CC BY
34
УДК 581.1
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2005, вып. 4
А. А. Кирпичникова, Е. Л. Рудашевская, Ю. В. Михайлова, М. Ф. Шишова
ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЗИКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ ПЛАЗМАЛЕММЫ ИЗ КЛЕТОК КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ТАБАКА VBI-0 И АНАЛИЗ ЕЕ АТФАЗНОЙ АКТИВНОСТИ*
Н+-АТФаза плазмалеммы (ПМ) растительных клеток относится к АТФазам Р-типа, является М§2"-зависимой, К+-стимулируемой [23, 25]. Хорошо известно, что данный фермент выполняет широкий спектр функций, например, участвует в поддержании внутриклеточного рН, регулирует транспортные процессы на мембране, создавая электрохимический градиент протонов на ПМ [3, 4]. ЬГ-АТФаза является мишенью для целого ряда внешних и внутренних факторов, в том числе и регуляторов роста [26, 29]. Хорошо известно, что протонная помпа является одним из ключевых ферментов, обеспечивающих рост растяжением [10, 13]. Так называемый «кислый рост» является характерной особенностью растительных клеток и может рассматриваться в качестве этапа дифференциации. Ряд экспериментальных данных указывает, что наибольшей интенсивностью роста растяжением характеризуются клетки после завершения этапа деления [5, 6]. Процесс роста является необратимым, и его интенсивность резко снижается с возрастом клетки. В связи с тем, что Н+-АТФаза ПМ играет огромную роль в регуляции интенсивности растяжения, представляет большой интерес, как меняются свойства самого фермента в ходе развития клетки.
В качестве модельного объекта для исследования изменения транспортных и ферментативных свойств Н+-АТФаз ПМ на различных этапах онтогенеза довольно часто используют клетки колеоптилей злаковых. Данный орган представляет собой модифицированный лист, осуществляющий защитную функцию на этапе ювенильного развития проростка. Особенностью колеоптиля является ограниченный срок его физиологической функции, в связи с чем можно предположить, что большинство составляющих его паренхимных клеток находятся на сходной стадии онтогенеза. Ранее нами было показано, что наибольшей гидролитической активностью фермента характеризовались клетки колеоптилей четы-рехсуточных этиолированных проростков кукурузы [8]. Тем не менее известно, что парен-химные клетки колеоптиля кукурузы переходят от деления к интенсивному росту растяжением несколько ранее - на третьи сутки развития [6]. По-видимому, отсутствие прямой зависимости интенсивности роста от активности фермента, возможно, связано с тем, что в нативном органе даже паренхимные клетки могут в значительной степени отличаться интенсивностью своего метаболизма из-за различия в этапах онтогенеза.
В данной работе в качестве модельного объекта нами была использована каллусная культура клеток, которая в отличие от нативных органов представляет собой более однородный биологический материал, полученный из одного типа клеток. Культура клеток табака VBI-0 (Nicotiana tabacum L. cv. Virginia Bright Italia) была получена из клеток паренхимы стебля [33]. Особенностью данной культуры является наличие четко выраженного этапа роста растяжением, наступающего после окончания деления, что характерно для клеток интактных растений [33]. Хорошо известно, что стадии развития в культуре регулируются балансом питательных веществ и фитогормонов, главным образом, ауксином и цито-кинином. Безусловно, в каллусной форме культура представлена совокупностью клеток с несинхронизированным развитием, тем не менее клетки сохраняют способность к росту растяжением. В связи с рядом преимуществ (легкость наращивания биологической массы)
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 03-04-48167).
© А. А. Кирпичникова, Е. Л. Рудашевская, Ю. В. Михайлова, М. Ф. Шишова, 2005
именно каллус был использован для отработки методических подходов получения очищенной
фракции плазмалеммы и последующего анализа, гидролитической активности ГГ-АТФазы ПМ клеток VBI-0.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служила этиолированная кал-, лусная культура клеток табака VBI-0 (Nicotiana tabacitjn L. cv. Virginia Bright Italia), выращенная в чашках Петри на модифицированной среде Мурасиге-Скуга при 25 °С. Пассирование каллуса на свежую среду проводили через каждые 3 недели. В работе использовали клетки каллуса в возрасте 3 недель. Общий вид клеток культуры VB1-0, использованных в работе, представлен на рис. i.
_____ Получение везикулярной фрак-
/ : Ции плазмалеммы. Микросомальную
^"•ч/ " ' фракцию получали дифференциальным
V-'. ' -^v центрифугированием, как описано ранее
' ) [2, 9]. Далее проводили разделение мем-
бран в водной двухфазной системе поли-■ этиленгликоля/декстрана, согласно. ме-
£?v ^¿Ур WÍ г тодике Ларсона [27, 20]. Общую микро-
^f^^- у I 1 сомальную фракцию, гомогенизирован-Tj ¿гдР I Í НУЮ в фосфатном буфере (5 ммоль/л).
-J-Щ / 'V содержащем 330 ммоль/л сахарозы и
f^j^^SS^^b^^"^ f i 3 ммоль/л КС1, вносили в двухфазную ) l'-'J смесь- содержащую 6,2, 6,3 или 6,4% ~ V' jr^C\ Í *Д декстрана и полиэтиленгликоля соответ-
,/Г j, ''jr^ ственно (исходные растворы: 20% декст-
ран Т-500. 40% ПЭГ, 330 ммоль/л саха-•"'Vjv •"• -• С vK\ розу, 3 ммоль/л KCI, 5 ммоль/л КН2Р04).
,■ W" X. i После тщательного перемешива-
J^j^^K^s^ ния полученную фазовую систему цен-
\ ^у?**?/ трифугировали 3 мин при 1500 g. После ___ / y ' 3 разделения верхнюю фазу, содержащую
ПЭГ и плазмалемму. переносили на Рис. I. Микрофотография клеток каллусной культуры новую нижнюю фазу. Такую очистку табака VBI-0, используемой для получения везикулярной фрак- проводили 3 раза. Затем верхнюю фазу ции плазмалеммы. разбавляли в три раза средой осаждения
(300 ммоль/л сахарозы на 10 ммоль/л Tris - Mes, рН 7,2) и центрифугировали в течение часа при 95 000 g для концентрирования везикул и удаления избытка среды. Полученный осадок везикул ресуспендировали в среде переосаждения из расчета 150 мкл среды на 15 г ткани. Выделение мембран проводилось при температуре+4 "С.
Определение АТФазной активности везикулярной фракции мембран. Полученную суспензию разбавляли раствором 300 ммоль/л сахарозы на 10 ммоль/л Tris - Mes, рН 7,2. Полную активность фермента определяли в присутствии 0,05%-ного бридж 58. АТФазную реакцию фермента везикулярной фракций плазмалеммы проводили g инкубационной среде следующего состава: 30 ммоль/л Tris-Mes. рН 6,0, 3 ммоль/л АТФ, 50 ммоль/л КС1, 3 ммоль/л MgCk Работу фермента начинали добавлением к инкубационной среде 0,2 мл мембранного препарата, содержащего 1-5 мкг белка. Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37 °С на шейкере. Реакцию останавливали 20%-ной трихлоруксусной кислотой на ледяной бане. Активность АТФазы мембранной фракции определяли спектрофотометри-чески по количеству неорганического фосфата (Фн), накапливающегося в ходе ферментативной реакции гидролиза АТФ. Для определения содержания Фн использовали молибденовый реактив, согласно методу Линдемана с модификациями (Lindeman. 1958, цит. по: [9]). Изменения интенсивности окрашивания проводили на спектрофотометре Spekol 211 при длине волны 750 нм. АТФазную активность препарата выражали в мкмоль Фн/мг белка в час. Определение содержания белка в мембранной фракции проводили по микрометоду М. Bradford [11].
Для определения чистоты полученной фракции плазмалеммы и отсутствия в ней примсссй других мембран проводили ингибиторный анализ. Были использованы следующие ингибиторы: Na3V04 (ортованадат Na, 410"2 моль/л) - специфичный ингибитор Н+-АТФазы плазмалеммы; ионы
N03~ (KN03, 50 ммоль/л), ингибирующие Н+-АТФазу тонопласта; олигомицин (0,5 мг/мл) - специфический ингибитор АТФаз митохондрий. Оценка соотношения инвертированных и нормально ориентированных везикул полученной фракции определяли с помощью бридж 58. Активность инвертированных везикул выражали в процентах от общей активности препарата.
Опыты проводили в 3—4 биологических и 3-4 аналитических повторностях. На рисунках приведены средние арифметические значения и ошибки среднего.
Результаты исследований и их обсуждение. На рис. 1 представлен общий вид клеток культуры табака VBI-0. Кусочек каллуса предварительно ресуспендировали и анализировали с помощью светового микроскопа. Полученные данные об отсутствии синхронизации этапов роста клеток и сохранении способности к росту растяжением полностью согласуются с литературными данными. Можно видеть, что клетки каллусной культуры находятся на разных этапах развития, о чем свидетельствуют различия размеров клеток. Тем не менее в возрасте трех недель длина большинства клеток многократно превосходит их ширину и составляет в среднем 90 мкм, что свидетельствует о завершении роста растяжением. Основной структурой клеток каллуса является вакуоль, заполняющая до 95% объема клетки. На фотографии четко видны тяжи цитоплазмы (см. рис. 1). Клетки находятся в активном физиологическом состоянии, о чем свидетельствовал интенсивный циклоз. Именно данный тип клеток служил модельным объектом для дальнейшего получения и анализа очищенной фракции плазмалеммы.
Везикулярные препараты мембран, в том числе и плазмалеммы, широко используются для изучения свойств систем активного и пассивного транспорта ионов, механизмов их регуляции и т. п. [14, 15, 17, 22, 28, 32]. Огромное значение для работы с ферментами и каналами имеет сохранение нативных свойств мембран в получаемых везикулярных препаратах, поэтому важным является каждый этап их выделения и очистки. От условий, при которых происходило получение мембранных препаратов, зависит размер везикул получаемой фракции плазмалеммы, степень ее очистки от примеси других эндомембран, соотношение нормально ориентированных и инвертированных везикул в полученном препарате, а также количество белка, содержащегося в получаемом мембранном препарате [1, 20]. Как правило, в зависимости от объектов исследования проводят подбор оптимальных условий разделения мембран, варьируя 1) плотность водной двухфазной смеси, которая может составлять 6,2-6,6% декстрана и ПЭГ, и 2) ионный состав [19, 21, 30]. По литературным данным, концентрация полимеров ПЭГ/декстран при выделении везикулярной фракции, обогащенной плазмалеммой, может сильно варьировать в зависимости от объекта, а также органа растения. Например, для листьев шпината оптимальная концентрация полимеров составила 6,2% [24], для побегов и корней овса - 6,3% [31]. В то же время при выделении фракции ПМ из клеток суспензионной культуры свеклы ПЭГ/декстран были использованы в концентрации 6,3% [ I]. Однако при работе с клетками суспензионной культуры табака Nicotiana tabacum cv Wisconsin 38 линии 21 была использована смесь полимеров в концентрации 6,6% [18].
При выделении мембран из клеток культуры VBI-0 в нашем исследовании был использован ПЭГ/декстран в трех концентрациях: 6,2, 6,3 и 6,4%. Основная особенность получаемых с помощью двухфазного метода препаратов плазмалеммы состоит в том, что они представлены преимущественно нормально ориентированными везикулами [19, 20]. Активные центры фермента оказываются недоступными для субстратов реакции. В связи с этим для дальнейшего анализа свойств получаемых мембранных препаратов нами был использован бридж 58. Известно, что присутствие в реакционной среде данного детергента в концентрации 0,05% приводит к полной инвертации везикул, стимулирует перенос протона через ПМ, но не изменяет ни транспортную, ни гидролазную активности самой Нь-АТФазы
V: 'б].
Сравнение гидролитической активности получаемых препаратов из клеток культуры УВ1-0 при использовании фазовой смеси полимеров в концентрации 6,2, 6,3 и 6,4% приведено на рис. 2. Можно видеть, что даже в присутствии бридж 58 активность фермента во фракции, полученной при использовании полимеров в концентрации 6,2%, была близкой к нулю. Гидролазная АТФазная активность препарата мембран составила 57 и 80 мкмоль Фн/мг белка в час при использовании полимерных систем с концентрациями 6,3 и 6,4% соответственно (см. рис. 2). Однако следует отметить, что в случае использования ПЭГ/декстран в концентрации 6,3% при несколько меньшем абсолютном значении активности фермента, полученные результаты отличались большей статистической достоверностью. Кроме того, фракция, полученная при концентрации смеси 6,3%, имела большее содержание нормально ориентированных везикул, что может свидетельствовать о более высоком качестве проводимой очистки мембранных препаратов. Поэтому именно фракция ПМ, полученная при очистке в полимерной системе, содержащей ПЭГ/декстран в концентрации 6,3%, была использована для дальнейшего анализа.
6,20 6,30 6,40
Рис. 2. Активность ЬГ-АТФззы везикулярной фракции плазмалеммы, полученной с использованием двухфазного метода в зависимости от процентного соотношения ПЭГ/декстран.
Важной характеристикой везикулярной фракции плазмалеммы, очищенной с использованием двухфазной системы, является отсутствие примесей других мембран растительной клетки. Чистоту получаемых препаратов оценивали с помощью ингибиторного анализа, проводимого в условиях, оптимальных для работы маркерных ферментов. Показано, что ингибитор транспортной функции Н^-АТФазы ПМ - дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД, 5 ] О-5 моль/л) и специфический ингибитор гидролитической функции Нт-АТФазы ПМ -ортованадат натрия (№3У04, 4-Ю-4 моль/л) приводили к значительному, более 60%, снижению АТФ-гидролазной активности везикулярной фракции, что свидетельствует об обогащении полученной везикулярной фракции плазмалеммой (рис. 3). Использование ионов N0^" (КТЧОз, 50 ммоль/л), ингибирующих Н+-АТФазу тонопласта, молибдата - ингибитора неспецифичной фосфатазы 0,2 ммоль/л и олигомицина (0,5 мг/мл) - специфического ингибитора АТФаз митохондрий не приводило к снижению гидролитической активности получаемых мембранных препаратов, что указывает на отсутствие примесей соответствующих эндомембран [12].
120-
1 2 3 4 5
Рис. 3. Влияние ингибиторов на активность АТФазы везикулярной фракции, полученной с использованием 6,3% двухфазной системы, выраженную в процентах от полной активности в отсутствии ингибиторов.
I - Nar,V04 0,4 ммоль/л, 2 - ДЦКД 0,05 ммоль/л, 3 - Na2Mo04 0,2 ммоль/л, 4 - олигомицин 5 мкг/мл, 5 - KNO-, 50 ммоль/л.
Таким образом, оптимальными условиями для выделения ПМ из клеток каллусной культуры VBI-0 обладает водная полимерная система, содержащая ПЭГ/декстран в концентрации 6,3%.
Выявленная гидролитическая активность Н+-АТФазы ПМ составила 57 мкмоль Фн/мг белка в час, что сопоставимо с полученными ранее данными об активности фермента в клетках колеоптилей пятисуточных проростков кукурузы, которая составила 46 мкмоль Фн/мг белка в час [8]. Следует отметить, что оба объекта (клетки колеоптилей 5-суточных проростков кукурузы и клетки 3-недельной каллусной культуры) находились на физиологически сходных этапах развития, заключающихся в завершении роста растяжением. В дальнейшем планируется исследовать изменение активности Н+-АТФазы плазмалеммы клеток синхронизированной суспензионной культуры табака VBI-0 на разных стадиях онтогенеза.
Summary
Kirpichnikova A. A., Rudashevskaya Е. L., Mikhaylova U. V„ Shishova М. F. The purification and hydrolytic activity analysis of the plasma membrane fraction obtained from callus tobacco cell culture VBI-0.
The dextran-polyethylene glycol two-phase system is modified for purification of the plasma membrane fraction from callus tobacco cell culture VBI-0. This fraction is used for the analysis of hydrolytic activity and inhibitor analysis. It is shown that the plasma membrane fraction was highly sensitive to sodium vanadate and its activity was not inhibited by sodium molibdate, potassium nitrate and oligomicyne.
Литература
1. Гайворонская Jl. M, Тимонина В. И, Трофимова М. С., Дзюбенко В. С. Получение и характеристика везикул плазматической мембраны с низкой протонной проницаемостью из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы // Физиология растений 1987. Т. 34. Вып. 1. С. 13-26. 2. Инге-Вечтомова Н. И., Максимов Г. Б., Батов А. Ю. и др. Сравнительный анализ свойств плазмалеммы из клеток корней и колеоптилей кукурузы в модельной системе // Биоэлектрические явления и мембранный транспорт у растений. Горький, 1987. С. 34-41. 3. Инге-Вечтомова Н. И., Щипарев С. М., Кали-
нин В. Д., llluiuoea М. Ф.. Выхвалое К. А. Изучение пассивного и активного транспорта ионов через плазмалемму клеток колеоптилей кукурузы с помощью флюоресцентных зондов // Физиол. и биохим. культ, раст. 1993. Т. 25. №2. С. 119-126. 4. Максимов Г. Б., Батов А. Ю., Кренгауз Л. М., Малахов А. В. Влияние градиента рН на АТФазную активность везикул цитоплазматических мембран растительных клеток // Биоэлектрогспез и транспорт веществ у растений. Горький, 1986. С. 33-39.
5. Москалева О. В. Гормональная регуляция роста проростков кукурузы: Канд. дис. Л.. 1990. 148 с.
6. Рудашевская Е. Л., Емельянов В. В., Кирпичникова А. А., Бурова Е. А., Бобинова О. А., Шишо-ва М. Ф. Зависимость возрастных изменений ростовой активности колеоптилей и мезокотилей кукурузы от содержания индолил-3-уксусной кислоты // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 3 (№ 19). С. 99-106. 7. Рудашевская Е. Л., Кирипичникова A. A., LLIuuioea М. Ф. Активность Н+-АТФазы везикулярных фракций плазмалеммы, очищенных двумя методами, в присутствии бридж 58 // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 2. С. 1 11-117. 8. Рудашевская Е. Л., Кирипичникова А. А.. Шишо-ва М. Ф. Активность Нт-АТФазы плазмалеммы клеток колеоптилей в процессе развития проростка кукурузы // Физиол. раст. 2005. Т. 52, №4. С. 566-572. 9. Тихая Н. И., Максимов Г. Б. Выделение плазмалеммы из растительных клеток. Л., 1986. С. 20-28. 10. Шарова Е. И., Полевой В. В. Изучение ростовой реакции свежесрезанных и стареющих отрезков колеоптилей кукурузы на ауксин и кислый буфер // Вестн. Ленингр. ун-та. 1982. № 15. С. 82-86. 11. BradfordМ. М. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254. 12. Briscin D. P., Leonard R. Т., Hodoes Т. K. Isolation of the plasma membrane: membrane markers and general principles// Methods in enzymology. 1987. Vol. 148. P. 542-559. 13. ClelandR. E., Lomax T. Hormonal controle of H+ excretion from oat cells // Regulation of cell membrane activities in plants / Ed. by E. Marre, O. Cifferri. Amsterdam, 1977. P. 161-169. 14. De Nisi P., Dell'Orto M., Pirovano L., ZocchiG. Calcium-dependent phosphorylation regulates the plasma-membrane H+-ATPase activity of maize (Zea mays L.) roots // Planta. 1999. Vol. 209. P. 187-194. 15. Hase A. Changes in protein composition and the H+-ATPase activity of the plasma membrane during induction of callus from tuber tissues of Jerusalem artichoke // Plant Cell Physiol. 1993. Vol. 34(1). P. 67-74. 16. Johansson F.. Olbe M., Larsson C, Sommarin M. 'Non-detergent behavior' of Brij 58, a polyoxyethylene ether, creates membrane vesicles of uniform sidedness: formation of 100 per cent inside-out (cytoplasmic side-out) plasma membrane vesicles // Proseedings of the phytochemical society of Europe. Plant Membrane Biology / Ed. by I. M. Moller, P. Brodelius. Oxford, 1996. P. 264-273. 17. Kim Y.-S., Kim D., Jung J. Two isoforms of soluble auxin receptor in rice (Oryza saliva L.) plants: binding property for auxin and interaction with plasma membrane ЬГ-ATPase // Plant Growth Regulation. 2000. Vol. 32. P. 143-150. 18. Laporte K., Rossgnol M. Auxin control of the sensitivity to auxin of the proton translocation catalyzed by the tobacco plasma membrane H+-ATPase // Plant Growth Regulation. 1997. Vol.21. P. 19-25. 19. Larsson C., Kjellbom P., WidellS., Lundborg T. Sidedness of plant plasma membrane vesicles perified by partitioning in aqueous two-phase systems // FEBS Letters. 1984. Vol. 171. P. 271-276. 20. Larsson C„ WidellS., Kjellbom P. Preparation of high-purity plasma membranes // Methods in enzymology. 1987. Vol. 148. P. 558-568. 21. Lundborg Т., WidellS., Larsson C. Distribution of ATPases in wheat root membranes separated by phase partition // Physiol. Plant. 1981. Vol.52. P. 89-95. 22. Masson F., Rakotomavo M., Rossignol M. Characterization in tobacco leaves of structually and functionally different membrane fractions enriched in vanadate sensitive H+-ATPase // Plant Science. 1993. Vol.92. P. 129-142. 23. Morsomme P., Boutry M. The plant plasma membrane H+-ATPase: structure, function and regulation // Biochim. et Biophys. Acta. 2000. Vol. 1465. P. 1-16. 24. Olbe M., Sommarin M. The spinach plasma membrane Ca2"1" pump is a 120-kDa polypeptide regulated by calmodulin-binding to a terminal region // Physiol. Plantarum. 1998 Vol. 103. P. 35^14. 25. Palmgren M. G„ Harper J. F. Pumping with plant P-type ATPases // J. Exp. Bot. 1999. Vol. 50. P. 883-893. 26. Palmgren M. G. Plant plasma membrane H+-ATPases: Powerhouses for nutrient uptake // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. Vol.52. P. 817-845. 27. Sandelius A. S., MorreD.J. Plasma membrane isolation, based on membrane vesicle surface properties // The Plant Plasma Membrane - Structure, Function and Molecular Biology / Ed. by C. Larsson, I. M. Moller. Berlin; Heidelberg, 1990. Vol. 44. P. 52-65. 28.SantoniV., Vansuyt G., Rossignol M. The changing sensitivity to auxin of the plasma-membrane H"-ATPase: relationship between plant development and ATPase content of membranes // Planta. 1991. Vol. 185. P. 227-232. 29. Serrano R. Structure, function and regulation of plasma membrane ATPase // FEBS Letters. 1993. Vol. 325. P. 108-111. 30. WidellS., Larsson C. Physiol. Plant. Separation of presumptive plasma membranes from mitochondria by partition in an aqueous polymer two-phase system // Physiol. Plant. 1981. Vol. 51. P. 368-374. 31. WidellS., LundborgT., Larsson C. Plasma membranes from oats pre-
pared by partition in an aqueous polymer two-phase system // Plant Physiol. 1982. Vol. 70. P. 1429-1435.
32. WuJ., Seliskar D. M. Salinity adaptation of plasma membrane H "-ATPase in the salt marsh plant Spartina patens: ATP hydrolysis and enzyme kinetics // J. Exp. Botany. 1998. Vol. 49, N 323. P. 1005-1013.
33. Zazimalova E., OpatrnyZ., Brezinova A., EderJ. The effect of auxin starvation on the growth of auxin-dependent tobacco cell culture: dynamics of auxin-binding activity and endogenous free IAA content // J. Exp. Botany. 1995. Vol. 46, N290. P. 1205-1213.
Статья поступила в редакцию 29 сентября 2005 г.
