, США) при длине волны 280 нм. Эффективность ренатурации белка оценивали путём сравнения концентрации растворимого белка до и после диализа. Значение концентрации до диализа принимали за 100%.

Электрофорез в полиакриламидном геле и имму-ноблоттинг Все этапы экспрессии и очистки реком-бинантного белка контролировали методом электрофореза белков в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Денатурацию белков проводили в течение 5 мин при 100 °С в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (pH 6,8), 100 мМ дитиотреитола, 2% ДСН и 4 М мочевины. При исследовании олигомерного состояния белки наносили на гель в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (pH 6,8), 2% ДСН и 20% глицерина. Результаты визуализировали окрашиванием геля с помощью красителя Coomassie brilliant blue R-250 (Imperial Chemical Industries PLC, Великобритания). Использовали маркёр молекулярных масс Thermo Scientific PageRuler Unstained Protein Ladder (10 to 200 kDa) (ThermoFisher Scientific). Интенсивность окрашивания белковых полос оценивали при помощи компьютерной программы C-DiGit (LI-СОИ, США). Для проведения иммуноблоттинга белки переносили из геля на мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ; PVDF) (ThermoFisher Scientific) посредством системы влажного переноса (Bio-Rad, США). Контроль переноса и определения молекулярной массы осуществляли с использованием маркёра PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (ThermoFisher Scientific), представляющего собой смесь 9 белков (от 10 до 250 кДа), окрашенных синим, оранжевым и зелёным. Мембрану блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА; BSA) в фосфатно-солевом буфере (phosphate buffered saline, PBS) и инкубировали с антителами anti-His-HRP:GG1-6F4.3.2 (Miltenyi Biotec, США). После этого мембрану окрашивали в растворе субстрата SuperSignal West

Dura Extended Duration Substrate kit (ThermoFisher Scientific) и измеряли хемилюминесценцию при помощи сканера C-DiGit Blot Scanner (LI-COR), также в соответствии с рекомендациями производителей.

Электронная микроскопия. В экспериментах использовали трансмиссионную электронную микроскопию. На электронно-микроскопическую медную сетку, покрытую парлодиевой плёнкой, наносили 5 мкл раствора белка в концентрации 100 мкг/ мл, отмывали водой от несвязавшихся компонентов и окрашивали водным раствором 2% уранилацетата (рН 4,5). Образцы просматривали с помощью электронного микроскопа просвечивающего типа НТ7700 (Hitachi, Япония).

Результаты

На основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих белки VP1 норовируса генотипа GII.4 и VPl вируса E30 генотипа h, создана генетическая конструкция SN-VP1E30, состоящая из слитых в одну молекулу последовательностей, кодирующих оболочечный (S) и шарнирный (hinge) регионы VP1 норовируса, полноразмерный белок VP1 E30 и последовательности, кодирующей 6 молекул гистидина (His, H). Структурная организация слитого белка SN-VP1E30 схематически показана на рис. 1. Для более эффективного образования ВпЧ триплеты, кодирующие аминокислоты в позициях 57, 58 и 136 S-региона VP1 норо-вируса, заменены на нуклеотиды, кодирующие цисте-ин (Cys, C), как предложено ранее [11]. Нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в E. coli и помещена под контроль регуляторных элементов бактериофага Т7 в составе плазмиды рЕТ22Ь.

Результаты экспрессии белка SN-VP1E30 в E. coli представлены на рис. 2. После индукции в E. coli нарабатывался дополнительный белок (рис. 2, а). Методом иммуноблоттинга с использованием мо-ноклональных антител против последовательности из 6 молекул гистидина подтверждена экспрессия Sn-VP1E30 (рис. 2, б). При сравнении набора белков E. coli в растворимой и осадочной фракциях установлено, что SN-VP1 присутствовал в нерастворимой форме (рис. 2, в). В связи с этим осадочную белковую фракцию растворяли в буфере, содержащем 6 М гуанидина гидрохлорида, и выделяли SN-VP1E30, содержащий гистидиновый «хвост», методом аффинной хроматографии. Электрофоретическая подвижность очищенного искомого белка совпадала с расчётной (рис. 2, г).

Для ренатурации белка SN-VP1E30 использовали предложенный ранее метод стабилизации ВпЧ норовируса. J. Kissmann и соавт. показали, что высокие концентрации различных сахаров оказывают стабилизирующий эффект на вторичную и третичную структуру мономеров ВпЧ этого вируса [13]. В нашем исследовании наблюдался сходный эффект высоких концентраций сахаров по отношению к белку SN-VP1. Диализ против содержащего 20% сахарозы буферного раствора позволил ренатурировать до 97% количества S-VP1 (рис. 3).

Ренатурированный в 20% сахарозе препарат исследовали на способность мономеров SN-VP1E30 к образованию межмолекулярных связей. Сравнение электрофоретической подвижности денатурированного и неденатурированного препаратов исследуемого белка показало, что большинство мономерных структур образуют соединения со значительной молекулярной массой, детектируемые в начале геля (рис. 4, а). Способность мономеров SN-VP1E30 формировать ВпЧ изучали методом электронной микроскопии, при проведении которой в препарате белка обнаружены сферические ВпЧ размером ~50 нм. Данные частицы были окрашены изнутри (рис. 4, б),

что характерно для полых образований. Полученные результаты свидетельствуют о способности химерной белковой структуры, состоящей из S-фрагмента VP1 норовируса и полноразмерного белка VP1 энте-ровируса Е30, к самосборке.

Обсуждение

Несмотря на широкое распространение вируса Е30 и его доказанную связь с возникновением энтерови-русного менингита и других заболеваний, данный вирус является одним из наименее изученных представителей ЭВ. Основные представления о строении их вириона и жизненном цикле получены на примере

57 кДа 57 kDa

213

10 -

287

Shell (S)

V

Норовирус Norovirus

Hinge

VP1

V

Echovirus 30 Е30

6

X ►

а.к. a.a.

His

J

Рис. 1. Схема организации слитого белка SN-VP1E30. Shell (S) - амино-терминальный домен белка VP1 норовируса; Hinge - шарнирный регион VP1 норовируса; VP1 - полноразмерный белок VP1 вируса

Е30; His - последовательность из 6 гистидинов. Fig. 1. Scheme of the fusion protein. Shell (S), norovirus VP1 amino-terminal domain; Hinge, norovirus VP1 hinge region; VP1, E30 virus full-length VP1 protein; His, sequence of six six histidines .

Рис. 2. Экспрессия белка SN-VP1E30 в E. coli.

а) - сравнение белков E. coli до (1) и через 6 ч после (2) индукции экспрессии; б) - подтверждение экспрессии белка SN-VP1E30 иммуноблот-тингом; в) - состав белков E. coli в растворимой (1) и нерастворимой (2) фракциях; г) - электрофоретическая подвижность очищенного SN-VP1E30 (1); М - маркёры молекулярной массы.

Fig. 2. Expression of SN-VP1E30 protein in E. coli.

a), comparison of E. coli proteins before (1) and 6 hours after induction of expression (2); b), confirmation of SN-VP1E30 protein expression by immu-noblotting; c), E. coli protein composition in soluble (1) and insoluble (2) fractions; d), electrophoretic mobility of purified SN-VP1E30 (1); M, molecular weight markers.

Рис. 3. Зависимость эффективности ренатурации белка SN-VP1E30 от концентрации сахарозы. Fig. 3. The efficiency of SN-VP1E30 protein renaturation depending on the sucrose concentration.

ORIGINAL RESEARCH

Рис. 4. Самосборка белка SN-VP1E30.

а) - сравнение электрофоретической подвижности денатурированного (1) и неденатурированного (2) SN-VP1E30; б) - вирусоподобные частицы, образованные белком SN-VPlE30; электронная микрофотография, увеличение х12 000.

Fig. 4. Self-assembly of the SN-VP1E30 protein.

a), comparison of the electrophoretic mobility of denatured (1) and non-denatured (2) SN-VP1E30; b), virus-like particles formed by the SN-VP1E30 protein; electron microphotograph, 12,000x magnification.

Enterovirus А71, Coxsackievirus А16 и А6. К настоящему времени известно, что основной капсидный белок VP1 этих вирусов формирует поверхностные структуры вириона, отвечающие за распознавание рецептора на клетке. На поверхности VP1 ЭВ обнаружены как конформационные, так и линейные нейтрализующие эпитопы, что делает данный белок основным кандидатом для разработки типоспецифических вакцин [14].

Поскольку основной группой риска заболеваний, вызванных ЭВ, являются дети младшего возраста, разработка безопасных вакцинных препаратов на основе пептидов, содержащих нейтрализующие эпитоп-ные последовательности, считается привлекательным и многообещающим подходом. Однако по сравнению с вакцинами на основе убитых или аттенуированных вирусов небольшие синтетические пептиды обладают слабой иммуногенностью [15]. В то же время ВпЧ имеют морфологию вириона и являются оптимальными системами доставки, обеспечивающими презентацию нейтрализующих эпитопов иммунной системе. Обладая способностью эффективно взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками, указанные частицы максимизируют иммуногенный потенциал и защитные свойства антител [16].

На сегодняшний день разработано множество подходов использования ВпЧ в качестве векторов для презентации АГ [12, 17, 18]. Нами сконструированы химерные ВпЧ, построенные на основе белка капсида норовирусов. Выбор данной модели связан со способностью норовирусных ВпЧ вызывать сильный иммунный ответ на слизистой оболочке, что даёт перспективу для разработки эффективной мукозаль-ной вакцины [19]. Путём генетических манипуляций в белке VP1 норовируса представленный на поверхности вириона Р-домен (англ. protruding - выступающий) заменён на полноразмерный VP1 вируса Е30. Поскольку поверхностные белки вириона ЭВ не гли-

козилируются, экспрессия рекомбинантного белка осуществлялась в клетках E. coli. Полученный слитый белок использован для сборки ВпЧ in vitro.

Стратегия получения подобных частиц ЭВ in vivo в клетках насекомых (Insecta) или дрожжей (Ascomycota, Basidiomycota) для последующего использования в качестве АГ в составе вакцин описана для Enterovirus А71, вируса Coxsackievirus А16 и Enterovirus D68 [20, 21]. При использовании такого подхода капсидные белки собираются в ВпЧ внутри клеток-хозяев. Это приводит к инкапсулированию внутрь ВпЧ ассоциированных с клеткой-хозяином загрязнений, потенциально способных вызвать нежелательный иммунный ответ, в т.ч. аллергические реакции [22]. В нашей работе показана возможность самосборки in vitro химерных ВпЧ, презентирующих на своей поверхности VP1 Е30. Для сборки используется очищенный белок, что препятствует встраиванию в частицу нежелательных примесей. Кроме этого, методология сборки in vitro предоставляет возможность смешивать в составе частицы различные белки, что в перспективе позволит получать ВпЧ, содержащие АГ от разных генотипов Е30 либо смесь белков ЭВ разных типов в одной частице. Апробированная в данной работе методика создания химерных ВпЧ на основе платформы из капсидного белка норовируса открывает возможности разработки поливалентной энтеровирусной вакцины, а также быстрой замены АГ в случае появления новых эпидемических вариантов ЭВ.

Заключение

В настоящей работе получены ВпЧ, состоящие из химерной рекомбинантной белковой структуры, включающей слитые с полноразмерным белком VP1 энтеровируса E30 S-домен и шарнирную часть белка VP1 норовируса. Поскольку поверхностные белки ви-риона ЭВ не гликозилируются, для наработки реком-бинантного белка применена одна из самых простых и недорогих систем экспрессии - E. coli. Использование способности химерного белка к самосборке в условиях in vitro открывает перспективы формирования ВпЧ, содержащих АГ от разных генотипов вируса Е30 или смесь белков ЭВ разных типов. Последующее изучение свойств сконструированных химерных ВпЧ позволит оценить их потенциал в качестве возможного прототипа вакцины.

ЛИТЕРАТУРА

1. Brouwer L., Moreni G., Wolthers K.C., Pajkrt D. World-wide prevalence and genotype distribution of enteroviruses. Viruses. 2021; 13(3): 434. https://doi.org/10.3390/v13030434

2. Mao Q., Wang Y., Bian L., Xu M., Liang Z. EV-A71 vaccine licensure: a first step for multivalent enterovirus vaccine to control HFMD and other severe diseases. Emerg. Microbes Infect. 2016; 5(7): e75. https://doi.org/10.1038/emi.2016.73

3. Zell R., Delwart E., Gorbalenya A.E., Hovi T., King A.M.Q., Knowles N.J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Picornaviridae. J. Gen. Virol. 2017; 98(10): 2421-2. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000911

4. Xu W., Liu C., Yan L., Li J., Wang L., Qi Y., et al. Distribution of enteroviruses in hospitalized children with hand, foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications. Virol. J. 2012; 9: 8. https://doi.org/10.1186/1743-422X-9-8

5. Kupila L., Vuorinen T., Vainionpaa R., Hukkanen V., Marttila R.J., Kotilainen P. Etiology of aseptic meningitis and encephalitis in

an adult population. Neurology. 2006; 66(1): 75-80. https://doi. org/10.1212/01.wnl.0000191407.81333.00

6. Chang L.Y., Lin H.Y., Gau S.S., Lu C.Y., Hsia S.H., Huang Y.C., et al. Enterovirus A71 neurologic complications and long-term sequelae. J. Biomed. Sci. 2019; 26(1): 57. https://doi.org/10.1186/ s12929-019-0552-7

7. Abedi G.R., Watson J.T., Pham H., Nix W.A., Oberste M.S., Gerber S.I. Enterovirus and human parechovirus surveillance - United States, 2009-2013. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2015; 64(34): 940-3. https://doi.org/10.15585/mmwr.mm6434a3

8. Голицына Л.Н., Зверев В.В., Селиванова С.Г., Пономарёва Н.В., Кашников А.Ю., Созонов Д.В., и др. Этиологическая структура энтеровирусных инфекций в Российской Федерации в 20172018 гг. Здоровье населения и среда обитания. 2019; (8): 30-8. https://doi.org/10.35627/2219-5238/2019-317-8-30-38

9. He X., Zhang M., Zhao C., Zheng P., Zhang X., Xu J. From monovalent to multivalent vaccines, the exploration for potential preventive strategies against hand, foot, and mouth disease (HFMD). Virol. Sin. 2021; 36(2): 167-75. https://doi.org/10.1007/s12250-020-00294-3

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

10. Lema C., Torres C., Van der Sanden S., Cisterna D., Freire M.C., Gomez R.M., et al. Global phylodynamics of Echovirus 30 revealed differential behavior among viral lineages. Virology. 2019; 531: 7992. https://doi.org/10.1016/j.virol.2019.02.012

11. Xia M., Huang P., Sun C., Han L., Vago F.S., Li K., et al. Bio-engineered norovirus S60 nanoparticles as a multifunctional vaccine platform. ACS Nano. 2018; 12(11): 10665-82. https://doi. org/10.1021/acsnano.8b02776

12. Tan M., Huang P., Xia M., Fang P.A., Zhong W., McNeal M., et al. Norovirus P particle, a novel platform for vaccine development and antibody production. J. Virol. 2011; 85(2): 753-64. https://doi. org/10.1128/JVI.01835-10

13. Kissmann J., Ausar S.F., Foubert T.R., Brock J., Switzer M.H., Det-zi E.J., et al. Physical stabilization of Norwalk virus-like particles. J. Pharm. Sci. 2008; 97(10): 4208-18. https://doi.org/10.1002/jps.21315

14. Yuan J., Shen L., Wu J., Zou X., Gu J., Chen J., et al. Enterovirus A71 proteins: Structure and function. Front. Microbiol. 2018; 9: 286. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00286

15. Dudek N.L., Perlmutter P., Aguilar M.I., Croft N.P., Purcell A.W. Epitope discovery and their use in peptide based vaccines. Curr. Pharm. Des. 2010; 16(28): 3149-57. https://doi. org/10.2174/138161210793292447

16. Mohsen M.O., Gomes A.C., Vogel M., Bachmann M.F. Interaction of viral capsid-derived virus-like particles (VLPs) with the innate immune system. Vaccines. 2018; 6(3): 37. https://doi.org/10.3390/ vaccines6030037

17. Anggraeni M.R., Connors N.K., Wu Y., Chuan Y.P., Lua L.H., Middel-berg A.P. Sensitivity of immune response quality to influenza helix 190 antigen structure displayed on a modular virus-like particle. Vaccine. 2013; 31(40): 4428-35. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2013.06.087

18. Rivera-Hernandez T., Hartas J., Wu Y., Chuan Y.P., Lua L.H., Good M., et al. Self-adjuvanting modular virus-like particles for mucosal vaccination against group A streptococcus (GAS). Vaccine. 2013; 31(15): 1950-5. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2013.02.013

19. Tacket C.O., Sztein M.B., Losonsky G.A., Wasserman S.S., Estes M.K. Humoral, mucosal, and cellular immune responses to oral Norwalk virus-like particles in volunteers. Clin. Immunol. 2003; 108(3): 241-7. https://doi.org/10.1016/s1521-6616(03)00120-7

20. Zhao H., Li H.Y., Han J.F., Deng Y.Q., Zhu S.Y., Li X.F., et al. Novel recombinant chimeric virus-like particle is immunogenic and protective against both enterovirus 71 and coxsackievirus A16 in mice. Sci. Rep. 2015; 5: 7878. https://doi.org/10.1038/srep07878

21. Zhang C., Zhang X., Zhang W., Dai W., Xie J., Ye L., et al. En-terovirus D68 virus-like particles expressed in Pichia pastoris potently induce neutralizing antibody responses and confer protection against lethal viral infection in mice. Emerg. Microbes Infect. 2018; 7(1): 3. https://doi.org/10.1038/s41426-017-0005-x

22. Le D.T., Müller K.M. In vitro assembly of virus-like particles and their applications. Life (Basel). 2021; 11(4): 334. https://doi. org/10.3390/life11040334

REFERENCES

1. Brouwer L., Moreni G., Wolthers K.C., Pajkrt D. World-wide prevalence and genotype distribution of enteroviruses. Viruses. 2021; 13(3): 434. https://doi.org/10.3390/v13030434

2. Mao Q., Wang Y., Bian L., Xu M., Liang Z. EV-A71 vaccine licensure: a first step for multivalent enterovirus vaccine to control HFMD and other severe diseases. Emerg. Microbes Infect. 2016; 5(7): e75. https://doi.org/10.1038/emi.2016.73

3. Zell R., Delwart E., Gorbalenya A.E., Hovi T., King A.M.Q., Knowles N.J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Picornaviridae. J. Gen. Virol. 2017; 98(10): 2421-2. https://doi.org/f0.f099/jgv.0.0009ff

4. Xu W., Liu C., Yan L., Li J., Wang L., Qi Y., et al. Distribution of enteroviruses in hospitalized children with hand, foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications. Virol. J. 2012; 9: 8. https://doi.org/10.1186/1743-422X-9-8

5. Kupila L., Vuorinen T., Vainionpaa R., Hukkanen V., Marttila R.J., Kotilainen P. Etiology of aseptic meningitis and encephalitis in an adult population. Neurology. 2006; 66(1): 75-80. https://doi. org/10.1212/01.wnl.0000191407.81333.00

6. Chang L.Y., Lin H.Y., Gau S.S., Lu C.Y., Hsia S.H., Huang Y.C., et al. Enterovirus A71 neurologic complications and long-term sequelae. J. Biomed Sci. 2019; 26(1): 57. https://doi.org/10.1186/ s12929-019-0552-7

7. Abedi G.R., Watson J.T., Pham H., Nix W.A., Oberste M.S., Gerber S.I. Enterovirus and human parechovirus surveillance - United States, 2009-2013. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2015; 64(34): 940-3. https://doi.org/10.15585/mmwr.mm6434a3

8. Golitsyna L.N., Zverev V.V., Selivanova S.G., Ponomareva N.V., Kashnikov A.Yu., Sozonov D.V., et al. Etiological structure of enterovirus infection in the Russian Federation in 2017-2018 [Etiologich-eskaya struktura enterovirusnykh infektsiy v Rossijskoy Federatsii v 2017-2018 gg]. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya. 2019; (8): 308. https://doi.org/10.35627/2219-5238/2019-317-8-30-38 (in Russian)