CC BY
46
Сер. 3 2008 Вып. 1
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.192.7
Н. В. Шахова, О. В. Танкеяюн
НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АТФ- И ПИРОФОСФАТ-ЗАВИСИМОГО ТРАНСПОРТА ИОНОВ Н+ ВО ФРАКЦИИ ЭНДОМЕМБРАН ИЗ КЛЕТОК КОЛЕОПТИЛЕЙ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ *
Характерной чертой растений является наличие у них, в отличие от животных, параллельных метаболических путей, в которых альтернативные ферментные системы утилизируют разные источники энергии, что повышает возможности адаптации растительного организма к изменяющимся условиям внешней среды. Примером альтернативных ферментных систем у растений могут служить протонные насосы внутриклеточных мембран двух типов, использующие АТФ и неорганический пирофосфат для активного переноса ионов Н+ из цитоплазмы в вакуоль и другие внутриклеточные компартменты.
АТФаза вакуолярного типа (У-типа)—мультисубьединичный гетеромерный комплекс с молекулярной массой около 750 кДа, состоящий из двух структурно-функциональных частей-—периферического каталитического домена и мембранного Н+-переносящего домена. Н+-АТФаза У-типа имеет всеобщее распространение у эукариотических организмов; локализована в мембранах различных внутриклеточных компартментов клеток растений [8, 29].
ГТирофосфатаза вакуолярного типа—специфический протонный насос растений, который отсутствует у животных и грибов. Родственные формы найдены у некоторых фототрофных эубактерий, термофильных археобактерий и паразитических простейших. Н+-пирофосфатаза представляет собой интегральный мембранный белок молекулярной массой 75-81 кДа; локализована преимущественно в вакуолярной мембране [21, 30].
Протонные насосы вакуолей и других внутриклеточных компартментов относятся к ферментным системам, поддерживающим существование растительных клеток. Они участвуют в процессах поглощения, транспорта и компартментализации многих органических и неорганических веществ, обеспечивают осмотические изменения объема клеток, требуемые для транспирации и предшествующие росту растяжением. В их функции входит поддержание кислотного гомеостаза цитоплазмы и закисление вакуолей, необходимое для активации гидролитических ферментов при прорастании и старении.
Общая первичная функция насосов обоих типов, состоящая в трансмембранном переносе протонов из цитоплазмы во внутренний объем вакуоли (или других компартментов), базируется однако на различном химическом строении и механизме функционирования этих протонных насосов, что обусловливает различия в способах их регуляции, и, возможно, характере их сопряжения с вторично активным транспортом ионов и метаболитов.
© Н. В. Шахова, О. В. Танкелюн, 2008
В ранее проведенной работе мы анализировали биохимические свойства и некоторые физиологические характеристики Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы вакуоляр-ного типа из клеток колеоптилей проростков кукурузы на основе изучения их гидролитической активности [4, 5]. В задачу данной работы входил сравнительный анализ Н+-транспортирующей активности АТФазы и пирофосфатазы фракции эндомембран из того же объекта, в том числе оценка влияния на нее различных ионов.
С активностью Н+-насосов вакуолярного типа непосредственно связана работа Са2+/Н+-антипортеров тонопласта, участвующих в переносе ионов Са2+ в вакуоль против градиента концентрации [39]. В данной работе представляло интерес определить активность Са2+/Н+-обменников в колеоптилях проростков кукурузы и выяснить, имеются ли различия в ее свойствах в зависимости от природы протонного градиента.
Методы исследования. Препараты внутриклеточных мембран, обогащенные фрагментами тонопласта и эндоплазматического ретикулума, выделяли из колеоптилей 4-суточных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L., гибрид F1 Нарт-150). Растительные ткани (отрезки колеоптилей без 4-миллиметровой верхушки, длиной 10-15 мм) гомогенизировали в среде, содержащей 0,4 М сахарозы, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,8), 5 мМ ЭДТА, 2,5 мМ дитиогрейтола (ДТТ), 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 % бычьего сывороточного альбумина (в соотношении: 2 мл среды на 1 г ткани). Гомогенат фильтровали через нейлон и центрифугировали при 3400 g 10 мин (при этом осаждались крупные фрагменты клеток, ядра, этиопласты и часть митохондрий). Супернатант наслаивали на 2-слойный градиент плотности сахарозы, включающий растворы 14 и 26 % сахарозы (1,055 и 1,11 г/см3), приготовленные на буфере 5 мМ Трис-Mes (рН 7,3), 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА. После центрифугирования при 96000 g 2 ч на границе слоев собирали фракцию, содержащую фрагменты тонопласта и эндоплазматического ретикулума (ЭР). Фракцию в 4 раза разбавляли раствором 0,2 М сахарозы в том же буфере, осаждали при 96 000 g 1 ч и ресуспендировали в небольшом объеме того же раствора (концентрация мембранного бежа в препарате—около 1 мкг/мкл).
Выделение микросомальных фракций непосредственно из супернатанта после центрифугирования 3400 g позволило получить более высокий выход эндомембран по сравнению с часто используемым подходом осаждения микросом из супернатанта—13 500 g. Как видно из таблицы, более 3А мембран тонопласта, ЭР и плазмалеммы теряется после центрифугирований при 6000 и 13 000 g.
Соотношение общих активностей маркерных ферментов во фракциях, выделенных из гомогената колеоптилей кукурузы дифференциальным центрифугированием (выражено в процентах)
Фракции
Тип мембран Биохимический маркер 1400-6000 g (10 мин) 6000-13500 g (15 мин) 13500-96000 g (60 мин)
Внутренняя Сукцинат-цитохром С-редуктаза 85,2 12,5 2,3
митохондриальная Азид-чувствительная АТФаза, рН 8,5 92,5 5,6 1,7
Плазматическая Ванадаг-чувствительная АТФаза, рН 6,0 60,0 26,4 13,6
Эндоплазматичес- НАДФ Н-цитохром С-редутаза, азид-чувствительная 39,8 35,3 24,9
кого ретикулума НАД Н-цитохром С-редуктаза,, азид-чувствительная 33,2 40,9 25,9
Вакуолярная Нитрат-ингибируемая АТФаза, рН 7,0 60,0 13,6 26,4
Активности маркерных ферментов определяли, как описано ранее, НАДН-, НАДФН-сукцинат-цитохром С-редуктаз [6], ванадат- и азид-чувствительных АТФаз [3], нитрат-инги-бируемой АТФазы и КС1-стимулируемой пирофосфатазы [5].
АТФ- и РРьзависимый перенос ионов Н+ в мембранные везикулы фракции внутриклеточных мембран регистрировали как снижение поглощения акридинового оранжевого (АО) при X 495 нм на спектрофотометре СФ-45. Инкубационная смесь объемом 800 мкл включала
10 мкМ АО, 5 мМ Трис-Mes (рН 7,0), 0,2 М сахарозы, 1 мМ MgS04, 50 мМ КС1, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, препарат везикул (5-15 мкг мембранного белка). Измерения производились после добавления 1 мМ Na,AT<D или 0,5 мМ Na4P2Or Оценивали начальную скорость изменения поглощения АО (ДА495 • мин"1 • мг"1 белка) и значение ЛА495 при достижении реакцией состояния равновесия (соответствующее максимальному градиенту рН между содержимым везикул и внешней средой).
Спектрофотометрический метод определения изменения рН внутри мембранных везикул, а также изолированных клеточных органелл с использованием моноаминного оптического зонда акридинового оранжев®го имеет широкое распространение. Повышение концентрации Н+ внутри везикул сопровождается снижением поглощения акридинового оранжевого при X 492-495 нм (максимум поглощения мономерной формы АО). Имеется несколько объяснений этого явления. По широко распространенной гипотезе, нейтральные молекулы слабого основания АО (рКа -9,4) легко проникают через мебрану и накапливаются внутри везикул, приобретая положительный заряд по иминогруппе, по мере снижения рН при работе насосов. Причина изменения поглощения АО связана с образованием димерных и эксимерных комплексов АО, имеющих максимум поглощения при 470 нм [28]. Полагают, однако, что использование метахроматического красителя АО не позволяет произвести точную количественную оценку изменений рН внутри везикул. Хотя имеются и другие точки зрения,
В большей части исследований ведется регистрация изменений разности поглощений АО при двух длинах волн—495 и 530 нм (длина волны, при которой поглощение АО не изменяется при варьировании параметров эксперимента) на двухлучевых спектрофотометрах. Возможно также вполне надежное измерение максимума поглощения АО на однолучевом спектрофотометре против инкубационного раствора без АО, как это выполнялось в нашей работе.
Содержание белка в мембранных препаратах определяли по методу М.М. Бредфорд [10].
Опыты были проведены в 3-7-кратной повторности. На рисунках представлены типичные кривые и усредненные данные, обработаны^ статистически.
Результаты исследования. Анализ активного трансмембранного переноса ионов Н+ проводили с применением везикулярной фракции эндомембран, выделенной из коле-оптилей 4-суточных этиолированных проростков кукурузы (Zea mayz L.). Препараты мембран, полученные с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (14/28 %), содержали главным образом элементы вакуолярной мембраны и эндоплаз-матического ретикулума (по данным анализа распределения KCl-стимулируемой пиро-фосфатазной активности и азид-нечувствительной НАДН-цитохром С редуктазной активности в многослойном градиенте плотности сахарозы). В мембранной фракции определялось не более 25 % от общей ванадат-чувствительной АТФазной активности и отсутствовали митохондриальные загрязнения (данные не приводятся).
Ранее во фракции эндомембран, выделенной из колеоптилей проростков кукурузы, была идентифицирована гидролитическая активность двух протонных насосов вакуолярного типа [4, 5]. АТФазная активность обнаруживала специфическое для вакуолярной Н+-АТФазы свойство подавления нитратом и бафиломицином Al, а пиро-фосфатазная активность показывала высокую стимуляцию хлоридом калия, характерную для Н+-пирофосфатазы тонопласта.
Экспериментальные кривые на рис. 1 и 2 демонстрируют Н+-транспортирующую активность везикулярной фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы в присутствии АТФ и пирофосфата (а также Mg2+ и КС1). Поступление Н+ во внутривези-кулярное пространство наблюдали как снижение поглощения проникающего зонда акридинового оранжевого при длине волны 495нм, соответствующей максимуму поглощения мономерной формы красителя. О регистрации снижения рН в везикулах свидетельствовало повышение поглощения АО до исходного уровня после добавления протонофора FCCP или разобщителя NH4C1.
0,5 0,48
I 0,46 <
„ 0,44 % 0,42
| 0,38 | 0,36 С 0,34 0,32 0,3
0 1 2 3 4 5 6 7
9 10 11 12 Время, мин
Рис. 1. АТФ-зависимый транспорт ионов Н+ в везикулы фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы (кривая 1), в том числе в присутствии 2 нМ бафиломицина А1 (2) и 50 мМ КШЧ (3).
15 мкМ
Нитрат калия (10 мМ) снижал начальную скорость АТФ-зависимого транспорта Н+ и вызывал быстрый переход реакции в равновесное состояние, при котором вход и выход Н+ уравновешены (см. рис. 1, кривая 3). Полумаксимальное ингибирование нитратом АТФ-зависимого транспорта Н+ составляло 1-1,5. мМ. Высокоспецифичный ингибитор Н+-АТФа-зы вакуолярного типа бафиломицин А1 (2 нМ) полностью подавлял транспорт Н+ (см. рис. 1, кривая 2). Действие ванадата' (25-200 мкМ) на АТФ-зависимый транспорт не было выявлено.
Начальная скорость транспорта Н+, как и градиент рН, формируемый в присутствии пирофосфата, составляли около 1/3 от соответствующих характеристик активности АТФ-зависимого транспорта для 4-дневных проростков кукурузы (рис. 2). На более раннем этапе роста растяжением, у колеоптилей 3-дневных проростков различия в активности АТФ- и пирофосфат-зависимого транспорта были незначительными (данные не приводятся). При замене КС1 в среде реакции на №С1 активность пирофосфат-зависимого транспорта резко снижалась (см. рис. 2, кривая 4). Однако не является ингибитором активности Н+-пирофосфатазы, как это описано для некоторых растительных объектов [16, 26], так как в присутствии КС1 ионы Иа+ не подавляли транспорт Н+ (см. рис. 2, кривая 3).
Анализировали влияние различных солей одновалентных катионов на характер изменения рН внутри везикул при работе Н+-насосов. В отсутствие С1 (или других легко проникающих анионов) снижение поглощения АО не обнаруживалось. Хлорид способствует закислению везикулярного содержимого, так как шунтирует мембранный потенциал (положительный внутри), индуцируемый активностью насосов, и тем самым повышает химическую составляющую АцН4. Нитрат, который по способности к трансмембранному переносу близок к хлориду [24], в равной степени поддерживал пирофосфат-зависимый градиент рН (рис. 3, В), но специфично ингибировал образование АТФ-зависимого градиента рН (рис. 1, 3, А). В присутствии слабо проникающего сульфата, как и анионов органических кислот, скорость снижения рН в везикулах эндомембран составляла половину и менее для обоих типов вакуолярных насосов.
25 мМ
9 10 11 i2 Время, мин
Рис. 2. Пирофосфат-зависимый транспорт ионов Н+ в везикулы фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы в присутствии
KCl (1,2, 3) и NaCl (4). Стрелками показан момент добавления пирофосфата, а также солей одновалентных катионов в ходе реакции.
с* 1,6 *
а w,ö S
^0,6
Ov
Jo,4
1
X
ca 1 ^ 0,8
'I
лМ
й.
KCl RbCl CsCI NaCI LiC!
50 мг-экв K+
KCl K,S0, KNO, малат шпрот калия калия
10 мг-экв К+
Лл
1 л ¿Ш
KCl RbCl CsCI NaCI LiCl
50 мг-экв K+
KCl K,SO( KNO, эмалат umpar калия калия
10 мг-экв K+
Рис.
3. Влияние солей одновалентных катионов на начальную скорость АТФ (А)- и пирофосфат (/^-зависимого транспорта ионов водорода в везикулы эндомембран.
10 9
а
Щ 8
U
-ю 7
L.
S 6
я 5 s J Я
^ 4
Os тГ
3 3 2
1
1/V
Природа одновалентного катиона не оказывала существенного влияния на АТФ-за-висимый транспорт 1Г. Наиболее высокий градиент рН и начальная скорость реакции наблюдались в присутствии 1л+ и Ка+ (см. рис. 3, А). Способность 1л+ максимально активировать образование АТФ-зависимого градиента рН была показана и для вакуо-лярной фракции из корней кукурузы [18]. Предполагается, что существующий в мембране механизм К7Н+-антипортера отсутствует для 1л+, вследствие чего последний, находясь в инкубационной среде, не расходует протонный градиент.
На пирофосфат-зависимое изменение рН, напротив, наибольшее влияние оказывали ионы К+(см. рис. 3, Б). Добавление К2Б04 (25 мМ) в ходе пирофосфат-зависимого переноса Н+ активировало закисление везикул (см. рис. 2, кривая 2). Ионы СГ в отсутствие К+ слабо поддерживали поступление Н+ в везикулы. И в случае пирофосат-зависимого транспорта Н+, в отличие от АТФ-зависимого, наблюдалась ситуация, когда легко проникающий катион лучше поддерживает вход Н+ в везикулы. Это позволяет предположить, что транспорт К' тесно сопряжен с активностью Н+-пирофосфатазы, По современным представлениям, пирофос-фатаза не транспортирует К+ непосредственно [21, 32]. Н+-транспортирующая активность пирофосфатазы активировалась более низкими концентрациями КС1, чем активность Н+-АТФазы. Полумаксимальная скорость пирофосфат-зависимого переноса Н+ достигалась в присутствии 15 мМ КС1, АТФ-зависимого — в присутствии 25 мМ (рис. 4). Вопрос о механизме влияния К+ на активность Н+-пирофосфатазы еще не получил окончательного решения.
Анализировали влияние ионов Са2+ на скорость Н+-транспорта, поддерживаемого АТФ и пирофосфатом в эндомем-бранной фракции. В среду реакции добавляли ЭГТА (0,2 мкМ ) и СаС12 в концентрациях, рассчитанных по программе [11] для получения требуемых уровней несвязанных ионов Са. Как видно на рис. 5,
-0,1 О 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1 / [KCl, мМ]
50
100
150
200 KCl, мМ
Рис. 4. Зависимость начальной скорости АТФ (/)-и пирофосфат (2)- зависимого транспорта ионов
Н+ от концентрации KCl в среде реакции (А). Графическая зависимость по Лайнуиверу-Бэрку для скорости пирофосфат-зависимого снижения поглощения АО (Б).
Н+-насосы везикулярной фракции эндо-мембран из проростков кукурузы проявляли различную чувствительность к ионам Са2+. Понижение начальной скорости АТФ-зависимого Н+-транспорта обнаруживалось в присутствии 1-2 мкМ Са2+ и достигало полумаксимальной величины при 35-50 мкМ. Ингибирующий эффект Са2+ на пирофосфат-зависимое поступление Н+ в везикулы наблюдался уже при концентрации 0,5 мкМ, а полумаксимальное подавление активности — при 5 мкМ. Известно, что основной причиной ингиби-рования Н+-пирофосфатазы ионами Са2+ является замещение М§2+ в субстратном комплексе [21]. Вероятно, эта причина не может быть единственной, так как Н+-пирофосатаза обнаруживает чувствительность к субмикромолярным концентрациям этого иона. Снижение скорости активного поступления ионов Н+ в мембранные везикулы в присутствии ионов Са2+ может быть частично связано с наличием в вакуолярной мембране механизма транспорта Са2+, утилизирующего градиент рН. В наших опытах для обнаружения Са2+/Н+-антипортера в везикулярной фракции СаС12 добавляли в инкубационный раствор после того, как градиент рН, вызванный работой протонных насосов, достигал максимальной величины и выходил на стационарный уровень. Как показано на рис. 6, СаС12 в различных концен-
-4
^[Са2+, М]
Рис. 5. Влияние ионов Са2+ в среде реакции на скорость АТФ (7)- и пирофосфат (2)- зависимого
транспорта ионов Н+ в везикулы фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы.
0,56
0,51
5 0,46 <
9
< 0,41
3 0,36
в
о
С0,31
0,26
5 10 15 20 25 30 35 Время, мин
Рис. 6. Динамика снижения градиента рН между внешней средой и содержимым везикул эндомембран, сформированного работой Н+-пирофосфатазы, при добавлении ионов Са2+ и ЭГТА (1 мМ). Концентрации Са2+ (в мкМ) показаны у соответствующих кривых.
трациях вызывал уменьшение или полное рассеивание градиента рН, сформированного Н+-пирофосфатазой. При последующем добавлении ЭГТА (1 мМ), хелатирующего СА2+, выход Н+ прекращался и наблюдался рост градиента рН с переходом его в новое стационарное состояние. Эти результаты демонстрируют, на наш взгляд, присутствие Са2+/ Н+-обменника в энергизованных активностью Н+-насосов эндомембраняых везикулах из клеток колеоптилей кукурузы. Зависимость начальной скорости выхода Н+ от концентрации Са2+ носила насыщающий характер и удовлетворительно описывалась кинетикой Михаэлиса-Ментен (рис. 7).
Оказалось, что свойства Са2+/Н+-обменного механизма в препаратах мембран из клеток проростков кукурузы зависели от природы Н+-насоса, обеспечивающего закисление везикул. Кажущиеся Км для Са2+ составляли 8,0±1,0 и 5,9±0,9 мкМ
на фоне АТФ- и пирофосат-зависимого градиентов рН соответственно. Однако при наличии пирофосфат-зависимого ДрН обнаруживалась вторая Км для Са2+, составляющая 0,2-0,5 мкМ (см. рис. 7). Она может свидетельствовать о дополнительном Са27Н+-обменном механизме.
Таким образом, чувствительность к уровню ионов Са2+ в среде реакции была более высокой для процессов, зависимых от активности пирофосфатазы, как для пирофосфат-зависимого закачивания Н+, так и для выделения Н+ при добавлении Са2+.
Обсуждение результатов исследования. Полученные данные указывают на присутствие во фракции эндомембран, обогащенной фрагментами вакуолярной мембраны и содержащей ЭР из колеоптилей проростков кукурузы, двух протонных насосов, Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы, которые закачивают ионы Н+ внутрь везикул. АТФ-зависимый транспорт Н+ связан с работой АТФазы вакуолярного типа, так как он полностью подавлялся высокоспецифичным ингибитором бафиломицином А1 [9].
Обнаруженное АТФ- и пирофосфат-зависимое закисление везикул эндомембран требовало присутствия проникающих анионов. Влияние анионов на активность Н+-насосов обусловлено следующими причинами: 1) перемещение анионов шунтирует мембранный потенциал (положительный внутри), генерируемый Н+-насосом и тем самым способствует закислению везикулярного содержимого, повышает АрН (химическую составляющую электрохимического градиента ДрН+); 2) анионы оказывают непосредственное влияние на ферменты.
По данным электрофизиологических и биохимических исследований, перемещение ионов С Г в вакуоль осуществляется с помощью ионных каналов нескольких типов и С1"/Н+-котранспорта. В динамике поглощения С1 в везикулярные фракции из клеток растений и дрожжей показано наличие насыщающего и линейного компонентов [24, 37].
Относительно транспорта малата и других дикарбоновых кислот на основе flux-экспериментов с использованием меченых органических анионов и patch clamp-техники показано, что они перемещаются через мембрану в заряженной моноанионной [36] или дианионной форме [Rentsch, Martinoia] по каналам VMal, а также по С1-каналу VC1, проницаемому также для малата [7, 24].
Существует представление о том, что хлорид-ион является эффектором АТФазы вакуолярного типа у растений, чего не наблюдается у животных. В экспериментах на протеосомах со встроенной, частично очищенной V-АТФазой было показано, что ионы С1~ оказывают непосредственное влияние на гидролитическую и транспортную активность АТФазы [38].
Специфическое ингибирующее действие нитрата на V-АТФазу также, по-видимому, обусловлено его прямым действием; оно обратимо при низких концентрациях (1-10 мкМ) и может быть связано с окислением SH-rpynn [17]. При высоких концентрациях действие нитрата необратимо и вызывается отделением примембранного VI-комплекса [31].
О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Са2+, мМ
Рис. 7. Влияние ионов Са2' в различных концентрациях на диссипацию градиента рН,
сформированного Н+АТФазой (/) и ЬГпирофосфатазой (2) на эндомембранах везикулярной фракции из клеток колеоптилей кукурузы.
Существенные различия между активностями двух Н+-помп проявляются в их отношении к щелочным катионам в среде реакции (см. рис. 3). Пирофосфат-зависимый транспорт ионов Н+, в отличие от АТФ-зависимого, обнаруживал высокую зависимость от ионов К+. Ранее было показано трехкратное повышение пирофосфатазной активности в присутствии KCl во фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы [5]. По современным представлениям, калий является кофактором Н+-пирофосфатазы вакуолярного типа, в структуре который выявлен предполагаемый сайт связывания калия [21]. Однако, можно отметить, что эффекты щелочных катионов на пирофосфат-зависимый транспорт Н+ (см. рис. 3), расположенные в порядке их убывания, соответствуют ряду проницаемости биологических мембран для этих ионов [35]. Это может свидетельствовать об определенном участии Н+-пирофосфатазы в транспорте калия и других легко проникающих щелочных кащонов. На основании экспериментов с использованием patch clamp-техники на целых вакуолях из красной столовой свеклы и Chenopodium rubrum были получены доказательства и сформрованы представления о непосредственном участии Н+-пирофосфатазы в транспортировке К+ через вакуолярную мембрану [13, 27]. Однако в опытах с Н+-пирофосфатазой, встроенной в липосомы, с применением 42К+ и флуоресцентных зондов транспорт К+ подтвержден не был [32, 33]. Тем не менее сохраняется возможность какого-то специфического взаимодействия Н+-пирофосфатазы с переносчиками К+. Для вакуоляр-ной мембраны растительных клеток описаны транспортеры для К+ и других щелочных катионов, включающие ионные каналы нескольких типов (FV, SV, VK) для перемещения катионов через тонопласт преимущественно из вакуоли в цитоплазму и котран-спортеры, утилизирующие протонный градиент для транслокации К+ и Na+ в вакуоль против позитивной с вакуолярной стороны мембраны разности потенциалов [20, 24].
Известно, что клетки эукариот поддерживают низкое содержание ионов Са2+ в цитоплазме (0,1-0,2 мкМ). Временное повышение уровня Са2+ является способом регуляции активности многих белковых молекул и одним из основных механизмов внутриклеточной сигнализации в ответ на изменения во внешней среде и при переходе клеток в новое функциональное состояние [2, 39]. Анализ влияния концентрации ионов Са2+ в реакционной среде на активность Н+-насосов вакуолярной мембраны показал, что чувствительность Н+-транспортирующей активности пирофосфатазы к Са2+ на порядок выше, чем у Н+-АТФазы (150 3,46 и 32,4 мкМ соответственно). По литературным данным, эффект Са2+ на активность Н+-пирофосфатазы мгновенный и легко обратимый. Считается, что действие Са2+ обусловлено образованием CaPPi-комплекса, конкурентного ингибитора для различных типов пи-рофосфатаз [21]. Действие Са2+ на пирофосфат-зависимый транспорт обнаруживалось уже на субмикромолярном уровне (см. рис. 5). Существует мнение о том, что свободные ионы Са2+также могут быть ингибиторами Н+-пирофосфатазы, модулирующми ее активность [30]. Интересно отметить, что у арабидопсиса кроме основной формы Н+-пирофосфатазы (AVP1) с умеренной чувствительностью к Са2+ показана вторая (AVP2), не активируемая KCl и суперчувствительная к Са2+, причем содержание транскриптов этих двух форм в тканях растения близко по величине [14]. Наличие второй формы обсуждается авторами как общее явление для тех организмов, в которых присутствуют Н+-пирофосфатазы (растения и некоторые паразитические простейшие) [15].
Способы снижения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме для возвращения системы в исходное состояние после проведения сигнала, вызвавшего ее временное повышение, связаны с функционированием Са2+-АТФаз и Са2+/Н+-обменников различной локализации. К настоящему времени с применением биохимических и молекулярно-генетических исследований накоплены сведения о Са2+/Н+-антипортерах у растений и грибов. Они находятся в вакуолярной мембране, мембранах аппарата Гольджи; име-
ются свидетельства их присутствия в плазмалемме и мембранах тилакоидов пластид [22]. Впервые с помощью биохимических подходов Са2+/Н+-обменники были обнаружены в тонопласте клеток корней овса и листьев гороха [1, 34]. Молекулярно-генетические доказательства присутствия Са2+/Н'-анти портера (САХ) впервые были получены на ара-бидопсисе [19]. К настоящему времени в геноме Arabidopsis thaliana идентифицировано 7 генов семейства Са2+/Н+-антипортеров, у риса—5 генов [24]. Са2+/Н+-обменники характеризуются довольно низким сродством к ионам Са2+ по сравнению с Са2+-АТФазами [22]. Полагают, что основная роль Са27Н+-антипортера состоит в понижении уровня Са2+ в цитоплазме до 1-2 мкМ после индукции его повышения, тогда как Са2+-АТФазы способны понизить его до исходной величины [2, 22].
В нашей работе присутствие Са2+/Н+-обменника показано как диссипация градиента pH, образованного работой Н+-насосов, при добавлении Са2+ в среду реакции, которое прекращалось при добавлении ЭГТА (см. рис. 6 ). Кажущиеся Км для Са2+ для Са2+/Н+-обмена на фоне АТФ- и пирофосфат-зависимого градиентов были близки по величине (8 и 6 мкМ соответственно). Однако в присутствии пирофосфат-зависимого градиента pH была выявлена вторая Км для Са2+, на порядок более низкая, что свидетельствует о высоком сродстве к Са2+ обменника, сопряженного с работой Н+-пирофосфатазы. Имеется работа [12], выполненная на фракции тонопласта из корней проростков кукурузы, в которой при оценке поглощения меченого Са2+ в присутствии активной Н+-пирофосфатазы показана вторая константа для Са2+/Н+-обменника, составляющая 0,36 мкМ. В нашей работе, как и в указанной выше, но в отличие от других исследований [1, 19, 34], был использован Са-ЭГТА буфер в среде инкубации (в работе [12] в среде находился также оксалат). Вторая Км, возможно, отражает присутствие в эндомембранах клеток проростков кукурузы Са27Н"-обменного механизма, тесно сопряженного с работой Н+-пиро-фосфатазы, который, обладая высоким сродством к Са2+, может принимать участие в тонкой регуляции концентрации этих ионов в цитоплазме растительной клетки.
Таким образом, Н+-насосы вакуолярного типа, активность которых была показана во фракции внутриклеточных мембран из клеток колеоптилей кукурузы, проявляли различную чувствительность к солям одновалентных катионов. Скорость АТФ-зависимого транспорта Н+ зависела главным образом от присутствующих анионов и была максимальной в среде с хлоридом. Пирофосфат-зависимая Н+-транспортирующая активность характеризовалась высокой избирательностью к одновалентным катионам и предпочитала ионы К+, а также имела на порядок более высокую чувствительность к ионам Са2+. Свойства Са2+/Н+-обменного механизма в препаратах эндомембран из клеток проростков кукурузы определялись природой Н+-насоса. Активность Са27Н+-антипортера, сопряженная с работой Н+-пирофосфатазы, обладала высоким сродством к ионам Са2+.
Работа поддержана РФФИ (гранты № 05-04-49619 и № 07-04-1056) Summary
Shakhova N. V., Tankelyun О. К The certain characteristics of ATP- and pyrophosphate-dependent proton transport in endomembrane fraction from maize coleoptile cells.
H+-translocated activities of the vacuolar type ATPase and pyrophosphatase are shown in endomembrane fraction from maize coleoptile cells. PPi-dependent H+-transport into membrane vesicles by contrast to ATP-depcndent HMransport is characterized by the selectivity to monovalent cations and high sensitivity to ions Ca2+. The properties of Ca2+/H+ exchange shown in endomembrane fraction of maize coleoptile cells are dependent on the nature of the proton pump. Ca27H+-antiporter coupled with H+-PPase activity displayed high affinity to Ca2+.
E-mail: otan@yandex.ru
Литература
1. Андреев И. М., Коренъков В. Д., Молотковский Ю. Г. Са2+/Н+-антипорт в везикулах то-нопласта из листьев гороха//Биол. мембраны. 1989. Т. 6. С. 153-158. 2. Медведев С. С. Кальциевая сигнальная система растений//Физиология растений. 2005. Т. 52. № 1. С. 1-24. 3. Тан-келюн О. В. Свойства мембранных АТФаз клеток колеоптилей кукурузы // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. 3. 1987. Вып. 1 (№ 3). С. 68-76. 4. Танкелюн О. В, Свойства пирофосфатазной и АТФазной активности мембранных фракций, содержащих тонопласт, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы//Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 1998. Вып 2 (№ Ю) С. 97-103. 5. Танкелюн О. В., Шахова Н. В. Активность АТФазы и пирофосфатазы вакуолярного типа на разных фазах роста клеток проростков кукурузы//Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2000. Вып. 3(№ 19). С. 64-69. 6. Танкелюн О. В., Чиркова Т. В., Тищенко Н. Н., Магомедов И. М. Ферменты // Методы изучения мембран растительных клеток/Под. ред В.В. Полевого и др. Л., 1986. С. 50-71. 7. BarklaB.J., PantojaO. Physiology of ion transport across the tonoplast of higher plants//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 47. P. 159-184. 8. BeyenbachK. W., WieczorecH. The V-type H+ATPase: molecular structure and function, physiological roles and regulation // J. Exp. Biology. 2006. Vol. 209. P. 577-589. 9. Bowman E. J., Siebers A., AltendorfK. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells and plant cells//PNAS. 1988. Vol. 85. P. 7972-7976. 10. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. N 2. P. 115-143. 11. BroobS.P.J., Storey K.B. Bound and Determined: A computer programme for maiking buffers of defined ion concentrations//Anal. Biochem. 1992. Vol. 201. P. 119-120. 12. Da-Silva W. S., Bomfin F. M., GalinaA., de Meis L. Maize tonoplast PPi-dependent H7Ca2+ exchange: two К for Ca2+ ingibition by thapsigargin // BBRC. 2003. Vol. 307. P. 472-476. 13. Da-vies J. M., PolleR.J., ReaP.A., Sanders D. Potassium transport into plant vacuoles energized directly by a proton-pumping inorganic pyrophosphatase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 89. P. 11701-11705. 14. Drozdowicz Y,, Kissinger J. C., ReaP.A. AVP2, a sequence-divergent K+-insense-tive H+-translocating inorganic pyrophosphatase from Arabidopsis//Plant Physiol. 2000. Vol. 123. P. 353-362. 15. Drozdowicz Y., ReaP.A. Vacuolar ^pyrophosphatases: from the evolutionary backwaters into the mainstream//Trends Plant Sci. 2001. Vol. 6. N 5. P. 206-211. 16. FraichardA., Magnin Т., Trossat C., Pugin A. Properties of the proton pumping pyrophosphatase in tonoplast vesicles of Acer pseudoplatanus. Functional molecular mass and polypeptide composition // Plant Physiol. Biochem. 1993. Vol. 31. N. 3. P. 349-359. 17. ForgacM. Structure, function and regulation of vacuolar (H+)-ATPases//FEBS Letters. 1998. Vol. 440. P. 258-263. 18. HagerA., Biber W. Functional and regulatory properties of H+ pumps at the tonoplast and plasma membranes of Zea mays coleoptiles // Z. Naturforsch. 1984. H. 39c. S. 927-937. 19. HirshiK.D„ ZhenR.-G., CunnenghamK. W., ReaP.A. FinkG. CAX1, an H7Ca2+ antiporter from Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 8782-8786. 20. Krol E„ Trebacz K. Ways of ion channel gating in plant cells//Ann. Bot. 2000. Vol. 86. P. 449^469. 21. Maeshima M. Vacuolar ^-pyrophosphatase // Biochim. et Biophys. Acta. 2000. Vol. 1465. P. 37-51. 22. Maeshima M. Tonoplast transporters: organization and function//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 2001. Vol. 52. P. 470-497. 23. Maeshima M., NacanishiL., Matsuura-Endo Ch., TanakaY. Proton pumps of the vacuolar membrane in growing plant cells//J. Plant Res. 1996. Vol. 109. N 1093. P. 119-125. 24. MartinoiaE., MassonneauA. Fragne N. Transport processes of solutes across the vacuolar membrane of higher plants // Plant Cell Physiol. 2000. Vol. 41. N 11. P. 1175-1186. 25. MartinoiaE., Maeshima M„ NeuhausH.E. Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism//J. Exp. Botany. 2007. Vol. 58. N 1. P. 83-102. 26. Nakamura Y., KasamoK., Sakata M., OhtaE. Stimulation of the extrusion of protons and H+-ATPase activities with the decline in pyrophosphatase activity of the tonoplast in intact mung bean roots under high-NaCl stress and its relation to external levels of Ca2+ ions // Plant Cell Physiol. 1992. Vol. 33. N 2. P. 139-149. 27. Obermeyer G„ SommerA., Bentrup F. V. Potassium and voltage dependence of inorganic pyrophosphatase of intact vacuoles from Chenopodium rubrum II Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1284. P. 203-212. 28. Palmgren M.G. Acridine orange as a probe
for measuring pH gradient across membranes: mechanism and limitations//Analyt. Biochem. 1991. Vol. 192. N 2. P. 316-321. 29. Ratajczak R.. Structure, function and regulation of the plant vacuolar ^-translocating ATPase//Biochim. et Biophys. Acta. 2000. Vol. 1465. P. 17-36. 30. ReaP.A., Poole R, J. Vacuolar HMranslocating pyrophosphatase // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1993. Vol. 44. P. 157-180. 31. ReaPA., Griffith Ch. J., Manolson M. E, Sanders D. Irreversible inhibition of Ht-ATPase of higer plant tonoplast by chaotropic anions: evidence for periferal location of nucleotide-binding subunits//Biochim. Biophys. Acta. 1987. Vol. 904. N 1. P. 1-12. 32. Ros R., Romieu C., GibratR., Grignon C. The plant inorganic pyrophosphatase does not transport K+ in vacuole membrane vesicles multilabeled with fluorescent probes for H+, K+, and membrane potencial // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 1-7. 33. SatoM.H., Kasahara M., Ishii N.. HomaredaH., Matsui H„ Yoshida M. Purified vacuolar inorganic pyrophosphatase consisting of a 75-kDa polypeptide can pump H+ into reconstituted proteoliposomes//J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 6725-6728. 34. Schumak-er K. S., Sze H. A Ca27H+ antiport system driven by a tonoplast H+-ATPase from oat roots // Plant Physiol. 1985. Vol. 79. N 4. P. 1111-1117. 35. Sze H„ Hodges T.K. Selektivity of alkali cation influx across the plasma membrane of oat roots//Plant Physiol. 1977. Vol. 59. N 4. P. 641-646. 36. Ud-vardiM.K., Price G.D., GresshoffP.M., DayD.A. A dicarboxylate Transporter on the peribacterioid membrane of soybean nodules//FEBS lett. 1988. Vol. 231. N 1. P. 36-40. 37. Wada Y., Anraku Y. Chemiosmotic coupling of ion transport in the yeast vacuole: its role in acidification incide organelles//J. Bioenerg. Biomembr. 1994. Vol. 26. N 6. P. 631-637. 38. Ward J. M„ Sze H. Proton transport activity of the purified vacuolar H+-ATPase from oats//Plant Physiol. 1992. Vol. 99. P. 925-931. 39. White P. J., Broadley M. R. Calcium in plants//Annals of Bot. 2003. Vol. 92. N 4. P. 487-511.
Статья принята к печати 27 сентября 2007 г.
