CC BY
42
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2017, том 52, № 6, с. 1251-1258
Ветеринарная вирусология, иммунология
УДК 636.4:619:578:577.2.08:51-76 doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1251rus
ПОЛУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК I329L ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ*
С.А. КАТОРКИН, Е.И. КАТОРКИНА, К.А. МИМА, И.А. ТИТОВ, А.С. МАЛОГОЛОВКИН
Вирус африканской чумы свиней (АЧС, African swine fever virus, ASFV) — крупный ДНК-содержаний вирус, единственный представитель семейства Asfarviridae. Вирус АЧС обладает разнообразными механизмами уклонения от иммунной системы хозяина, что становится препятствием для создания средств защиты от болезни. Один из способов иммунного уклонения, используемых вирусом, — мимикрия Toll-подобных рецепторов (TLR) иммуномодулирующими белками. Иммуномодулирующие белки вируса АЧС можно рассматривать как потенциально ценные инструменты для понимания патогенеза заболевания и создания средств борьбы с ним. Так, белок рI329L служит антагонистом и ингибитором сигнального пути TLR3, уменьшающим ин-терфероновый ответ. Белок рI329L ингибирует TLR3-опосредованную активацию NF-кВ и индукцию INF-b через активацию TLR3 с его лигандом — вирусной ДНК, РНК и poly(I:C). Удаление этого белка из ASFV служит рациональным подходом к разработке ослабленной вирусвакци-ны. Следовательно, I329L представляет собой вирусный антагонист TLR3, что негативно отражается на интерфероновом противовирусном ответе хозяина. Целью настоящей работы было получение клеточной линии CHO (клетки яичника китайского хомячка), стабильно экспрессиру-ющей рекомбинантный белок I329L ASFV. Нами сконструирована плазмида pBMN-I329-his, несущая полноразмерный ген I329L ASFV с полигистидиновой меткой (His-tag) на C-конце. При помощи электропорации и культивирования в среде с антибиотиком пуромицином была получена стабильная клеточная линия CHO-I329L-His, несущая рекомбинантную плазмиду pBMN-I329-his. Встраивание гена I329L в геном клеток выявляли в ПЦР с геноспецифическими праймерами с последующим нуклеотидным секвенированием, используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из клеток CHO-I329L-His. С помощью иммуноблотинга подтверждено наличие белка I329L в лизате клеток. Размер рекомбинантного белка составлял 55 кДа при расчетной молекулярной массе 35 кДа. Последовательное дегликозилирование целевого белка эндогликозидазами PNGase и Endo H приводило к увеличению его электрофоретической подвижности и детектированию спейсцифических полос ~ 37 и ~ 35 кДа. Этот факт подтверждает высокую степень гликозилиро-вания целевой молекулы, что приводит к меньшей электрофоретической подвижности. Дополнительно показано, что рекомбинантный белок I329L взаимодействовал с гипериммунными сыворотками против штамма Ставрополь 01/08 ASFV, что свидетельствовало об его аутентичности вирусному белку. Полученная стабильная клеточная линия CHO-I329L-His депонирована в музей клеточных культур Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии и может быть использована для изучения иммуномодулирующих локусов ASFV.
Ключевые слова: африканская чума свиней, ASFV, сигнальный путь TLR3, экспрессия, рекомбинантный белок pI329L, стабильная клеточная линия.
Африканская чума свиней (АЧС; возбудитель — вирус из семейства Asfarviridae, род Asfivirus, African swine fever virus, ASFV) — инфекционная болезнь диких и домашних свиней, характеризующаяся высокой летальностью и контагиозностью, сверхострым, острым, подострым и хроническим течением, передающаяся от больных животных и вирусоносителей контактным и алиментарным путем. В Российской Федерации АЧС регистрируется с 2007 года. На протяжении последних лет страна считается территорией стационарного неблагополучия по этому заболеванию (1).
Геном вируса состоит из линейной двухцепочечной ДНК (дцДНК) размером около 170 и 190 т.п.н. в зависимости от изолята. К вирусу АЧС восприимчивы все представители семейства Suidae. Основной резервуар вируса — мягкие клещи рода Ornithodoros (2). Нуклеотидные последовательности генома референтого штамма Ba71V ASFV содержат 150 открытых ра-
* Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00090).
мок считывания (open reading frame, ORF). В инфицированных ASFV клетках выявлено 95 полипептидов с молекулярной массой от 10 до 220 кДа (1). ASFV обладает разнообразными механизмами уклонения от иммунной системы хозяина, что становится основным препятствием для создания средств защиты от болезни (3). Один из используемых вирусом способов иммунного уклонения основан на мимикрии Toll-подобных рецепторов (TLR). Эти рецепторы ответственны за опознавание вирусной двухцепочеч-ной РНК (ДНК) и активируют врожденный иммунитет (4). На сегодняшний день у млекопитающих известно 13 Toll-подобных рецепторов. Они активируются различными лигандами, в основном структурными компонентами бактерий и вирусов. Рецепторы также различаются адаптерными пептидами, с которыми связываются их цитозольные фрагменты (5).
Один из белков ASFV, участвующих в модуляции опосредованного Toll-подобным рецептором механизма защиты, — рI329L, антагонист и ингибитор сигнального пути TLR3 (6, 7). Функциональный анализ показывает, что pI329L ингибирует TLR3-опосредованную активацию NF-кВ и IFN-b через активацию TLR3 с лигандом — вирусной ДНК, РНК или poly (I:C) (8, 9). Следовательно, белок I329L служит вирусным антагонистом TLR3, что негативно отражается на интерфероновом противовирусном ответе хозяина (10). В настоящее время отсутствует какая-либо информация о белке I329L ASFV, циркулирующего на территории России. Нет данных о его генетической стабильности (11, 12), а также инструментов (стабильная клеточная линия) для изучения механизма действия иммуномодулирующего белка рI329L ASFV российского происхождения.
В этой статье нами впервые предоставлены данные о рекомбинант-ном белке I329L — продуценте клеточной линии млекопитающих (CHO), аутентичном вирусному белку ASFV.
Цель работы — получение стабильной клеточной линии, экспресси-рующей рекомбинантный белок I329L вируса африканской чумы свиней.
Методика. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности белка I329L взяты из базы данных UniProt (референсный номер E0WM90). Дизайн плазмиды pBMN-I329L-his моделировали в программе Clone Manager 7.0 («Sci-Ed Software», США). ДНК выделяли из референтного штамма Ставрополь 01/08 ASFV (Государственная коллекция ФГБУ ФИЦВиМ) (20) с помощью набора QIAamp DNA Blood, Mini Kit («Qiagen N.V.», Германия).
Постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли с использованием Phusion полимеразы («NEB», США) согласно инструкции производителя. Реакционная смесь включала 10 мкл 5* Phusion HF буфера, 1 мкл 10 мМ dNTPs, 2 мкл 10 мкМ F329his, 2 мкл 10 мкМ R329his, 1,5 мкл DMSO, 0,5 мкл Phusion DNA Polymerase, 1 мкл вирусной ДНК и 31 мкл стерильной воды. В работе использовали пару праймеров: F329his (прямой) — 5'-TATATAAAGCTTGCCACCATGCTAAGGGTTTTCATA-3', R329his (обратный) — 5'-TATATATCTAGATTATCAATGGTGGTGGTGATGGTGC-TTTCTTCTTGAACATGAA-3'. R329his содержал His-tag пептидную метку на C'-конце. Амплификацию целевого гена проводили по протоколу: предварительная денатурация 5 мин при 98 °С; денатурация 30 с при 98 °С, отжиг праймеров 30 с при 52 °С, элонгация 60 с при 72 °С (25 циклов). Ам-плифицированный продукт ожидаемого размера был идентифицирован в 1,3 % ТБЕ-агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.
ДНК очищали от агарозного геля c помощью набора Gel Extraction Kit («Qiagen N.V.», Германия) согласно инструкции производителя. ПЦР-продукт I329L клонировали по сайтам эндонуклеазного расщепления HindIII
и Xbal («NEB», США) в вектор pBMN («Addgene», США), имеющий гены устойчивости к ампициллину и пуромицину. Лигирование вектора и вставки осуществляли с помощью ДНК-лигазы фага Т4 («NEB», США) в объеме 5 мкл (0,5 мкл 10* лигазного буффера, 1 мкл линеаризованного вектора pBMN, 0,5 мкл ПЦР-продукта I329L, 0,5 мкл ДНК лигазы Т4 и 2,5 мкл стерильной воды) при комнатной температуре в течение 1 ч.
Трансформацию клеток Escherichia coli штамма XL-10 Gold, генотип endAl glnV44 recAl thi-1 gyrA96 relAl lac Hte A(mcrA)183 A(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 tetR F'(proAB lacIqZAM15 Tn10(TetR Amy CmR), лигазной смесью проводили стандартным методом теплового шока. ДНК плазмид выделяли с помощью набора Plasmid Mini Kit («Qiagen N.V.», Германия). Выделенные плазмидные ДНК клонов проверяли с помощью аналитической рестрикции с использованием фланкирующих эндонуклеаз HindIII и Xbal. Точность воспроизведения последовательности клонированного фрагмента подтверждали с помощью секвенирования на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl («Applied Biosystems», США).
Трансфекцию клеточной линии CHO (клетки яичника китайского хомячка) осуществляли с помощью электропорации на приборе Gene Pulse Xcell («Bio-Rad», США). Перевиваемую линию клеток CHO культивировали в шейкере-инкубаторе при 37 "С и 5 % СО2 в среде BalanCD («Irvine», США) c добавлением 500000 ЕД пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 4 мМ L-глютамина. Жизнеспособность и количество живых клеток оценивали при окрашивании 1 % раствором трипанового синего («Gibco», США). Для этого в пробирку отбирали 20 мкл клеточной суспензии, к которой добавляли 80 мкл 1 % раствора трипанового синего (окрашивание мертвых клеток) и затем тщательно перемешивали. Результаты учитывали на автоматическом счетчике клеток NucleoCounter NC100 («ChemoMetec», Дания).
Белок I329L ASFV выделяли с помощью магнитных частиц Dyna-Beads His-tag («Thermo Scientific», США). Для дегликозилирования белка I329L использовали пептид-^гликозидазу F (PNGаза F) («NEB», США) и эндогликозидазу H (Endo H) («NEB», США). Детекцию целевого белка осуществляли иммуноблотингом в 12,5 % полиакриламидном геле с последующим переносом в системе Trans-Blot Turbo («Bio-Rad», США) на нитро-целлюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Мембрану инкубировали с кроличьими поликлональными антителами к 6* His-tag (HRP) («Abcam», США). Для визуализации реакции применяли хемилюминесцентные реагенты («Advansta», США). Специфичность рекомбинантного белка I329L подтверждалась взаимодействием с гипериммунными свиными сыворотками от животных, зараженных штаммом Ставрополь 01/08 ASFV (Государственная коллекция ФГБУ ФИЦВиМ), и коммерческими антивидовыми антителами козы против IgG свиньи, меченными пероксидазой хрена (HRP) («Santa Cruz Biotechnology», США).
Результаты. В работе использовали ДНК, экстрагированную из культуры клеток костного мозга свиней, инфицированных штаммом Ставрополь 01/08 ASFV. Полученную матрицу использовали при постановке ПЦР с геноспецифическими праймерами (F329his и R329his) для амплификации фрагмента с сайтами рестрикции и последующим клонированием в вектор pBMN. В результате получили ПЦР-продукт размером 1023 п.н. При ли-гировании соотношение вектора и вставки составило 1:3.
Аналитическая рестрикция по сайтам фланкирующих эндонуклеаз подтвердила наличие специфической вставки гена I329L (рис. 1, Б) у четырех клонов. Их верифицировали секвенированием на корректность вставки
и наличие замен или делеций. После сравнительного выравнивания нук-леотидных и аминокислотных последовательностей был отобран клон pBMN-I329L-his, идентичный последовательности референсного гена I329L штамма Georgia/wb/2007 ASFV (FR682468).
А
.anrü
pBMN-329-his
М п.о.
Д-зооо
Н-2000
"-1500 -1200 -1Q00 -900 -800 -700 1-600 ■500 ■400 -300 -200 -100
Рис. 1. Схема плазмиды pBMN-I329L-his, несущей целевой ген I329L вируса африканской чумы свиней (ASFV) (А), и скрининг клонов плазмиды pBMN-I329L-his с помощью аналитической рестрикции эндонуклеазами HindIII и XbaI («NEB», США) (Б): 1-4 — клоны №№ 1-4 pBMN-I329L-his, М — маркер молекулярной массы 100 bp Plus («Fermentas», США).
Рис. 2. Жизнеспособность (А) и скорость роста (Б) клеточной линии CHO-I329L-His (1) и исходной клеточной линии CHO (2) в процессе 7-суточного культивирования на среде BalanCD с добавлением 5 мкг/мл селективного антибиотика пуромицина («АррЦОДет», Германия).
При создании стабильной клеточной линии CHO-I329L-His использовали культуру клеток СНО, находящуюся в фазе логарифмического роста. Жизнеспособность клеток, трансфицированных плазмидой рВМ^ I329L-his, оценивали через 24 и 48 ч в тесте с трипановым синим. Через 24 ч после трансфекции клеток СНО плазмидой pBMN-I329L-his жизне-
Б
способность клеток составила 70 %, плотность суспензии живых клеток — 1,0 млн/мл (в контрольной трансфекции без плазмиды эти показатели составили соответственно 92 % и 1,0 млн/мл). Повторный анализ клеток проводили на 48-й ч после трансфекции. При этом доля живых клеток увеличилась до 83 %, количество живых и трансфицированных плазмидой клеток — до 2,2 млн/мл; в контроле показатели возросли соответственно до 94 % и 4,0 млн/мл. Полученные данные подтвердили эффективность трансфекции клеток CHO и возможность их дальнейшей селекции в среде с пуромицином («AppHChem», Германия). Через 48 ч после трансфекции весь пул клеток перенесли в ростовую среду BalanCD с добавлением пу-ромицина в конечной концентрации 5 мкг/мл.
При модельном 7-суточном суспензионном культивировании мы оценили динамику жизнеспособности и концентрацию жизнеспособных трансфицированных клеток в сравнение с родительской клеточной линией CHO (рис. 2). По результатам эксперимента, 80 % порог жизнеспособности был достигнут только на 7-е сут культивирования. На протяжении 7 сут в стабильной клеточной линии CHO-I329L-His присутствовало более 80 % жизнеспособных клеток.
Интеграцию гена I329L ASFV в геном клеточной линии CHO подтвердили в ПЦР, использовав в качестве внутреннего положительного контроля референсные праймеры для ^актина (NM_001244575.1) и цитохрома Ь (AB033693) клеточной линии CHO. В результате последовательности гена I329L были выявлены в тотальной геномной ДНК, выделенной из стабильной клеточной линии CHO-I329L-His (рис. 3, А).
А
12 3 4
Рис. 3. Анализ интегрирования гена I329L вируса африканской чумы свиней (ASFV) и продуцента клеточной линии CHO-I329L-His методами ПЦР и иммуноблотинга.
А: Выявление гена I329L в геноме клеточной линии CHO-I329L-His при электро-форетическом разделении ПЦР-продуктов: 1 — амплифицированный ген I329L из клеток стабильной клеточной линии CHO-I329L-His; 2 — амплифицированный ген b-актина из клеток стабильной клеточной линии CHO-I329L-His; 3 — амплифицированный ген цитохрома b из клеток стабильной клеточной линии CHO-I329L-His; М — маркер молекулярной массы 100 bp Plus («Fermentas», США).
Б: Иммуноблотинг рекомбинантного белка I329L ASFV после дегликозирования эндогликозидазами EndoH и PNGaseF при использовании His-taq антител: 1 — белок I329L, выделенный на магнитных частицах DynaBeads His-tag («Thermo Scientific», США); 2 — белок I329L, обработанный эндогликозидазой EndoH («NEB»,США); 3 — белок I329L, обработанный эндогликозидазой PNGase F («NEB», США); М — маркер молекулярной массы Page Presteined Ruler («Fermentas», США).
В: Иммуноблотинг рекомбинантного белка I329L, связанного с гипериммунной сывороткой против ASFV: 1 — белок I329L, выделенный на магнитных частицах DynaBeads His-tag («Thermo Scientific», США); М — маркер молекулярной массы Page Presteined Ruler («Fermentas», США).
Анализ экспрессии целевого белка I329L ASFV проводили с помощью иммуноблоттинга с использованием специфических антител к His-tag, находящемуся на C-конце молекулы. Для этого клетки (5^10), отобранные от стабильной клеточной линии, подвергали лизису с последующим концентрированием на магнитных частицах DynaBeads His-Tag. Им-муноблотинга подтвердил продукцию белка I329L в стабильной клеточной линии CHO-I329L-His. Однако по результатам анализа можно сделать вывод, что продукт экспрессии белка I329L, размер которого находился в пределах 55-60 кДа (см. рис. 3, Б), не соответствовал расчетной молекулярной массе (35 кДа). Этот факт можно объяснить высокой степенью гликозилирования белка I329L, что снижает электрофоретическую подвижность молекулы. Полученные данные также подтверждаются биоин-форматическим анализом (установлено наличие 9 сайтов N-гликозилиро-вания) (15, 17). Дополнительно можно наблюдать слабую полосу с молекулярной массой 35 кДа (см. рис. 3, Б), наличие которой может объяснять трансляцию белка с одного из трех стартовых кодонов (ATG) в его экстраклеточной области (17, 18). Следует отметить, что на электрофореграм-ме также наблюдались следы протеолизного расщепления целевого белка.
В результате обработки рекомбинантного белка I329L эндогликози-дазой Endo Н или PNG-азой F его молекулярная масса уменьшалась до ~37 (Endo Н) и ~35 кДа (PNGазой F), следовательно, исходно экспрессиру-емый белок I329L был высокогликозилированным (см. рис. 3, Б). Кроме того, молекулярная масса I329L, обработанного PNGазой F, оказалась ниже, чем после расщепления эндогликозидазой Endo H, что указывало на присутствие небольшого количества сложных гликанов.
При анализе связывания I329L c гипериммунной сывороткой от животных, зараженных штаммом Ставрополь 01/08, с помощью имму-ноблотинга наблюдали образование иммунных комплексов I329L c полик-лональными антителами к ASFV (см. рис. 3, В).
Таким образом, мы получили стабильную клеточную линию CHO-I329L-His, экспрессирующую рекомбинантный полноразмерный трансмембранный белок I329L вируса африканской чумы свиней ASFV. Клеточная линия CHO-I329L-His обладает схожими фенотипическими и ростовыми свойствами с родительской линией CHO. Рекомбинантный белок I329L ASFV не токсичен для клеток СНО. Встройка гена I329L в геном клеток CHO подтверждена методом ПЦР и с помощью анализа экспрессии целевого белка. Выявлено наличие гликозилированных форм белка I329L ASFV. По результатам анализа связывания I329L с гипериммунной сывороткой против ASFV показана его антигенная специфичность. Клеточная линия CHO-I329L-His представляет собой уникальную модель для изучения взаимодействия ASFV с клеткой и создания дефектных реком-бинантных ASFV в качестве кандидатных вакцин. Стабильная клеточная линия CHO-I329L-His депонирована в музей клеточных культур Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии. Культура клеток может быть использована для изучения механизмов действия иммуномодулирующих белков и позволит получить новые данные о биологических свойствах ASFV.
ЛИТЕРАТУРА
1. Середа А.Д., Колбасов Д.В. Белки вируса африканской чумы свиней. Научный журнал Кубанского ГАУ, 2012, 77(3).
2. Gogin A., Gerasimov V., Malogolovkin A., Kolbasov D. African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007-2012. Virus Res., 2013, 173(1): 198-203.
3. Колбасов Д.В., Балышев В.М., Середа А.Д. Итоги разработки живых вакцин против африканской чумы свиней. Ветеринария, 2014, 8: 3-8.
4. Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol., 2004, 5(10): 987-995 (doi: 10.1038/ni1112).
5. Yamashita M., Cha11op adhy ay S., Fensterl V., Zhang Y., Sen G.C. TRIF-independent branch of TLR3 signaling. J. Immunol., 2012, 188(6): 2825-2833 (doi: 10.4049/jimmunol.1103220).
6. Jin M.S., Lee J.O. Structures of TLR-ligand complexes. Immunity, 2008, 29(2): 182-191 (doi: 10.1016/j.immuni.2008.07.007).
7. Rodriguez J.M., Sal as M.L., Vinuela E. Genes homologous to ubiquitin-conjugating proteins and eukaryotic transcription factor SII in African swine fever virus. Virology, 1992, 186(1): 40-52 (doi: 10.1016/0042-6822(92)90059-X).
8. De Oliveira V.L., Almeida S.C., So ares H.R., Crespo A., Marshall-Clarke S., Parkhouse R.M. A novel TLR3 inhibitor encoded by African swine fever virus (ASFV). Arch. Virol., 2011, 156(4): 597-609 (doi: 10.1007/s00705-010-0894-7).
9. Bell J.K., Askins J., Hall P.R., Davies D.R., Segal D.M. The dsRNA binding site of human Toll-like receptor 3. PNAS, 2006, 103: 8792-8797 (doi: 10.1073/pnas.0603245103).
10. de Oliveira V.L., Almeida S.C.P., Soares H.R., Crespo A., Marshall-Clarke S., Parkhouse R.M.E. A novel TLR3 inhibitor encoded by African swine fever virus (ASFV). Arch. Virol., 2011, 156(4): 597-609 (doi: 10.1007/s00705-010-0894-7).
11. Goller K.V., Malogolovkin A.S., Katorkin S., Kolbasov D., Titov I., H о per D., Beer M., Keil G.M., Portugal R., Blome S. Tandem repeat insertion in African swine fever virus, Russia, 2012. Emerg. Infect. Dis., 2015, 21(4): 731-732 (doi: 10.3201/eid2104.141792).
12. Malogolovkin A., Burmakina G., Titov I., Sereda A., Gogin A., Ba-ryshnikova E., Kolbasov D. Comparative analysis of African swine fever virus genotypes and serogroups. Emerg. Infect. Dis., 2015, 21(2): 312-315 (doi: 10.3201/eid2102.140649).
13. Takeuchi O., Hemmi H., Akira S. Interferon response induced by Toll-like receptor signaling. J. Endotoxin. Res., 2004, 10: 252-256.
14. O'Neill L.A., Bowie A.G. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling. Nature reviews. Immunology, 2007, 7(5): 353-364 (doi: 10.1038/nri2079).
15. Barton G.M., Medzhitov R. Toll-like receptor signalling pathways. Science, 2003, 300: 1524-1525 (doi: 10.1126/science.1085536).
16. Brikos C., O'Neill L.A. Signalling of toll-like receptors. Handbook of Experimental Pharmacology, 2008, 183: 21-50.
17. Watte rs T.M., Kenny E.F., O'Neill L.A. Structure, function and regulation of the Toll/IL-1 receptor adaptor proteins. Immunol. Cell Biol., 2007, 85(6): 411-419 (doi: 10.1038/sj.icb.7100095).
18. Yamamoto M., Sato S., Mori K., Hoshino K., Takeuchi O., Takeda K., Akira S. Cutting edge: a novel Toll/IL-1 receptor domain-containing adapter that preferentially activates the IFN-beta promoter in the Toll-like receptor signaling. J. Immunol., 2002, 169(12): 6668-6672 (doi: 10.4049/jimmunol.169.12.6668).
19. Kawai T., Akira S. Antiviral signaling through pattern recognition receptors. J. Biochem., 2007, 141(2): 137-145 (doi: 10.1093/jb/mvm032).
20. Балышев В.М., Колбасов Д.В., Куриннов В.В., Калантаенко Ю.Ф., Цыбанов С.Ж., Жуков А.Н., Васильев А.П. Штамм Ставрополь 01/08 вируса африканской чумы свиней для вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований. Патент РФ № 2439152. Опубл. 10.01.2012. Бюл. № 1.
21. Fr 4 czyk M., Wo z niakowski G., Kowalczyk A., Bocian L., Kozak E., Niemczuk K., Pejsak Z. Evolution of African swine fever virus genes related to evasion of host immune response. Vet. Microbiol., 2016, 25(193): 133-44 (doi: 10.1016/j.vetmic.2016.08.018).
22. Колбасов Д.В., Балышев В.М., Середа А.Д. Итоги разработки живых вакцин против африканской чумы свиней. Ветеринария, 2014, 8: 3-8.
23. Lien E., Ingalls R.R. Toll-like receptors. Crit. Care Med., 2002, 30(1): S1-S11 (doi: 10.1097/00003246-200201001-00001).
24. С е р е д а А.Д., Б а л ы ш е в В.М. Антигенное разнообразие вируса африканской чумы свиней. Вопросы вирусологии, 2011, 4: 38-42.
25. Chapman D.A., Tcherepanov V., Upton C., Dixon L.K. Comparison of the genome sequences of non-pathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates. J. Gen. Virol., 2008, 89(2): 397-408 (doi: 10.1099/vir.0.83343-0).
26. J ia N., O u Y., P e j s ak Z., Z ha n g Y., Z ha n g J. Roles of African swine fever virus
structural proteins in viral infection. J. Vet. Res. 2017, 61(2): 135-143 (doi: 10.1515/jvetres-2017-0017).
27. Sanna G., Dei Giudici S., Bacciu D., Angioi P.P., Giammarioli M., De Mia G.M., Oggiano A. Improved strategy for molecular characterization of African swine fever viruses from Sardinia, based on analysis of p30, CD2V and I73R/I329L variable regions. Transbound. Emerg. Dis., 2017, 64(4): 1280-1286 (doi: 10.1111/tbed.12504).
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр Поступила в редакцию
вирусологии и микробиологии, 8 июля 2017 года
601125 Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н, пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, стр. 1, e-mail: mima89@ya.ru, Amalogolovkin@vniivvim.ru
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2017, V. 52, № 6, pp. 1251-1258
OBTAINING A STABLE CELL LINE EXPRESSING RECOMBINANT I329L PROTEIN OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS
S.A. Katorkin, E.I. Katorkina, K.A. Mima, I.A. Titov, A.S. Malogolovkin
Federal Research Center for Virology and Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 1, ul. Akad-emika Bakuleva, pos. Vol'ginskii, Petushinskii Region, Vladimir Province, 601125 Russia, e-mail e-mail mi-ma89@ya.ru, Amalogolovkin@vniivvim.ru (corresponding author) ORCID:
Katorkin S.A. orcid.org/0000-0001-7473-6692 Katorkina E.I. orcid.org/0000-0003-3329-0182
Mima K.A. orcid.org/0000-0001-7184-6968 Titov I.A. orcid.org/0000-0002-5821-8980
Malogolovkin A.S. orcid.org/0000-0003-1352-1780 The authors declare no conflict of interests Acknowledgements:
Supported financially by Russian Science Foundation (grant № 16-16-00090)
Received July 8, 2017 doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1251eng
Abstract
The African swine fever virus (ASFV), a large DNA virus with icosahedral morphology, is the only representative of the family Asfarviridae. ASFV has a wide list of mechanisms for evading the host's immune system. This fact hinders the development the vaccines against ASF. One of the approaches used by the virus in immune evasion is the mimicry of Toll-like receptors (TLR) by im-munomodulating proteins. ASFV immunomodulatory proteins are the most valuable tools for the understanding of the pathogenesis of the disease and to create a means of combating the disease. One such ASFV protein is pI329L, the antagonist and TLR3 signaling inhibitor, which reduces the interferon response of the body. Protein pI329L inhibits TLR3-mediated activation of NF-kB and induction of INF-b through the activation of TLR3 with its ligand — viral DNA, RNA and poly (I:C). Removing this protein from ASFV particles is a rational approach to developing a weakened virus vaccine. Therefore, I329L is characterized as a viral TLR3 antagonist, which negatively affects interferon antiviral response of the host. Purpose of the work was to obtain a CHO cell line stably expressing a TLR3 antagonist, the recombinant I329L protein of ASFV. Here, we designed the plas-mid pBMN-I329-his, carrying the full-length I329L gene with 6xHis-tag at the C-terminus. By elec-troporation with plasmid pBMN-I329-his of the CHO cell line and further stabilization on a selective antibiotic (5 ^g/ml puromycin), a stable CHO-I329L-His cell line was derived. The insertion of the I329L gene into the genome of the cell was confirmed by PCR using primers of the specific gene, followed by nucleotide sequencing, using as the template DNA isolated from the cells CHO-I329L-His. Western Blot confirmed the presence of I329L protein in the cell lysates of CHO-I329L-His. As a result of the analysis it was established that the size of the recombinant protein was 55 kDa compared to calculated 35 kDa. The sequential deglycosylation of endoglycosidases PNGase and Endo H of the target protein resulted in an increase in its electrophoretic mobility and detection of specific bands of ~ 37 and ~ 35 kDa. This fact confirms the high degree of glycosylation of the target molecule, which leads to a lower electrophoretic mobility. Additionally, the recombinant I329L protein was recognized by hyperimmune sera against the ASFV, which indicated its authenticity. The obtained stable cell line CHO-I329L-His is deposited in the cell culture museum of Federal Research Center for Virology and Microbiology and can be used to study the mechanisms of action of immunomodulating proteins, such as pI329L of the ASFV, and, therefore, to get deeper insight of the African swine fever virus biology.
Keywords: African swine fever, ASFV, TLR3 signalling, protein expression, recombinant pI329L, stable cell line.
