CC BY
38
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2018, том 53, № 4, с. 860-867
УДК 636.4:619:578:[577.2.08+51-76 doi: 10.15389/agrobiology.2018.4.860rus
ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОСТИ, ИММУНОГЕННОСТИ И ПРОТЕКТИВНОСТИ ДНК-КОНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФРАГМЕНТЫ ГЕНОВ CP204L, E183L И EP402R ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ*
А.Р. ИМАТДИНОВ, О.А. ДУБРОВСКАЯ, Д.Ю. МОРОЗОВА, В.М. ЛЫСКА,
А.Д. СЕРЕДА
Африканская чума свиней (АЧС, ASF) — вирусная контагиозная септическая болезнь, поражающая диких и домашних свиней всех пород и возрастов. У домашних свиней и диких европейских кабанов отмечают сверхострое или острое течение заболевания с лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и смертностью до 100 %. В эндемичных регионах (некоторые страны Восточной Африки) описана подострая форма болезни со смертностью от 30 до 70 %, а также хроническая — с очень низкой смертностью (S. Blome с соавт., 2013; C. Gabriel с соавт., 2011; J.M. Sánchez-Vizcaíno с соавт., 2015). Против АЧС вакцин нет. Исследования по разработке живых, инактивированных, субъединичных вакцин пока не принесли желаемых результатов (P.J. Sánchez-Cordyn с соавт., 2017; V. O'Donnell с соавт., 2016; S. Blome с соавт., 2014). В ряде лабораторий мира в качестве перспективы рассматривается возможность получения ДНК-вакцины на основе генов потенциально протективных белков вируса АЧС (ASFV) — р30, р54 и CD2v. Белки р30 и р54 функционально важны в прикреплении ASFV к клетке-мишени. Антитела к р54 блокируют связывание вириона с макрофагом, тогда как антитела к р30 ингибируют проникновение вириона в клетку. CD2v обусловливает гемадсорбирующие свойства вируса (S.D. Kol-lnberger с соавт., 2002; M.G. Barderas с соавт., 2001; J.G. Neflan с соавт., 2004). В своем исследовании мы оценили антигенные, иммуногенные и протективные свойства продуктов трансляции ре-комбинантных плазмид pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 и pCI-neo/ASFV/CD2v при индукции в адгезивных клетках (А-клетках) аутологичных первичных культур лейкоцитов крови свиней (ЛС). Антигенную активность рекомбинантных белков, продуцируемых используемыми ДНК-конструкциями, определяли методом прямой иммунофлуоресценции в культурах клеток HEK-293T и ЛС. Максимум экспрессии антигенно активных продуктов трансляции в клетках HEK-293T и ЛС, трансфицированных pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v, наблюдали на 2-3-и сут. Особенность схемы иммунизации состояла в том, что свиней трижды (с интервалом 14 сут) иммунизировали А-клетками аутологичной культуры ЛС, трансфицированными in vitro рекомбинантными плазмидными ДНК-конструкциями. Для этого от свиней №№ 1-4 получали по 90 см3 культуры клеток ЛС. На 2-е сут культивирования в них вносили по 90 мкг pCI-neo/ASFV/p30 (№ 1), pCI-neo/ASFV/p54 (№ 2) или pCI-neo/ASFV/CD2v (№ 3). От свиньи № 4 90 см3 культуры ЛС делили на три части по 30 см3 и трансфицировали каждую одной из трех конструкций (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v), внося по 30 мкг плазмидной ДНК. Через 2 сут свиньям №№ 1-4 вводили в центральную ушную вену около 107 аутологичных трансфицированных А-клеток культур ЛС. Методами непрямого твердофазного им-муноферментного анализа и иммуноблоттинга мы не обнаружили антител к белкам ASFV в крови иммунизированных животных на 14-е, 28-е и 42-е сут. На 42-е сут после заражения свиней ASFV штамма Мозамбик 78 в область шеи в дозе 102 ГАЕ50 четыре иммунизированные свиньи (№№ 1-4) пали на 6-8-е сут, а контрольная (№ 5, не иммунизирована) — на 13-е сут. Таким образом, иммунизация аутологичными антигенно активными А-клетками ЛС, трансфицированными рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v, не индуцировала выработку вирусоспецифических антител и защиту от контрольного заражения.
Ключевые слова: африканская чума свиней, ASFV, рекомбинантные плазмиды, белки ASFV р30, р54 и CD2v, антигенность, иммуногенность.
Африканская чума свиней (АЧС, ASF) — вирусная контагиозная септическая болезнь, поражающая диких и домашних свиней всех пород и возрастов. У домашних свиней и диких европейских кабанов отмечают сверхострое или острое течение заболевания с лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и смертностью до 100 %. В эндемичных регионах (некоторые страны Восточной Африки) отмечают подострую форму со смертностью от 30 до 70 %, а также хроническую — с очень низкой
* Работа выполнена в рамках проекта РНФ «Создание кандидатной вакцины против африканской чумы
свиней на основе химерных вирусов» (проект № 16-16-00090). 860
смертностью (1-3). Исследования по разработке живых, инактивированных, субъединичных вакцин пока не принесли желаемых результатов (4-6). Определенные надежды возлагаются на конструирование рекомбинантных ДНК-вакцин (7, 8).
Вероятно, формирование специфической защиты при АЧС обеспечивается набором белков, которые индуцируют иммунологическую защиту, которую обеспечивают как цитотоксические Т-лимфоциты, так и анти-телозависимая клеточная цитотоксичность (9-11). На основании данных о локализации, структуре и функциональных свойствах вирусных белков, полипептидной специфичности антител в сыворотке крови свиней после введения аттенуированных или вирулентных штаммов вируса АЧС (ASFV), последствиях иммунизации свиней выделенными из зараженных клеток или рекомбинантными белками в качестве потенциально протективных рассматривают белки р30, р54 и CD2v. Белки р30 и р54 функционально важны для прикрепления ASFV к клетке-мишени. Антитела к р54 блокируют связывание вириона с макрофагом, тогда как антитела к р30 ингиби-руют проникновение вириона в клетку. Белок CD2v обусловливает гемад-сорбирующие свойства вируса (12-14).
Изучение иммуногенных и протективных свойств ДНК-конструкций, содержащих гены вирусных белков р30, р54 и CD2v, подтвердили важную роль клеточного иммунитета в формировании специфической защиты от АЧС, что открывает перспективы для разработки препаратов нового поколения (15-17).
Ранее мы сообщали о получении рекомбинантных плазмид pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v. Расчетные молекулярные массы немодифицированных рекомбинантных белков составили 21,6 кДа (гр30), 18,7 кДа (гр54) и 28,6 кДа (rCD2v). По реузльтатам имму-ноблоттинга, в перевиваемой культуре клеток HEK-293T молекулярная масса антигенно активных продуктов трансляции pCI-neo/ASFV/p30 составила 21,6 кДа, pCI-neo/ASFV/p54 — 20,9 кДа и 36,3 кДа (18). По данным P. Gуmez-Puertas с соавт. (19) и F. Rodriguez с соавт. (20), масса мономера полноразмерного р54 — 24-28 кДа. В клетках HEK-293T, трансфи-цированнных pCI-neo/ASFV/CD2v, транслированные вирусоспецифические полипептиды имели молекулярные массы 28,8; 39,8; 63,1 и 104,7 кДа. Первый из них по размеру соответствовал расчетной немодифицирован-ной молекуле rCD2v. Остальные, по-видимому, представляли собой формы, в разной степени модифицированные в процессе гликозилирования и тримминга. Эти результаты в основном соответствуют данным L.C. Goa-tley и L.K. Dixon (21), которые в клетках Vero, трансфицированных плаз-мидой SV5CD2vHA, идентифицировали полипептиды рекомбинантного CD2v с молекулярными массами 26; 63; 89 и 104 кДа.
В представляемой работе мы иммунизировали животных А-клетками аутологичной культуры ЛС, трансфицированными in vitro рекомбинантными плазмидами, для повышения эффективности индукции противокле-точных механизмов защиты от АЧС, однако, как оказалось, при этом не удалось достигнуть протективности.
Цель нашего исследования — определить антигенность, иммуно-генность и протективность продуктов трансляции рекомбинантных плаз-мид pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v.
Методика. Домашних свиней породы крупная белая массой 20-25 кг получали из сектора подготовки подопытных животных ФГБНУ ФИЦВиМ. Использовали перевиваемую клеточную линию НЕК-293Т (Human Embryonic Kidney 293) из музея культур клеток ФГБНУ ФИЦВиМ и полученную
первичную культуру лейкоцитов крови свиньи. Вирулентный штамм ASFV Мозамбик-78 (М-78) и его аттенуированный дериват — штамм МК-200 были взяты из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ (22).
Для приготовления культуры ЛС у каждого животного брали кровь (30-40 см3) из краниальной полой вены, для стабилизации крови использовали гепарин (20 ед/см3). Кровь выдерживали 50-60 мин при температуре 37 °С и собирали верхнюю фракцию, состоящую из плазмы и лейкоцитов. Ее центрифугировали при 2000 g 15 мин, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали до получения посевного материала лейкоцитов (4 млн/см3) в среде Игла МЕМ с 10 % гомологичной инактивированной (30 мин при 56 °С) сыворотки крови, пенициллином (100-200 ЕД/см3) и стрептомицином (100-200 мг/см3). Клетки культивировали в 6-луночных планшетах в С02-инкубаторе при 37 °С. За 1 ч до постановки трансфекции 2-суточную культуру клеток ЛС переводили на бессывороточную среду.
Трансфекцию клеток ДНК-конструкциями проводили в течение 6-8 ч с применением Lipofectamine® («Thermo Fisher Scientific», США) по стандартному протоколу. Затем заменяли среду культивирования на среду Игла МЕМ с 10 % гомологичной свиной сыворотки и инкубировали 2-3 сут.
Анти-ASFV положительные сыворотки получали по следующей схеме: домашним свиньям внутримышечно вводили ASFV штамм МК-200, в дозе 6,5 lg ГАЕ50 (0-е сут). На 17-е сут этих свиней заражали внутримышечно штаммом ASFV М-78 в дозе 103 ГАЕ50. В периоды проявления клинических признаков заболевания (гипертермия, отказ от корма, геморрагии на ушах и брюхе) больных животных лечили введением внутримышечно ежедневно по 100 мг/кг фосфонуксусной кислоты до восстановления нормальной температуры тела (3-5 сут). Тотальное обескровливание свиней проводили на 38-е сут после начала эксперимента.
Получение меченных изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) иммуноглобулинов из сывороток иммунных к АЧС свиней (анти-ASFV FITC-иммуноглобулинов) и постановку реакции прямой иммунофлуоресценции осуществляли по ГОСТ 28573-90 «Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы». Результаты учитывали при люминесцентной микроскопии на флуоресцентном микроскопе Eclipse E200 («Nikon Corp.», Япония). Сыворотки крови свиней исследовали на наличие антител к белкам ASFV методами непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) и иммуноблоттинга (23, 24).
Результаты. В работе использовали полученные нами ранее экс-прессирующие ДНК-конструкции (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v) с фрагментами генов CP204L, E183L, EP402R ASFV штамма МК-200 III сероиммунотипа (18).
Антигенную активность рекомбинантных белков, продуцируемых этими ДНК-конструкциями, изучали в культурах клеток HEK-293T и ЛС. Покровные стекла с трансфицированными клетками отбирали ежедневно и методом прямой иммунофлуоресценции определяли продукцию антигенно активных рекомбинантных белков. Максимум экспрессии в клетках HEK-293T и ЛС, трансфицированных pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v, наблюдали на 2-3-и сут (рис. 1).
Особенность схемы иммунизации свиней состояла в том, что ее проводили на 0-е, 14-е, 28-е сут с использованием А-клеток аутологичной культуры ЛС, трансфицированных in vitro используемыми рекомбинантны-ми плазмидами. Предполагалось, что иммунизация антигенпредставляющи-
Рис. 1. Динамика синтеза антигенно активных продуктов трансляции в клетках перевиваемой линии НЕК-293Т (А) и первичной культуры лейкоцитов свиньи (Б), трансфицированных реком-бинантной плазмидой pCI-neo/ASFV/p30: а, б, в, г — соответственно 0, 1, 2, 3 сут после трансфекции (люминесцентная микроскопия, Eclipse E200, «Nikon Corp.», Япония, увеличение Х100).
ми клетками (макрофагами) обеспечит эффективную индукцию противо-клеточных механизмов защиты против АЧС. Для этого за 4 сут до иммуни-
зации от свиней №№ 1-4 получали по 90 см3 культуры клеток ЛС. На 2-е сут культивирования в них вносили по 90 мкг pCI-neo/ASFV/p30 (№ 1), рС1-пео^БУ/р54 (№ 2) или pCI-neo/ASFV/CD2v (№ 3). От свиньи № 4 90 см3 культуры ЛС делили на три части по 30 см3 и трансфицировали каждую одной из трех конструкций (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v), внося по 30 мкг плазмидной ДНК. Через 2 сут культуральные среды с не прикрепившимися клетками ЛС сливали, а монослой трансфицированных (около 107 А-клеток) механически снимали с подложки, отмывали при 2000 g 10 мин, ресуспендировали в 3 см3 фосфатного буферного раствора (рН 7,2) и вводили в центральную ушную вену соответствующим аутологичным свиньям. За животными вели клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела. Методами непрямого ТФ ИФА и иммуноблоттинга мы не обнаружили в крови иммунизированных свиней антител к белкам ASFV на 0-е, 14-е, 28-е и 42-е сут. После контрольного заражения на 42-е сут штаммом М-78 ASFV в область шеи в дозе 102 ГАЕ50 четыре иммунизированные свиньи пали через 68 сут, а не иммунизированная (контрольная) — через 13 сут (рис. 2).
Свинья, которую иммунизировали А-клет-ками ЛС, трансфициро-ванными конструкцией рС1-пео^БУ/р30 (№ 1), пала через 6 сут без клинических признаков и при отсутствии патоло-гоанатомических проявлений. У остальных иммунизированных животных наблюдали повышение температуры тела, гибель на 7-8-е сут, а также характерные для АЧС патологоанатомиче-ские признаки (25). Заболевание у контрольного животного (№ 5) характеризовалось потерей аппетита с одновременным угнетением и повышением температуры тела до 41,2-41,3 °С, парезами и параличами задних конечностей. Отмечали выраженный цианоз кожных покровов в области ушей, брюха, конечностей и промежности. Патологоанатомическая картина была характерна для АЧС.
Существенным недостатком кандидатных ДНК-вакцин считается относительно низкая индукция иммунных реакций, особенно у крупных млекопитающих. Для преодоления этой проблемы применительно к АЧС испытано несколько подходов: нацеливание (таргетинг), убиквитинирова-ние, иммунизация библиотеками экспрессии и вирусы ВасМат (26). Первые попытки индуцировать защитный иммунный ответ против ASFV с использованием ДНК-конструкции, кодирующей два вирусных белка — р54 и р30 в виде химерного протеина (PQ), оказались неудачными. ДНК-конструкции, кодирующие только PQ, обеспечивали высокую продукцию антител у иммунизированных мышей, но не у свиней (8).
Иммунизация ДНК-конструкцией рСМV-sHAPQ, дополненной геном белка CD2v (НА), индуцировала у свиней гуморальный иммунный ответ, однако особи не были защищены от контрольного заражения, показывая клинические признаки АЧС и кинетику виремии, неотличимые от
Рис. 2. Динамика температуры тела у свиней, иммунизированных разными рекомбинантными белками ASFV (1-4), в период от заражения до гибели и у контрольного животного (5) после экспериментального заражения вирулентным штаммом ASFV Мо-замбик-78: 1 — р30, 2 — р54, 3 — СБ2^ 4 — р30, р54 и СБ2^
таковых у контрольных животных. Для того чтобы избежать нежелательной индукции антител и усилить специфические CD8+-Т-клеточные ответы, была разработана конструкция рСМУ-UbsHAPQ, кодирующая антигенные детерминанты p30, p54 и CD2v, слитые с клеточным убиквитином (Ubs). Двукратная иммунизация рСМУ-UbsHAPQ не индуцировала гуморальный ответ у свиней, но обеспечивала частичную защиту против контрольного заражения ASFV, подтверждая важность T-клеточного ответа в защите от этого вируса. Четырехкратная иммунизация рСМУ-UbsHAPQ стимулировала образование антител к р30 и р54, что приводило, по-видимому, к снижению протективного эффекта CD8+-Т-клеток (16). Не исключено, что более ранняя (по сравнению с контрольным животным) гибель иммунизированных свиней в нашем опыте обусловлена индукцией вирусоспецифических антител в титрах, недостаточных для обнаружения методами непрямого ТФ ИФА и иммуноблоттинга.
Таким образом, методом иммунофлуоресценции доказана экспрессия ASFV-специфических продуктов трансляции в клетках HEK-293T и лейкоцитах свиней, трансфицированных рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p5 и pCI-neo/ASFV/CD2v. Иммунизация свиней аутологичными лейкоцитов свиней, трансфицированными рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 или pCI-neo/ASFV/CD2v, не индуцировала выработку вирусоспецифических антител и защиту от контрольного заражения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Blome S., Gabriel C., Beer M. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar. Virus Res., 2013, 173(1): 122-130 (doi: 10.1016/j.virusres.2012.10.026).
2. Gabriel C., Blome S., Malogolovkin A., Parilov S., Kolbasov D., Teifke J.P., Beer M. Characterization of African swine fever virus Caucasus isolate in European wild boars. Emerg. Infect. Dis., 2011, 17(12): 2342-2345 (doi: 10.3201/eid1712.110430).
3. Sánchez-Vizcaíno J.M., Mur L., Gomez-Villamandos J.C., Carrasco L. An update on the epidemiology and pathology of African swine fever. J. Comp. Pathol., 2015, 152(1): 9-21 (doi: 10.1016/j.jcpa.2014.09.003).
4. Sánchez-Cordón P.J., Chapman D., Jabbar T., Reis A.L., Goatley L., Netherton C.L., Taylor G., Montoya M., Dixon L. Different routes and doses influence protection in pigs immunised with the naturally attenuated African swine fever virus isolate OURT88/3. Antiviral Res., 2017, 138: 1-8 (doi: 10.1016/j.antiviral.2016.11.021).
5. O'Donnell V., Holinka L.G., Sanford B., Krug P.W., Carlson J., Pacheco J.M., Reese B., Risatti G.R., Gladue D.P., Borca M.V. African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of 9GL and MGF360/505 genes is highly attenuated in swine but does not confer protection against parental virus challenge. Virus Res., 2016, 221: 8-14 (doi: 10.1016/j.virusres.2016.05.014).
6. Blome S., Gabriel C., Beer M. Modern adjuvants do not enhance the efficacy of an inactivated African swine fever virus vaccine preparation. Vaccine, 2014, 32(31): 3879-3882 (doi: 10.1016/j.vaccine.2014.05.051).
7. Lacasta A., Ballester M., Monteagudo P.L., Rodríguez J.M., Salas M.L., Accensi F., Pina-Pedrero S., Bensaid A., Argilaguet J., Lуpez-Soria S., Hutet E., Le Potier M.F., Rodríguez F. Expression library immunization can confer protection against lethal challenge with African swine fever virus. J. Virol., 2014, 88(22): 13322-13332 (doi: 10.1128/JVI.01893-14).
8. Argilaguet J.M., Pérez-Martín E., Nofrarías M., Gallardo C., Accensi F., Lacasta A., Mora M., Ballester M., Galindo-Cardiel I., Lуpez-Soria S., Escribano J.M., Reche P.A., Rodríguez F. DNA vaccination partially protects against African swine fever virus lethal challenge in the absence of antibodies. PLoS ONE, 2012, 7(9): e40942 (doi: 10.1371/journal.pone.0040942).
9. Середа А.Д., Казакова А.С., Иматдинов А.Р., Колбасов Д.В. Гуморальные и клеточно-опосредованные механизмы иммунитета при африканской чуме свиней. Сельскохозяйственная биология, 2015, 50(6): 709-718 (doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.709rus).
10. Lacasta A., Monteagudo P.L., Jiménez-Marín Б., Accensi F., Ballester M., Argilaguet J., Galindo-Cardiel I., Segalés J., Salas M.L., Domínguez J., Moreno Б., Garrido J.J., Rodríguez F. Live attenuated African swine fever viruses as ideal tools to dissect the mechanisms involved in viral pathogenesis and immune protection. Vet. Res., 2015, 46: 135 (doi: 10.1186/s13567-015-0275-z).
11. Takamatsu H.H., Denyer M.S., Lacasta A., Stirling C.M., Argilaguet J.M., Netherton C.L., Oura C.A., Martins C., Rodríguez F. Cellular immunity in ASFV responses. Virus Res., 2013,
173(1): 110-121 (doi: 10.1016/j.virusres.2012.1L009).
12. Kollnberger S.D., Gutierrez-Castaceda B., Foster-Cuevas M., Corteyn A., Parkhouses R.M.E. Identification of the principal serological immunodeterminants of African swine fever virus by screening a virus cDNA library with antibody. J. Gen. Virol., 2002, 83: 1331-1342 (doi: 10.1099/0022-1317-83-6-1331).
13. Barderas M.G., Rodriguez F., Gomez-Puertas P., Aviles M., Beitia F., Alonso C., Escribano J.M. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins. Arch. Virol., 2001, 146: 1681-1691 (doi: 10.1007/s007050170056).
14. Neilan J.G., Zsak L., Lu Z., Burrage T.G., Kutish G.F., Rock D.L. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30, p54, and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection. Virology, 2004, 319: 337-342 (doi: 10.1016/j.virol.2003.11.011).
15. Ruiz-Gonzalvo F., Rodríguez F., Escribano J.M. Functional and immunological properties of the baculovirus-expressed hemagglutinin of African swine fever virus. Virology, 1996, 218: 285289 (doi: 10.1006/viro.1996.0193).
16. Takamatsu H.H., Denyer M.S., Lacasta A., Stirling C.M., Argilaguet J.M., Netherton C.L., Oura C.A., Martins C., Rodríguez F. Cellular immunity in ASFV responses. Virus Res., 2013, 173(1): 110-121 (doi: 10.1016/j.virusres.2012.11.009).
17. Argilaguet J.M., Pérez-Martín E., López S., Goethe M., Escribano J.M., Giesow K., Keil G.M., Rodríguez F. BacMam immunization partially protects pigs against sublethal challenge with African swine fever virus. Antiviral Res., 2013, 98(1): 61-65 (doi: 10.1016/j.antiviral.2013.02.005).
18. Иматдинов А.Р., Середа А.Д., Иматдинов И.Р., Казакова А.С., Дубровская О.А., Колба-сов Д.В. Экспрессия в эукариотических клетках рекомбинантных генов, кодирующих фрагменты протективно значимых белков вируса африканской чумы свиней. Сельскохозяйственная биология, 2016, 51(6): 837-844 (doi: 10.15389/agrobiology.2016.6.837rus).
19. Gómez-Puertas P., Rodriguez F., Oviedo J.M., Brun A., Alonso C., Escribano J.M. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response. Virology, 1998, 243: 461-471 (doi: 10.1006/viro.1998.9068).
20. Rodriguez F., Alcaraz С., Yanez R.J., Rodriguez J.M., Alonso C., Rodriguez J.F., Escribano J.M. Characterization and molecular basis of heterogeneity of the African swine fever virus envelope protein p54. J. Virol., 1994, 68(11): 7244-7252.
21. Goatley L.C., Dixon L.K. Processing and Localization of the African swine fever virus CD2v transmembrane protein. J. Virol., 2011, 85(7): 3294-3305 (doi: 10.1128/jvi.01994-10).
22. Malogolovkin A., Burmakina G., Titov I., Sereda А., Gogin А., Baryshnikova Е., Kolbasov D. Comparative analysis of African swine fever virus genotypes and serogroups. Emerg. Infect. Dis., 2015, 21(2): 312-315 (doi: 10.3201/eid2102.140649).
23. Стрижакова О.М., Лыска В.М., Малоголовкин А.С., Новикова М.Б., Сидлик М.В., Ногина И.В., Шкаев А.Э., Балашова Е.А., Куриннов В.В., Васильев А.П. Валидация ИФА-набора для обнаружения антител к вирусу африканской чумы свиней в крови и селезенке домашних свиней и диких кабанов. Сельскохозяйственная биология, 2016, 51(6): 845-852 (doi: 10.15389/agrobiology.2016.6.845rus).
24. Immunoblotting OIE for serological diagnosis of African swine fever (SOP/CISA/ASF/IB/1/2008). Режим доступа: http://asf-referencelab.info/asf/images/files/S0Ps/S0P-AFSIB12008.pdf. Без даты.
25. Рыжова Е.В., Белянин С.А., Колбасов Д.В., Балышев В.М., Куриннов В.В., Пронин В.В., Корнева Г.В. Патоморфологические изменения у домашних свиней при остром и подостром течении африканской чумы свиней. Российский ветеринарный журнал, 2012, 1: 10-14.
26. Jancovich J.K., Chapman D., Hansen D.T., Robida M.D., Loskutov A., Craciunescu F., Borovkov A., Kibler K., Goatley L., King K., Netherton C,L., Taylor G., Jacobs B., Sykes K., Dixon L.K. Immunization of pigs by DNA prime and recombinant vaccinia virus boost to identify and rank African swine fever virus immunogenic and protective proteins. J. Virol., 2018, 92(8): e02219-17 (doi: 10.1128/JVI.02219-17).
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр Поступила в редакцию
вирусологии и микробиологии, 16 апреля 2018 года
601125 Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н,
пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, стр. 1,
e-mail: almazlcf@yandex.ru, olgadubrovskaya@list.ru,
lady_d.morozova@mail.ru, diagnoz3@yandex.ru, sereda-56@mail.ru Н
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2018, V. 53, № 4, pp. 860-867
THE STUDY OF ANTIGENICITY, IMMUNOGENICITY AND PROTECTIVE POTENTIAL OF DNA CONSTRUCTS CONTAINING FRAGMENTS OF GENES CP204L, E183L OR EP402R OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS STRAIN MK-200
A.R Imatdinov, O.A. Dubrovskaya, D.Yu. Morozova, V.M. Lyska, A.D. Sereda
Federal Research Center for Virology and Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 1, ul. Akademika Bakuleva, pos. Vol'ginskii, Petushinskii Region, Vladimir Province, 601125 Russia, e-mail almazlcf@yandex.ru, olgadu-brovskaya@list.ru, lady_d.morozova@mail.ru, diagnoz3@yandex.ru, sereda-56@mail.ru (H corresponding author) ORCID:
Imatdinov A.R. orcid.org/0000-0003-2889-6112 Lyska V.M. orcid.org/0000-0001-5302-3108
Dubrovskaya O.A. orcid.org/0000-0002-3168-7947 Sereda A.D. orcid.org/0000-0001-8300-5234
Morozova D.Yu. orcid.org/0000-0001-5486-9981 The authors declare no conflict of interests Acknowledgements:
Supported financially by Russian Science Foundation (the research project "Design of African swine fever virus candidate vaccine based on chimeric viruses" No 16-16-00090)
Received April 16, 2018 doi: 10.15389/agrobiology.2018.4.860eng
Abstract
African swine fever (ASF) is a viral, contagious and septic disease affecting wild and domestic pigs of all breeds and age groups. In both domestic pigs and wild European boars affected, some hyperacute or acute forms of the infection are observed which are characterized by fever, signs of toxicosis, hemorrhagic diathesis with mortality rates of up to 100 %. In endemic regions (e.g., some countries of East Africa), a subacute form of the disease with a mortality of 30 to 70 %, as well as a chronic one with very low mortality levels are reported (S. Blome et al., 2013; C. Gabriel et al., 2011; JM Sánchez -Vizcaíno et al., 2015). No vaccine against African swine fever is currently available, and the research works aimed at the development of live, inactivated and subunit vaccines have not achieved the intended result yet (P.J. Sánchez-Cordón et al., 2017; V. O'Donnell et al., 2016; S. Blome et al., 2014). Nevertheless, the opportunity of obtaining a DNA vaccine using the genes of potentially protective ASFV proteins p30, p54 and/or CD2v is considered to be a promising option in a number of laboratories worldwide. The proteins p30 and p54 are functionally important in attaching the ASF virus to the target cell. The antibody to p54 blocks the virion binding to the macrophage, whereas the antibody to p30 inhibits the virion penetration into the cell. The protein CD2v determines the hemadsorbing properties of the virus (S.D. Kollnberger et al., 2002; M.G. Barderas et al., 2001; J.G. Neilan et al., 2004). This work has been performed to study effects of the translation products of recombinant plasmids pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 and pCI-neo/ASFV/CD2v induced in adhesive cells (A-cells) after transfection. The antigenic activity of the recombinant proteins produced with these DNA constructs was compared in permanent cell line HEK-293T and swine leukocyte (SL) autologous primary cultures using a direct fluorescence technique. The highest expression of the antigen-active translation products in HEK-293T and SL cells transfected with pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 or pCI-neo/ASFV/CD2v was observed on day 2. The peculiarity of the pig immunization schedule applied was that the animals were thrice immunized at a 14-day interval with autologous LS A cells transfected in vitro with the above recombinant plasmids. For this, as much as 90 cm3 of LC cell culture was produced using blood samples from each of the animals No.No. 1-4. On day 2 of the culturing, 90 ^g of pCI-neo/ASFV/p30 (No. 1), pCI-neo/ASFV/p54 (No. 2) or pCI-neo/ASFV/CD2v (No. 3) was added thereto. The LS culture obtained from the pig No. 4 in a volume of 90 cm3 was divided into three portions of 30 cm3, and each one was transfected with one of the three constructs (i.e., pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 or pCI-neo/ASFV/CD2v) by adding 30 ^g of the plasmid DNA. Two days later, the pigs No. 1 to No. 4 were inoculated into the central auricular vein with about 107 autologous transfected A-cells of LS cultures. On days 14, 28 and 42, no antibody against ASFV proteins was detected in the blood of the immunized pigs using indirect solid-phase ELISA and immunoblotting. After the pigs were infected into the neck with 102 HAU50 of an ASFV strain Mozambique-78 on day 42, the four pre-immunized pigs (No.No. 1-4) died on day 6 to 8 and the control one died (No. 5) on day 13. Thus, the immunization of pigs with the autologous and antigenically active LS cells transfected with the recombinant plasmids pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 or pCI-neo/ASFV/CD2v failed to provide antibody response or protection against the challenge.
Keywords: African swine fever, ASFV, recombinant plasmids, ASFV proteins р30, р54 and CD2v, antigenicity, immunogenicity.
Научные собрания 5th WORLD CONGRESS AND EXPO ON APPLIED MICROBIOLOGY (November 12-13, 2018, Edinburgh, Scotland)
Information: https://microbiology.conferenceseries.com/
INTERNATIONAL CONFERENCE ON MICROBIAL GENETICS & MOLECULAR
MICROBIOLOGY (December 3-4, 2018, Chicago, Illinois, USA)
Information: https://microbiology.conferenceseries.com/
