CC BY
17Ежеквартальный
научно-практический
журнал
УДК 632.32.38:611.65.67
КРИВОРУЧКО А. Ю., ОСИПОВА Ю. С., МЕТЛЯЕВА А. В., БЕЛУГИН Н. В. KRIVORUCHKO A. Y., OSIPOVA Y. S., METLYAEVA A. V., BELUGIN N. V.
ПОЛУЧЕНИЕ ООЦИТ-КУМУЛЮСНЫХ КОМПЛЕКСОВ У ОВЕЦ МЕТОДОМ ЛАПАРОСКОПИИ
RECEIVING OOCYTE-CUMULUS COMPLEXES AT SHEEP THE LAPAROSCOPY METHOD
Описывается получение ооцит-кумулюсных комплексов (ООК) для продукции эмбрионов in vitro у овец методом лапароскопии с визуализацией при помощи веб-камеры, что позволило нам значительно удешевить выполняемую процедуру лапароскопии, и использованием самостоятельно изготовленного инструмента для пункций фолликулов, состоящего из иглы для лапароскопического наложения холе-цистостомы. Описывается оптимальный доступ к яичникам, а также приводятся данные по количеству и качественным характеристикам полученных ООК.
Ключевые слова: ооцит-кумулюсные комплексы, лапароскопия, лапароскоп, лапароскопический доступ.
Describes the preparation of the oocyte-cumulus complexes (COS) for the production of embryos in vitro in sheep by laparos-copy with visualization using a webcam and use self-made tool to puncture the follicles. Describes the optimum access to the ovaries, and provides data on the number and quality characteristics obtained OOC.
Keywords: oocyte-cumulus laparoscope, laparoscopic access.
complexes, laparoscopy,
Криворучко Александр Юрьевич -
доктор биологических наук, профессор, руководитель Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра Ставропольского государственного аграрного университета Тел.: 8-918-881-43-27 E-mail: rcvm@yandex.ru
Осипова Юлия Сергеевна -
аспирант кафедры акушерства, физиологии и хирургии факультета ветеринарной медицины Ставропольского государственного аграрного университета Тел.: 8-988-113-70-92 E-mail: yuliya.osipova.1990@inbox.ru
Метляева Анастасия Владимировна -
студентка 5-го курса
факультета ветеринарной медицины
Ставропольского государственного
аграрного университета
Тел.: 8-918-887-65-63
E-mail: metlyaeva90@mail.ru
Белугин Николай Васильевич -
кандидат ветеринарных наук. доцент кафедры акушерства, физиологии и хирургии факультета ветеринарной медицины Ставропольского государственного аграрного университета Тел.: 93-83-47
Krivoruchko Alexander Yurevich -
Doctor of biological sciences,
Professor, Head of the Science-Diagnostic
and Treatment Veterinary center
of Stavropol State
Agrarian University,
Tel.: 8-918-881-43-27
E-mail: rcvm@yandex.ru
Osipova Yuliya Sergeevna -
Ph.D. student of Department
of obstetrics, physiology and surgery, faculty
of veterinary medicine
Stavropol State Agrarian University.
Tel.: 8-988-113-70-92
E-mail: yuliya.osipova.1990@inbox.ru
Metlyaeva Anastasia Vladimirovna -
student of the 5th year the faculty of veterinary medicine Stavropol State Agrarian University. Tel.: 8-918-887-65-63 E-mail: metlyaeva90@mail.ru
Belugin Nikolai Vasilevich -
Ph.D. in veterinary sciences.
Docent of Department of obstetrics,
physiology and surgery, faculty
of veterinary medicine
of the Stavropol State Agrarian University
Tel. 93-83-47
Интенсивно развивающиеся вспомогательные репродуктивные технологии в животноводстве, такие как продукция эмбрионов в искусственных условиях и их трансплантация, требуют использования новых методов, обеспечивающих извлечение большого количества яйцеклеток в составе ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК).
Одним из наиболее распространенных источников ОКК у овец являются яичники, забираемые у животного во время убоя. Недостатком этого метода является негативное влияние на
ооциты посмертных изменений в яичнике, которые прямо пропорциональны времени, прошедшему от убоя до пункции фолликулов и могут привести к снижению количества и качества получаемых эмбрионов. К тому же, этот метод позволяет получить ОКК у овцы лишь однократно, сокращая потенциальное число получаемых эмбрионов (Natarajan R. et al., 2010, p. 484).
Другим методом, лишенным указанных недостатков, но более сложным в выполнении, является пункция фолликулов яичников во время лапаротомии. Современным методом опера-
в
:№ 2(10), 2013!
Ветеринария
213
тивных вмешательств на брюшной полости является лапароскопия, при этом травма,наносимая животному, будет минимальной. В мировой практике продукции эмбрионов in vitro лапароскопия применяется для взятия ОКК уже более 15 лет (Baldassare H. et al., 1994, p. 146)). Но широкого распространения этот метод пока не получил в связи с высокой стоимостью лапароскопического оборудования и необходимостью серьезной подготовки специалистов. С точки зрения лапароскопического доступа также существуют разногласия относительно топографии введения лапароскопических инструментов, что требует дальнейших исследований и оптимизации техники операции.
Целью нашей работы стало создание бюджетного варианта набора лапароскопического оборудования, приспособленного к выполнению пункций фолликулов, оптимизация доступа в брюшную полость и оценка качества полученных ОКК.
Материалы и методы. Исследования проводились на базе лаборатории вспомогательных репродуктивных технологий Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет в период с мая по ноябрь 2012 года.
Объектом исследования служили овцы северо-кавказской породы в возрасте 2-3 лет в количестве 10 голов. Лапароскопические операции выполняли каждому животному дважды с интервалом в 1 неделю. Всего было выполнено 20 операций. Перед операцией животных в течение суток держали на голодной диете. Лапароскопические операции проводились под внутривенным наркозом 5 % раствором тиопентала натрия в дозировке 15 мг/кг веса. Для выполнения лапароскопии использовалось оборудование производства компании ООО «НТК Азимут плюс», г. Санкт-Петербург. Для удержания яичников использовали когтевой зажим с кремальерой, предварительно спилив зубцы для уменьшения травматизации органа.
ОКК собирали в питательную среду ТСМ 199 (ООО «ПанЭко», Москва) с добавлением 10 % сыворотки плода коровы (ООО «ПанЭко», Москва) и 10 мкл/мл раствора антибиотиков пенициллина и стрептомицина (ООО «ПанЭко», Москва). Поиск и оценку ОКК выполняли на сте-реомикроскопе SZX-10 («Olympus», Япония) с термостоликом Thermo Plate (Tokai Hit, Япония) при температуре 38,5 °С. Полученные ОКК оценивали по общепринятой системе. Описательная статистика выполнялась в программе «Primer of Biostatistic 3.01» для Windows на IBM-совместимом компьютере.
Результаты исследований. В нашем эксперименте для удешевления процедуры лапароскопического извлечения ООК был собран комплект оборудования, включающий в себя оптическую систему лапароскопа, све-товодный кабель, галогеновый осветитель, инсуффлятор, к которому были добавлены
компоненты для визуализации и записи изображения - ноутбук, монитор 22', веб-камера Microsoft LifeCam Studio.
Для присоединения камеры к оптической системе у нее был аккуратно вывинчен собственный объектив и в подходящий по размеру адаптер установлена камера и собирающая линза +2 диоптрии. Расстояние между линзой и окуляром лапароскопа, а также между линзой и матрицей камеры подобрано опытным путем так, чтобы наиболее резкими визуализировались предметы на расстоянии 3-4 см от объектива лапароскопа. Оптическая система с присоединенной камерой приведена на рис. 1.
Рисунок 1 - Оптическая система лапароскопа с присоединенным световодным кабелем и веб-камерой
Инструмент для пункции фолликулов был изготовлен нами самостоятельно. В качестве основы была взята игла для лапароскопического наложения холецистостомы. Заточенный участок был отпилен, внутрь иглы введена полихлорвиниловая трубка от капельницы. Непосредственно для пункции в инструмент встраивается игла размером 230, имеющая внутренний диаметр 0,63 мм. Канюля иглы обрезается ножом до размера, позволяющего вставить ее в полихлорвиниловую трубку. Далее эпоксидным клеем игла фиксируется на конце металлической трубки.
В процессе пункции фолликулов необходимо создавать постоянное разряжение в системе для аспирации фолликулярной жидкости, для чего использовался вакуум-отсос. Кроме этого надо предусмотреть емкость, куда будут попадать ОКК и в которой будет находиться питательная среда. Такой вариант ловушки для ОКК легко изготовить из пары игл, системы для внутривенных вливаний и пластиковой пробирки на 15 мл. Общий вид инструмента для пункций фолликулов и ловушки для ОКК представлен на рис. 2.
Для выполнения лапароскопии мы использовали введение оптической части через прокол в области белой линии живота на 15 см краниаль-нее вымени. Инструменты для пункции фолликулов и удержания яичника вводили на 10 см ла-
Ежеквартальный
научно-практический
журнал
ест н и к АПК
Ставрополья
теральнее белой линии и на 6-8 см каудальнее места введения оптической системы. Места ввода инструментов отмечены на рис. 3. В один из лапароскопических портов вводился когте-вой зажим с кремальерой, которым освобождался из под яйцевода и за собственную связку фиксировался яичник. Во второй порт вводился инструмент для пункции фолликулов.
Рисунок 2 -Система для аспирации фолликулярной жидкости в сборе
Рисунок 3 - Операционное поле с введенными инструментами в момент поиска и фиксации яичника
Процедура пункции фолликула изображена на рис. 4. После включения вакуум-отсоса иглой производился прокол фолликула, фолликулярная жидкость аспирировалась, игла аккуратно поворачивалась внутри фолликула для полной эвакуации содержимого. После окончания пункции фолликулов на одной стороне инструменты менялись местами и процедура повторялась.
В результате проведенных пункций 211 фолликулов нами было получено 102 ОКК. В среднем было пунктировано 10,5±0,1 фолликулов и получено 5,1±0,07 ОКК на одну овцематку. Из них 57 (55,9 %) ОКК соответствовали I-II классу, 28 (27,5 %) - III классу и 17 (16,6 %) -IV классу.
Рисунок 4 - Процедура пункции фолликула
Обсуждение. Собранная нами система для лапароскопической пункции фолликулов и получения ОКК существенно отличается от предлагаемых различными компаниями наборов для проведения лапароскопических манипуляций. Понятно, что для оперативных вмешательств на органах брюшной полости необходимо комплектовать лапароскопическую стойку более серьезным по качеству оборудованием. Но для кратковременных вмешательств вполне можно обойтись и продукцией отечественных производителей.
В нашей модификации комплекс для получения изображения органов брюшной полости обошелся по стоимости в 3 500 рублей за веб-камеру против более 120 000 рублей за серийный компонент, что в 30 раз дешевле и доступнее для лабораторий по выполнению технологий получения эмбрионов.
Собранный нами инструмент для пункции фолликулов также показал свою высокую эффективность в процессе получения ОКК. Он удобен в работе, легко стерилизуется и промывается. При этом мы использовали иглу размером 23Э, в то время, как КиИИо^ег В. с соавторами (1997, р. 546) рекомендуют иглу 0,9 мм и длиной 75 мм. Более тонкая в нашем случае игла лучше подходит для пункции фолликулов, она не так сильно травмирует ткань яичника и не позволяет фолликулярной жидкости вытекать на поверхность органа.
Выбранный нами доступ в брюшную полость обеспечивает более удобную работу с инструментами и уменьшает количество необходимых манипуляций по извлечению и введению оборудования. В работе КиИИо^ег В. с соавторами (1997, р. 546) указано место введения лапароскопической оптики по средней линии на 1015 см краниальнее вымени, а для введения щипцов - на 10-20 см латеральнее. Сосего М^ с соавторами (2011, р. 465) все инструменты вводили краниальнее вымени на 10 см, располагая в непосредственной близости друг от друга.
Расположение портов в наших исследованиях показало, что при таком варианте нет необходимости перемещать оптическую систему - из прокола по средней линии легко осмотреть оба яич-
I
ц
в
:№ 2(10), 2013!
Ветеринария
215
ника. Латерально расположенные на некотором удалении каудально от оптической системы два порта, используемые попеременно для щипцов и пункционного инструмента, также очень удобны для организации доступа к яичникам. Поэтому, используемый нами доступ мы рекомендуем как наиболее оптимальный для выполнения операции пункции фолликулов в яичниках.
Результаты получения ОКК разными авторами достаточно сильно различаются по количеству и качеству извлеченных комплексов. Так, по данным Ptak в. с соавторами (1999, р. 1109) после пункции 275 фолликулов было получено 219 ОКК. Вторичная серия пункций 247 фолликулов завершилась получением 196 ОКК. В среднем при первой пункции было получено 12,2 ОКК на одну овцу, при повторной - 10,9 ОКК. Манипуляции проводились после стимуляции овуляции. Для доступа они использовали лапаротомию.
В результате пяти повторных пункций у овец в анэстральный период КиИИо^ег В. с соавторами (1997, р. 547) провели аспирацию из 567 фолликулов и получили 385 ооцитов. От одной овцы было получено в среднем 4,6 ооцитов. ОКК I и II классов при первой пункции составляли 60 %, к последней пункции их количество снижалось до 40 %. Сосего М^ с соавторами (2011, р. 466) пунктировали у одной овцы после стимуляции овуляции в среднем 29,6 фолликулов, у не стимулированной - 12,5 фолликулов.
Wieczorek J. с соавторами (2010) во время пункции 205 фолликулов получили 137 ОКК.
В наших исследованиях количество полученных ОКК относительно количества пунктированных фолликулов было несколько меньше, чем в приведенных выше работах. При этом качество полученных ОКК было почти таким же, как у других авторов. Более низкое количество полученных ОКК мы связываем с особенностями овец северо-кавказской породы, которые использовались в эксперименте, а также с тем, что опыты были проведены в анэстральный период.
Результаты проведенных исследований показывают, что вполне возможно собрать достаточно дешевый лапароскопический комплекс для выполнения пункции фолликулов у овец. Также мы предлагаем конструкцию инструмента для пункции фолликулов на основе иглы для наложения холецистостомы лапароскопическим способом, который облегчает выполнение манипуляции. Предложенный нами доступ позволяет выполнить операцию проще и быстрее, так как в процессе меняются местами всего два инструмента. Лапароскопический метод получения ОКК у овец является малотравматичным и эффективным методом, позволяющим получать яйцеклетки хорошего качества и в достаточных количествах для использования в современных вспомогательных репродуктивных технологиях.
References
1. Baldassare H., de Matos D. G., Furnus C. C. et al. Technique for efficient recovery of sheep oocytes by laparoscopic folliculocen-tesis // Animal Reproduction Science. 1994. № 35. P. 145-150.
2. Coccero M. J., Alabart J. L., Hammami S. et al. The efficiency of in vitro ovine embryo production using an undefined or a defined maturation medium is determined by the source of the oocyte // Reprod Dom Anim. 2011. № 46. P. 463-470.
3. Kuhholzer B., Muller S., Treuer A. et al. Repeated endoscopic ovum pick-up in hormon-ally untreated ewes: a new technique // The-riogenology. 1997. № 48. P. 545-550.
4. Morton K. M., Maxwell W. M. S., Evans G. Effect of aspiration pressure during oocyte harvesting on oocyte recovery and in vitro development of ovine oocytes // Reprod Dom Anim. 2008. № 43. P. 106-110.
5. Natarajan R., Bhawani Shankar M., Munus-wamy D. Effect of a-tocopherol supplementation on in vitro maturation of sheep oocytes and in vitro development of preimplantation sheep embryos to the blastocyst stage // J Assist Reprod Genet. 2010. № 27. P. 483-490.
6. Ptack G., Dattena M., Loi P., Tisehner M., Cappai P. Ovum pick-up in sheep: efficiency of in vitro embryo production, vitrification and birth of offspring // Theriogenology. 1999. № 52. P. 1105-1114.
