CC BY
47
УДК: 557.152.321: 635.24
Т. И. Шатилова, О. С. Соколова, С. Л. Белопухов,
В. Т. Семко, И. С. Витол, Г. П. Карпиленко, И. Г. Шайхиев
ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ ИЗ ТАПИНАМБУРА
НА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ. 2. ИНУЛАЗА
Ключевые слова: топинамбур, инулаза, гидролиз инулина, гель-хроматография.
Из клубней топинамбура (Helianthus tuberous), выделен фермент - инулаза, гидролизующий запасной полисахарид - инулин. Разработана схема частичной очистки фермента, включающая фракционное осаждение сульфатом аммония и 96% этанолом, гель-хроматографию на сефадексе G-75. Показано наличие двух форм фермента с молекулярной массой 65000 и 45000 Да. Дана сравнительная характеристика активности инула-зы на разных стадиях выделения и очистки. Изучены оптимальные условия действия очищенной инулазы и влияние на ее активность СаС12, NaCl и ЭДТА.
Keywords: Jerusalem artichoke, inulase, hydrolysis of inulin, gel-chromatography.
From tubers of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberous) isolated an enzyme - inulase, which hydrolyzes reserve polysaccharide is inulin. A scheme for partial purification of the enzyme, including fractional precipitation with ammonium sulfate and 96% ethanol, gel-chromatography on Sephadex G-75It was developed. Is shown the presence of two forms of the enzyme with a molecular weight 65000 and 45000 Da. The comparative characteristic inulase activity at different stages of separation and purification. Is studied the optimal conditions for action inulase purified and the effect on its activity CaCl2, NaCl and EDTA.
Введение
Клубни топинамбура, как показывают многочисленные исследования, являются источником полиф-руктозанов, и в первую очередь, инулина, который относится к группе растворимых пищевых волокон, и может использоваться как пребиотик в составе различных функциональных продуктов питания, но также содержат комплекс ферментов, участвующих в преобразовании инулина. Было установлено, что в данном процессе участвуют ферменты класса гид-ролаз и трансфераз: инулаза; гидролазы А и В, ин-вертаза, инулосахараза, левансахараза [1, 2].
Инулаза (инулин-1-фруктаногидролаза,
ЕС.3.2.1.7, гидролизует ß-1,2 фруктановые связи в инулине) и является основным ферментом, деполи-меризующим инулин с образованием преимущественно фруктозы (95 %) и небольшого количества глюкозы (5 %) [3].
В настоящее время наиболее полно изучена ину-лаза из дрожжей Kluyveromyces fragilis и Candida Sp., а также инулаза, продуцируемая микроскопическими грибами рода Aspergillus, Penicillium и Fusarium Sp.
Впервые инулаза была открыта еще в 1887 году при исследовании прорастающих клубней топинамбура [1]. Однако, работ, посвященных изучению инулаз растительного происхождения на сегодняшний день крайне мало.
Цель исследования заключается в выделении и частичной очистке инулазы из сока клубней топинамбура и определении характеристик частично очищенного препарата инулазы с помощью гель-хроматографии. Также изучались оптимальные условия действия очищенной инулазы и влияние на ее активность некоторых активаторов и ингибиторов.
Методы исследований
Объектом исследования служили клубни топинамбура, выращенные в Московской области, урожая 2012 - 2014 года, время сбора урожая - осень, весна.
Субстратом для действия инулазы служил ину-линсодержащий препарат, полученный по разработанной нами методике, включающей следующую последовательность операций: целые клубни топинамбура варили в кипящей воде в течение 1 часа, затем очищали от кожуры, разминали и высушивали. Водорастворимую фракцию инулина получали путем двухкратной экстрации водой в соотношении 1:1,5 при интенсивном перемешивании в течение 10 мин. Содержание инулина в полученных экстрактах составило 75-85 % [4].
Растительную инулазу получали путем отжима сока клубней топинамбура с дальнейшей частичной очисткой. Активность инулазы определяли по начальной скорости реакции при оптимальных условиях, которые были подобраны экспериментально. Удельную активность рассчитывали как единицу ферментативной активности, отнесенной к 1 мг белка. За единицу активности принимали количество мкмолей образовавшейся фруктозы в 1 мин [5].
Содержание восстанавливающих сахаров определяли по методу Шомади-Нельсона. Растворимый белок - по методу Лоури. Гель-хроматографию осуществляли на колонке с сефадексом в-75 (параметры колонки: Усв = 50 см3; Уобщ = 160 см3). Элюцию проводили фосфатно-цитратным буфером с рН = 5,0; объем собираемых фракций - 5 см3. Для определения молекулярной массы инулазы графическим методом колонку маркировали стандартными метчиками с известной молекулярной массой [6].
Обсуждение результатов
Ранее нами было установлено, что химический состав клубней топинамбура разных сроков сбора (осень, весна) неодинаков, поэтому был проведен анализ инулазной активности препаратов, полученных по приведенной ниже схеме из клубней топинамбура разных сроков сбора урожая. Разработанная схема выделения и очистки инулазы из клубней топинамбура представлена на рисунке 1. Она включает следующие этапы: получение сока из клубней топинамбура; осаждение сульфатом аммония (от 40 до 80 % от полного насыщения) и 96 %-ным этанолом; фракционирование с помощью гель-хроматографии на колонке с сефадексом в-75 (свободный объем - 50 см3; общий объем - 150 см3).
Рис. 1 - Схема выделения и частичной очистки инулазы из топинамбура
Показано, что инулазная активность солеосаж-денного препарата из сока клубней топинамбура, собранных весной, практически в 2 раза выше, чем препарата из клубней, собранных осенью (0,157 ед./мг белка и 0,078 ед./мг белка соответственно). Аналогичные данные были получены и для спирто-осажденного препарата инулазы (0,202 ед./мг белка и 0,097 ед./мг белка, соответственно).
Метод гель-хроматографии, как это было показано нами на других объектах [8-11], был использован для дальнейшей очистки соле- и спиртоосаж-денного препарата инулазы, полученной из клубней топинамбура весеннего сбора урожая. Профили элюции и инулазная активность представлены на рисунках 2 и 3.
С помощью гель-хроматографии на сефадексе в-75 выявлены две формы инулазы с различной молекулярной массой (65000 и 45000 Да), причем, обнаруженные формы присутствуют как в соле-, так и спиртоосажденных препаратах инулазы. Степень очистки составляет 20 и 29 раз, соответственно (табл. 1) для варианта I. Очистка инулазы по варианту II позволила получить препараты инулазы очищенные в 60 и 98 раз (табл. 2).
а) профиль элюции
Номера фракций
а
б)активность инулазы
0,1
^ 0,09---
5 0,08---
i 0,07---
| 0,06---
1 I 0,05--Г -
Í " 0,04--—Г-
0 .........I I I I I I...................
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Номера фракций
б
Рис. 2 - Гель-хроматографии солеосажденного препарата инулазы на колонке с сефадексом G-75: а - профиль элюции; б - активность инулазы
Таблица 1 - Очистка инулазы из топинамбура (вариант I)
Этап Содер жание белка, мг/мл Активность инулазы, ед. Удельная активность, ед/мг белка Степень очистки
Получение сока 0,640 0,050 0,078 1, 00
Осаждение сульфатом аммония (от 40 до 80% насыщения) 0,280 0,044 0,157 2, 01
Гель- хроматография на сефадексе в-75 I пик II пик 0,058 0,020 0,093 0,045 1,60 2,25 20,50 28,85
Полученные, по приведенной выше схеме, частично очищенные препараты инулазы были охарактеризованы по основным кинетическим параметрам и влиянию на инулазную активность некоторых активаторов и ингибиторов (табл. 3).
Проведенные исследования не выявили существенных различий в оптимумах температуры и рН, влиянии ионов кальция и хлорида натрия при очистке фермента. Две формы как соле-, так и спирто-осажденных инулаз отличаются лишь по молекулярной массе.
а) профиль элюции
0,09 0,08 0,07
с 0,06
s
| 0,05
£ 0,04 сц
Ш 0,03 0,02 0,01
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Номера фракций
а
Таблица 3 - Характеристика инулазы клубней топинамбура
б
Рис. 3 - Гель-хроматографии спиртоосажденного препарата инулазы на колонке с сефадексом в-75: а - профиль элюции; б - активность инулазы
Неоднозначное влияние ЭДТА на инулазу топинамбура может быть связано с тем, что в концентрациях до 0,5% ЭДТА связывает ионы железа, которые обнаружены в повышенном количестве в клубнях топинамбура и оказывают ингибирующее действие на инулазу [7]. При более высоких концентрациях ЭДТА, вероятно, связывает и другие элементы, необходимые для проявления инулазной активности. Очищенные препараты, после гель-хроматографии, ингибируются при всех исследуемых концентрациях ЭДТА.
Таблица 2 - Очистка инулазы из топинамбура (вариант II)
Содер Актив- Удельная Степень
Этап жание ность активность. очист-
белка, мг/мл инулазы, ед. ед/мг белка ки
Получение сока 0,637 0,045 0,071 1,00
Осаждение 96% 0,440 0,089 0,202 2,85
этанолом
Гель-
хроматография на сефадексе О-75
I пик 0,028 0,120 4,28 60,28
II пик 0,020 0,140 7,00 98,59
Инулаза Инулаза, Инулаза,
Показатель неочи- очищенная очищенная
щенная в 20 раз / 29 раз (вариант I) в 60 раз / 98 раз (вариант II)
Оптимум рН 5,0 5,0 / 5,0 5,0 / 5,0
Оптимум тем- 50 55/ 55 55 /55
пературы, °С
Влияние СаС12 от 0,1 до 0,5% активирует активирует активирует
Влияние ЫаС1 не влияет не влияет не влияет
от 0,01 до 0,1%
Влияние ЭДТА активирует ингибиру- ингибиру-
от 0,1 до 0,5 % ет ет
Влияние ЭДТА ингибиру- ингибиру- ингибиру-
от 0,55 до 1,0% ет ет ет
Молекулярная не опреде- 65000 / 65000/
масса, дальтон лялась 45000 45000
Выводы
1. Разработана схема выделения и частичной очистки из клубней топинамбура фермента - ину-лаза, гидролизующего запасной полисахарид -инулин.
2. Схема частичной очистки фермента включает: фракционное осаждение сульфатом аммония и 96% этанолом, гель-хроматографию на сефадек-се G-75. Дана сравнительная характеристика активности инулазы на разных стадиях выделения и очистки.
3. Показано наличие двух форм фермента с молекулярной массой 65000 45000 Дальтон.
4. Установлено, что ионы кальция активируют инулазу, хлорид натрия не влияет на активность фермента, ЭДТА ингибирует частично очищенный фермент.
Литература
1. Б.М. Кохана, Б.В. Арасимович, Биохимия топинамбура, Кишинев, 1974. 88 с.
2. Д.В. Чечеткин, Л.Н. Крикунова, Г.П. Карпиленко, Хранение и переработка сельхозсырья, 4, 39-43 (2006).
3. А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, А.А. Кочеткова, В.В. Колпакова, И.С. Витол, И.Б. Кобелева, Пищевая химия, ГИОРД, СПб., 2015. 672 с.
4. О.С. Соколова, Г.П. Карпиленко, Е.В. Ли, Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы развития технологии производства продуктов питания», Воронеж: Истоки, 2008. 228 с.
5. Г.В. Полыгалина, В.С. Чередниченко, Л.В. Римарева, Определение активности ферментов, ДеЛи принт, Москва, 2003. 375 с.
6. А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, А.А. Кочеткова, В.В. Колпакова, И.С. Витол, И.Б. Кобелева, Пищевая химия. Лабораторный практикум, ГИОРД, СПб., 2006. 304 с.
7. В.Н. Голубев, Н.В. Волкова, Х.М. Кушалаков, Топинамбур - состав, свойства, способы переработки, области применения, Москва, 1995. 82 с.
8. Л.Д. Прусакова, В.И. Кефели, С.Л. Белопухов, В.В. Вакуленко, С.А. Кузнецова, Агрохимия, 7, 86-97 (2008).
9. Т.И. Шатилова, И.С. Витол, Г.П. Карпиленко, С.Л. Белопухов, В.Т. Семко, Бутлеровские сообщения, 20, 6, 70-73 (2010).
10. Т.И. Шатилова, С.Л. Белопухов, Е.В. Романова, И.С. Витол, Г.П. Карпиленко, Известия ТСХА, 3, 31-38 (2013).
11. А.А. Балакина, А.А. Терентьев, Е.А. Калашникова, С.Л. Белопухов, Бутлеровские сообщения, 29, 1, 5561 (2012).
© Т. И. Шатилова - к.б.н., доцент кафедры агрономической и биологической химии РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева, тел. 8 (499) 9761280, E-mail: info@rosflaxhemp.ru; О. С. Соколова - н.с. кафедры биотехнологии и технологии продуктов биоорганического синтеза Московского государственного университета пищевых производств; С. Л. Белопухов - д.с-х.н., профессор, зав. кафедрой физической и органической химии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева, belopuhov@mail.ru; В. Т. Семко - к.т.н., доцент каф. физической и органической химии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева; И. С. Витол -к.б.н., доцент, старший научный сотрудник кафедры биотехнологии и технологии продуктов биоорганического синтеза Московского государственного университета пищевых производств; Г. П. Карпиленко - д.т.н, профессор, ведущий научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института зерна и продуктов его переработки; И. Г. Шайхиев - д.т.н., заведующий кафедрой Инженерной экологии Казанского национального исследовательского технологического университета.
© T. I. Shatilova - PhD, associate professor of the Department of Economic and biological chemistry RGAU - ICCA them. KA Timiryazeva bodies, tel.: 8 (499) 9761280, E-mail: info@rosflaxhemp.ru; O. S. Sokolova - ns Department of Biotechnology and Technology of bioorganic synthesis of the Moscow State University of Food Production; S. L. Belopukhov - DS-agricultural sciences., Professor, Head of Department of Physical and Organic Chemistry RGAU - MSHA named after KA Timiryazev, belopuhov@mail.ru; V. T. Semko - Ph.D., Associate Professor, Department of Physical and Organic Chemistry RGAU - MSHA named after KA Timiryazeva; I.S. Vitol - PhD, associate professor, senior researcher at the Department of Biotechnology and Technology of bioorganic synthesis of the Moscow State University of Food Production; G. P. Karpilenko - Doctor of Technical Sciences, professor, leading researcher of the All-Russian Research Institute of grain and its products; I. G. Shaikhiev - PhD, Head of Department of Environmental Engineering Kazan National Research Technological University.
