CC BY
114
УДК 616.988.21
Е.Г.Абрамова1, Н.Н.Кочкалова1, А.К.Никифоров1, А.Ю.Бутырский2, Ю.В.Иванов1, Н.В.Синицына1,Т.А.Михеева1, Л.Н.Минаева1, М.В.Галкина1, Л.В.Савицкая1, С.В.Генералов1,
М.Н.Киреев1, Н.А.Шарапова1
ПОЛУЧЕНИЕ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ОСНОВНЫХ СВОЙСТВ
ФГУЗ « Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
2Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича, Москва
Представлены данные по изучению физико-химических и биологических характеристик лиофилизированной формы гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Проведен сравнительный анализ свойств сухой и исходной жидкой формы иммуноглобулина. Установлено, что лиофилизат сохраняет основные свойства в процессе длительного хранения.
Ключевые слова: гетерологичный антирабический иммуноглобулин, лиофилизация, специфическая активность, стабильность.
E.G.Abramova, N.N.Kochkalova, A.K.Nikiforov, A.Yu.Butyrskii, Yu.V.Ivanov, N.V.Sinitsyna, T.A.Mikheeva, L.N.Minaeva, M.V.Galkina, L.V.Savitskaya, S.V.Generalov, M.N.Kireev, N.A.Sharapova
Production of Lyophilized Preparation of Anti-Rabies Immunoglobulin and Examination of Its Main Properties
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”, Saratov; L.A.Tarasevich State Institute for Standardization and Control, Moscow
Presented are data on examination of physical, chemical and biological characteristics of lyophilized preparation of geterologous anti-rabies immunoglobulin. Dry and original liquid forms of immunoglobulin were comparatively analyzed. The lyophilized form was shown to preserve main properties during long-term storage.
Key words: geterologous anti-rabies immunoglobulin, lyophilization, specific activity, stability.
Современное многообразие лекарственных средств, их высокая эффективность в лечении и профилактике многих инфекционных заболеваний обусловливает большое внимание исследователей к проблеме обеспечения стабильности медицинских иммунобиологических препаратов в процессе хранения. Одним из способов решения этого вопроса является лиофилизация готового препарата.
В настоящее время РосНИПЧИ «Микроб» выпускает препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина (АИГ) в жидкой форме. Известно, что жидкая форма иммуноглобулиновых препаратов, применяемых в лечебных целях, наиболее экономична и удобна для использования потребителем. Однако жидкие формы лечебных иммуноглобулинов обладают рядом существенных недостатков: меньшей стабильностью во время длительного хранения, возможным снижением титров специфических антител, опасностью образования агрегатов, более жесткими требованиями к транспортировке [7]. Российская Федерация, в отличие от стран Европы, характеризуется значительной протяженностью транспортных путей до потребителя, и лиофилизация, помимо обеспечения стабильности молекулярных параметров и специфической активности, позволит создать наибо-
лее оптимальные условия для предотвращения агрегации и фрагментации белков в процессе хранения, мало зависящие от способов транспортировки.
В последние годы в мировой практике наблюдается тенденция в сторону увеличения выпуска лио-фильно высушенных иммуноглобулиновых препаратов, применяемых для лечебных целей. Так, в США ведущим контрольным медицинским органом -Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) сертифицировано шесть лиофилизированных внутривенных препаратов против двух в жидкой форме. Трехкратное превышение зарегистрированных лиофилизированных форм над жидкими объясняется очень жесткими международными требованиями, предъявляемыми к стабильности иммуноглобулиновых препаратов.
Согласно Европейской Фармакопее (2004 г.), для лечебных лиофилизированных иммуноглобулинов, в отличие от жидких препаратов, допускается хранение при более высокой температуре - до 25 °С. Кроме того, при хранении лиофилизированного препарата отсутствуют поверхности взаимодействия: воздух-жидкость, твердое тело (стекло) - жидкость, характерные для жидкого МИБП. Высокий негативный
заряд стекла может вызвать усиленную агрегацию иммуноглобулиновых препаратов, которую также можно предупредить лиофилизацией. В иммуноглобулинах, приготовленных путем фракционирования иммунных сывороток спиртом, всегда содержится некоторое количество сывороточных протеаз типа фибринолизина и тканевых катепсинов, которые способны вызывать расщепление иммуноглобулина с образованием низкомолекулярных фрагментов [5, б, 7] Установлено, что жидкие иммуноглобулины содержат, как правило, некоторое количество продуктов распада, а лиофилизированные - значительно меньше [7]. Следовательно, лиофилизация считается пока лучшим способом достижения стабильности всех качественных показателей иммуноглобулинов, сохраняющих эффективность препаратов в процессе длительного времени [1, 2].
В соответствии со спецификацией на препарат жидкого антирабического иммуноглобулина, выпускаемого РосНИПЧИ «Микроб», срок его хранения -1 год б месяцев. Разработка лиофилизированной формы препарата, безусловно, позволит увеличить этот срок, что является актуальным в связи с высокой востребованностью препарата на Российском фармацевтическом рынке.
Целью настоящей работы явилось получение лиофилизированной формы антирабического иммуноглобулина и изучение ее качественных характеристик на момент выпуска и в процессе хранения.
Материалы и методы
В ходе выполнения работы были получены и исследованы свойства 11 экспериментальных серий лио-филизированного препарата гетерологичного анти-рабического иммуноглобулина: 002, 009, 012-014, 019, 031-033, 037, 055. Исходные серии жидкого антирабического иммуноглобулина полностью соответствовали требованиям ФСП на препарат.
Жидкий иммуноглобулин разливали по 1 мл в стеклянные ампулы, замораживали при температуре минус (45±2) °С на холодильной установке NZ-250/75 и лиофильно высушивали на установке LZ-9, «Фригера» (Чехия).
Внешний вид таблетки в ампуле и растворимость сухого препарата оценивали визуальным методом. Определение потери в массе при высушивании (остаточную влажность) проводили весовым методом согласно ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» [9], рН определяли потенциоме-трически согласно ГФ XII, вып. 1 [3]. Прозрачность в сухом препарате после растворения определяли спектрофотометрически согласно ФС 42-3874-99 [9]. Содержание белка определяли методом с биурето-вым реактивом согласно ФС 42-3874-99 [9].
Уровень специфической активности жидкого и лиофилизированного препарата антирабического
иммуноглобулина определяли двумя способами - in vivo биологическим методом в реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах [10] и in vitro методом дот-иммуноанализа с применением имму-носуспензионной тест-системы на основе наночастиц коллоидного золота. Определение специфической активности in vivo было проведено с введением в опыт одновременно иммуноглобулина исходной жидкой и лиофилизированной форм и отраслевого стандартного образца ОСО 42-28-200-04 специфической активности антирабического иммуноглобулина ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Статистическую обработку проводили по методу Reed и Muench [10]. Вируснейтрализующую активность лиофилизиро-ванного антирабического иммуноглобулина - кандидата в ОСО специфической активности определяли в сравнении с международным стандартом специфической активности антирабического иммуноглобулина.
В качестве стабилизатора, предупреждающего процессы повреждения белка при лиофилизации, использовали гликокол (глицин) в концентрации (2,25±0,25) %. Данный протектант наиболее широко применяется в биотехнологической практике при лиофилизации лечебных иммуноглобулинов, предполагающих внутримышечное введение [4].
Результаты и обсуждение
Для подбора оптимального режима лиофилиза-ции было высушено 7 экспериментальных образцов 3 серий антирабического иммуноглобулина при различных режимах - 24, 36 и 48 ч (табл. 1). Все лиофи-лизаты представляли собой хорошо сформированную таблетку белого цвета мелкопористой структуры, потеря в массе при высушивании или остаточная влажность составила в среднем 0,5 %, что соответствует требованиям Европейской Фармакопеи на лиофилизированный лечебный иммуноглобулин, согласно которой данный параметр не должен превышать 3,0 %. Практически все образцы высушенного иммуноглобулина характеризовались хорошей растворимостью - в среднем 2 мин (по Европейской Фармакопее - не более 10 мин). Значение концентрации водородных ионов для всех образцов сухого препарата АИГ соответствовало требованиям ФСП на жидкий препарат - от 6,6 до 7,4.
Прозрачность растворенного после лиофилиза-ции антирабического иммуноглобулина в основном не претерпела значительных изменений по сравнению с жидкой формой. Данный показатель соответствовал требованиям ФСП на жидкий антираби-ческий иммуноглобулин - не более 0,05. Однако в иммуноглобулине, высушенном в течение 24 ч, показатель прозрачности возрос по сравнению с жидкой формой и вышел за пределы нормы в образце экспериментальной серии 033 - соответственно 0,055 и 0,015. Возможно, режим интенсивного высушивания способствует формированию нерастворимых агрегатов, о чем свидетельствуют показатели прозрачности
7б
Таблица 1
Характеристика физико-химических и биологических свойств лиофилизированного антирабического иммуноглобулина,
высушенного при различных режимах
Серия препарата АИГ Описание Режим лиофилизации, ч Растворимость, мин Потеря в массе при высушивании, % Прозрачность жидкого иммуноглобулина Прозрачность после растворения сухого препарата Содержание белка в жидком препарате, % Содержание белка в сухом препарате, %
031 Однородная 24
мелкопористая
масса белого цвета
« 48
032 « 24
« 36
« 48
033 « 24
« 48
2 0,8 0,022
1 0,25 0,022
2 1,03 0,018
2 0,125 0,018
2 0,125 0,018
1 1,03 0,015
2 0,035 0,015
0,028 9,9 8,9
0,032 9,9 8,9
0,034 9,9 8,9
0,021 9,9 8,99
0,016 9,9 9,2
0,055 9,9 8,4
0,022 9,9 8,8
препарата после растворения, и данный режим менее благоприятен для белковой молекулы. Результаты определения белка в лиофилизатах показали, что содержание целевых антител в исследованных образцах антирабического иммуноглобулина после лио-филизации претерпело изменение в сторону снижения в среднем на 10 %, однако наименьший уровень потери белка наблюдали в препаратах, высушенных в течение 36 и 48 ч.
Сравнивая показатели физико-химических и биологических параметров препарата, высушенного при различных режимах, можно сделать предварительный вывод о том, что высушивание иммуноглобулина в течение 24 ч наименее предпочтительно, поскольку показатели прозрачности и содержания белка в таких препаратах уступают аналогичным у препаратов, высушенных в течение 36 и 48 ч. Следовательно, лио-филизация при пониженной скорости удаления воды является более щадящим способом, чем лиофилиза-ция при быстром удалении воды, когда происходит повреждающее воздействие на структуру белковой молекулы за счет столкновений молекул водяного пара с молекулами белков.
Основным биологическим свойством как жидкого, так и лиофилизированного препарата антира-бического иммуноглобулина является специфическая активность. Данный показатель отражает напряженность создаваемого пассивного иммунитета в организме пациента, получающего антирабическую
помощь в виде комбинированного введения антирабического иммуноглобулина и антирабической вакцины. Согласно ФСП на препарат, этот показатель должен составлять не менее 150 МЕ при исследовании в биологической реакции нейтрализации при участии в ней от 100 до 1000 LD50 вируса бешенства.
Как показали результаты реакции нейтрализации, лиофилизированный антирабический иммуноглобулин экспериментальных серий 037 и 055 обладает уровнем специфической активности в 419 и 382 МЕ соответственно при титре вируснейтрализующих антител 1:11061 против 632 ЛД50 фиксированного вируса бешенства CVS и 1:11220 против 737,8 ЛД50. На этом же уровне и специфическая активность исходного препарата жидкой формы - 512 и 448 МЕ соответственно для серий 037 и 055 (табл. 2).
В рамках темы «Разработка национального стандартного образца специфической активности антирабического иммуноглобулина» была изготовлена экспериментальная лиофилизированная серия 055, образцы которой являются кандидатами в ОСО специфической активности антирабического иммуноглобулина ГИСК им. Л.А.Тарасевича. В лаборатории бешенства и оспы ФГУН ГИСК им. Л.А.Тара-севича (Москва) был проведен контроль специфической активности экспериментального лиофилизата путем постановки реакции нейтрализации на белых мышах в сравнении с Международным стандартом (The International Standard for Rabies immunoglobulin)
Таблица 2
Специфическая активность лиофилизированного антирабического иммуноглобулина
Серия АИГ Форма АИГ Норма Референс-образец Специфическая активность в РН
по НД, МЕ/мл защитный титр МЕ/мл
37 (исх.) Жидкий не менее 150 ОСО 42-28-200-04 специфической активности ГИСК им. Л.А.Тарасевича 1:13536 512
037 Лиофилизат « « 1:11061 419
55 (исх.) Жидкий « « 1:5470 448
055 Лиофилизат « « 1:11220 382
055/1 Лиофилизат « The International Standard for Rabies immunoglobulin 1:3034 179
055/2 Лиофилизат « « 1:3366 199
Активность лиофилизированного препарата антирабического иммуноглобулина, определяемая in vitro в дот-иммуноанализе:
По оси абсцисс: разведения АИГ и нормальной лошадиной сыворотки (НЛС), начиная с 1:160; по оси ординат: 1-7 ряды - образцы сухих серий 002, 009, 012, 013, 014, 019, 032, 8 ряд - НЛС (отрицательный контроль)
с активностью 59 МЕ в ампуле. Полученные результаты специфической активности соответствуют требованиям ВОЗ для антирабических иммуноглобулинов - не менее 150 МЕ/мл (табл. 2).
На рисунке представлены данные по определению уровня специфической активности у лиофили-зированного АИГ серий 002, 009, 012, 013, 014, 019, 032 in vitro в дот-иммуноанализе.
В зависимости от серии препарата, уровень активности колебался от 1:5000 до 1:20000, для серии 013 - 1:40000. Следует отметить, что образцы указанных серий были исследованы после хранения в течение пяти (серия 002), трех (серии 009, 012-014, 019) и двух лет (серия 032).
Результаты определения активности образцов лиофилизированного иммуноглобулина в тестах in vivo и in vitro свидетельствуют о том, что препарат, подвергшийся лиофилизации, в полной мере сохранил способность к нейтрализации вируса бешенства как на момент получения, так и после длительного хранения. Применение гликокола в качестве протек-танта вполне приемлемо для предотвращения повреждающего действия при лиофилизации антирабического иммуноглобулина.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов получена лиофилизированная форма препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина, физико-химические и биологические параметры которой соответствуют требованиям Европейской Фармакопеи на лиофилизированный лечебный иммуноглобулин и ФСП на жидкий антираби-ческий иммуноглобулин. В процессе хранения от 3 до 5 лет сухой препарат стабилен в отношении показателей растворимости, прозрачности, активности. Это указывает на наличие принципиальной возможности получения препарата в сухой лекарственной форме. Лиофилизированная форма препарата позволит не только увеличить срок годности препарата, но также
избежать проблем, связанных с жесткими требованиями к транспортированию жидких препаратов, что весьма актуально для Российской Федерации с ее протяженными транспортными путями.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Воронин Е.С., редактор. Биотехнология. СПб.: ГИОРД; 2005. 792 с.
2. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. М.: Медицина; 1961. 263 с.
3. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XII издание. Ч 1. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения; 2008. 704 с.
4. Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И. Биотехнология иммунобиологических препаратов. Харьков: Фармитэк; 2008. 312 с.
5. Лаптева Л.К., Минакова Л.В., Гавриленкова В.Ю. Сохраняемость специфических антител в иммуноглобулине человека противостолбнячном в зависимости от степени фрагментации IgG. Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. М., 1987. 4:148-53.
6. Никитина В.Д., Холчев Н.В., Колесникова Л.И. и др. Исследование фрагментации препаратов гамма-глобулинов, выпускаемых в СССР. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол. 1975; 1:44-8.
7. Терновой А.П. Вопросы иммунологии инфекционных и аллергических заболеваний Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол. 1971; 3:140-4.
8. Условия транспортирования и хранения медицинских иммунобиологических препаратов. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.3.2.1248-03. М.: Минздрав России; 2003. 19 с.
9. Физико-химические, химические, физические и имму-нохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Фармакопейная статья ФС 42-3874-99. М.: Фармакопейный государственный комитет; 2000. 77 с.
10. Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H., editors. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Geneva: WHO; 1996. 469 p.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. VoroninE.S., editor. [Biotechnology]. SPb.: GIORD; 2005. 792 p.
2. Blankov B.I., Klebanov D.L. [Application of Lyophilization in Microbiology]. M.: Meditsina; 1961. 263 p.
3. [State Pharmacopeia of the Russian Federation]. 12th ed. M.: Izd-vo “Nauch. Tsentr Ekspert. Sredstv Med. Primen.”; 2008. 704 p.
4. Krasnopolskii Yu.M., Borshchevskaya M.I. [Biotechnology of Immunobiological Preparations]. Kharkov: Izd-vo “Farmitek”; 2008. 312 p.
5. Lapteva L.K., Minakova L.V, Gavrilenkova VYu. [Preservation capacity of specific antibodies in human anti-tetanus immunoglobulin depending on the degree of IgG fragmentation]. In: [Standards, Strains and Control Methods of Bacterial and Viral Preparations]. M.; 1987. P. 148-53.
6. Nikitina V.D., KholchevN.V, Kolesnikova L.I. et al. [Examination of fragmentation of gamma-globulin preparations manufactured in the USSR]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1975; 1:44-8.
7. Ternovoi A.P. [Issues of immunology of infectious and allergic diseases]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1971; 3:140^.
8. [Sanitary and Epidemiological Regulations “Conditions of Transportation and Storage of Medical Immunobiological Preparations” SR 3.3.2.1248-03]. M.: Minzdrav RF; 2003. 19 p.
9. [Physico-Chemical, Physical, Chemical and Immunochemical Methods of Control of Medical Immunobiological Preparations]. Pharmacopeia Monograph FS 42-3874-99. M.: Minzdrav RF; 299. 77 p.
Authors:
Abramova E.G., Kochkalova N.N., Nikiforov A.K., Ivanov Yu.V., Sinitsyna N.V., Mikheeva TA., Minaeva L.N., Galkina M.V., Savitskaya L.V., Generalov S.V., Kireev M.N., Sharapova N.A. Russian Research AntiPlague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: microbe@san.ru
Butyrskii A.Yu. L.A.Tarasevich State Institute for Standardization and Control. Moscow.
Об авторах:
Абрамова Е.Г., Кочкалова Н.Н., Никифоров А.К., Иванов Ю.В., Синицына Н.В., Михеева ТА., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Савицкая Л.В., Генералов С.В., Киреев М.Н., Шарапова Н.А. Российский научноисследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru.
Бутырский А.Ю. Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича. Москва.
Поступила 02.04.10.
