CC BY
37
УДК 616.988.21:616.9-084
А.К.Никифоров, И.А.Дятлов, О.А.Волох, О.А.Лобовикова, М.Н.Киреев
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ОСНОВНЫХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ Р(аЬ')2-ФРАГМЕНТОВ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Определены оптимальные условия гидролиза пепсином молекулы антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади, разработана методика лабораторного выделения и очистки F(ab')2-фрагментов, получены и охарактеризованы лабораторные образцы препаратов, преимущественно состоящих из Р(аЬ')2-фрагментов, проведена оценка защитных и реактогенных свойств полученных препаратов на лабораторных животных. Дальнейшее масштабирование процессов очистки препарата на основе разработанной методики выделения F(ab')2-фрагментов позволит получить экспериментально-производственные серии ареактогенного антирабического иммуноглобулина для последующего изучения его эффективности и фармакокинетики.
Ключевые слова: бешенство, антирабический иммуноглобулин, F(ab')2-фрагменты.
Эпизоотолого-эпидемиологическая обстановка по бешенству в Российской Федерации в последние годы остается неблагополучной, особенно в Центральном, Южном, Приволжском и Уральском федеральных округах. В 2003-2004 гг. зарегистрировано на 17 % больше случаев заболевания и гибели животных от бешенства чем в 2001-2002 гг. В первом квартале 2005 г. выявлено 1706 случаев бешенства животных. Особую тревогу вызывают факты выявления бешеных лисиц на подворьях сельских жителей, а также заражения кошек уличным бешенством в крупных городах. На фоне неконтролируемого увеличения численности бездомных собак увеличился риск формирования очагов «городского» бешенства. В последние годы не уменьшается число лиц, обращающихся за медицинской помощью по поводу укусов и других повреждений от животных (2003 г. - 445 тыс., 2004 г. - 442 тыс. пострадавших). Ежегодно более 200 тыс. человек получают назначения на проведение курса антирабического лечения. За последние три года в нашей стране, несмотря на наличие высокоэффективных отечественных профилактических антирабических препаратов, зарегистрировано 47 случаев заболеваний людей гидрофобией, в том числе в 2004 г. - 17 летальных исходов [9] вследствие несвоевременного обращения пострадавших за медицинской помощью.
В России в широкой медицинской практике применяется антирабический иммуноглобулин (^), выделяемый из сыворотки крови гипериммунизиро-ванных лошадей. Этот препарат зарекомендовал себя как действенное средство для постэкспозици-онной профилактики бешенства у людей, однако обладает высокой реактогенностью и способностью вызывать сывороточную болезнь. Высокая стоимость менее реактогенных импортных препаратов человеческого антирабического иммуноглобулина не позволяет использовать их в широкой медицинской практике в России. Одним из перспективных направлений совершенствования гетерологичных сывороточных препаратов является использование Р(аЬ')2-фрагментов иммуноглобулинов [2, 8]. Полученные в результате ферментативно-кислотного протеолиза препараты, содержащие в основном Р(аЬ')2-фрагменты, отличались высокой стабильно-
стью при pH 2,1-5,0. Отсутствие Fc-фрагментов молекул иммуноглобулина повлияло на реактоген-ность препаратов, которая снизилась в 2-2,5 раза. Кроме того, для препаратов внутривенных иммуноглобулинов показана высокая эффективность инактивации микроорганизмов в процессе пепсинового протеолиза [1, 15], что позволяет получать гарантированно не контаминированные патогенами препараты. В 1998 г. представлена совместная работа французского медицинского департамента Пастер Мерье с таиландскими и филиппинскими учеными по разработке и испытанию нового лошадиного Ig. После ферментативного гидролиза и хроматографической очистки препарат Ig содержал 85 % F(ab')2 и только 15 % Fab-фрагментов. Отмечалась более высокая специфическая активность и низкая реактогенность нового препарата [14]. В связи с вышеизложенным представляется перспективным направление, связанное с разработкой технологии получения препарата нового, ареактогенного анти-рабического иммуноглобулина на основе F(ab')2-фрагментов.
Материалы и методы
В работе использовали коммерческий препарат иммуноглобулина антирабического лошадиного производства РосНИПЧИ «Микроб». Для проведения реакций гидролиза применяли кристаллический пепсин (En) фирмы Merck. Детекцию продуктов реакции ферментативного гидролиза иммуноглобулина осуществляли с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (Bio-Rad) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, Beckman). При хроматографии низкого давления использовали следующие носители: для гель-хроматографии - сефадекс G-200, G-150; для ионообменной хроматографии - Toyopearl HW-65, SP-Sepharose-XL. Показатели цветности, прозрачности, пироген-ности и токсичности оценивали в соответствии с требованиями фармакопейной статьи предприятия на коммерческий препарат.
Определение вируснейтрализующей активности проводили в реакции нейтрализации препаратов F(ab')2-фрагментов и иммуноглобулина антирабиче-ского с предварительно установленной дозой инфи-
цирующего вируса. В качестве стандарта использовали ОСО иммуноглобулина антирабического ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Для определения титра вируса готовили 10-кратные разведения мозговой ткани от 10-2 до 10-8, используя дистиллированную воду, содержащую 2 % инактивированной нормальной лошадиной сыворотки. Пробирки с вирусной суспензией выдерживали при температуре (37±1) °С в течение (60±5) мин, после чего сразу вводили по 0,03 мл интрацеребрально белым беспородным мышам весом (11±1) г. Наблюдение за животными вели в течение 21 сут. На 5-е сутки после заражения у мышей появлялись симптомы заболевания: взъерошенная шерсть, тремор при поднятии животного за кончик хвоста, нарушение координации движений задних конечностей, паралич, прострация (терминальный синдром). Начиная с 6-х суток учитывали животных, погибших от бешенства. Расчет LD50 вируса проводили по методу Reed и Muench [11].
Результаты и обсуждение
В соответствии с имеющимися литературными сведениями ожидалось, что Р(аЬ')2-фрагменты, сохранив специфическую активность in vitro и in vivo, окажутся менее реактогенными, чем специфический исходный иммуноглобулин. Получение F(ab')2-фрагментов антител проводили путем ферментативного расщепления (пепсинолиза) белков у-глобу-линовой фракции иммунной лошадиной сыворотки. Согласно литературным данным [3, 4, 13], при пеп-синолизе широко используется сухой препарат фермента, который добавляется к раствору иммуноглобулина в соотношении 1:50 - 1:100 (по белку). В то же время для получения F(ab')2-фрагментов и моновалентных Fab-фрагментов из IgG бараньей сыворотки может быть использован раствор пепсина в аналогичном соотношении [12]. Кроме того, отмечено, что видовые особенности сыворотки жи-вотного-продуцента влияют на способ получения фрагментов антител [10]. В связи с этим нами проведен подбор оптимальных условий ферментативного гидролиза антирабического лошадиного иммуноглобулина, а также методов детекции продуктов реакции и способов очистки F(ab')2-фрагментов.
На первом этапе, в малообъемных экспериментах, показано, что наиболее эффективно проведение ферментативного гидролиза в 0,1М ацетатном буфере (рН 4,5) в течение 24 ч (температура 37 °С) в соотношении En:Ig - 1:100 при использовании пепсина кристаллического. Реакция проводилась в присутствии мертиолята натрия в концентрации 1:10000. Реакцию останавливали коррекцией рН до 8,0 1 М NaOH, смесь центрифугировали при 15000 g в течение 20 мин для удаления нерастворимого осадка. В ходе проведенных экспериментов, в которых время фрагментации варьировало от 6 ч до 3 сут, установлено, что время экспозиции имело обратнокорреляционную связь с температурой, при которой проходило фрагментирование иммуноглобулина. При более низких температурах (22, 28 °С) процесс фрагментирования увеличивается до 72 ч и расщепление молекулы иммуноглобулина происходит не полностью, т.е. обнаруживается присутствие константной субъединицы молекулы иммуноглобулина.
Для детекции продуктов пепсинолиза имму-
ноглобулина использовали SDS-электрофорез в ПААГ и ВЭЖХ. Наиболее четкие результаты получены при использовании SDS-ПААГ электрофореза с концентрацией геля 7,5 % в нередуцирующих условиях. Такой подход позволяет идентифицировать оставшийся негидролизованный иммуноглобулин с белковой линией в области 150 кДа, F(ab')2-фраг-менты с линией порядка 100 кДа и Fc-фрагменты -50 кДа. Кроме того, проведена идентификация продуктов реакции с использованием ВЭЖХ, выявившей пики негидролизованного иммуноглобулина, F(ab')2-фрагментов и низкомолекулярных образовавшихся пептидов.
Для выделения и очистки F(ab')2-фрагментов подобраны условия хроматографического разделения продуктов пепсинолиза. Согласно литературным данным, в этих целях широко используется колоночная хроматография на КМ-целлюлозе [7], се-фадексе G-75 [6], G-150 [12], разработан способ объемной ионообменной хроматографии с использованием КМ-целлюлозы и последующего центрифугирования [5]. В нашей работе при хроматографии использовали колонку размером 2,6^50 см, заполненную гелем Toyopearl HW-65 или сефадекс G-200, элюция проводилась 0,85 % раствором хлорида натрия, содержащим 0,02 % азида натрия. Такие условия позволяют разделить продукты ферментативного гидролиза на четыре фракции, причем фракция F(ab')2-фрагментов не полностью отделяется от высокомолекулярных остатков исходных иммуноглобулинов, их пики частично перекрещиваются. Фракции, содержащие F(ab')2-фрагменты, собирались и лиофильно высушивались для дальнейшего использования.
В связи с тем, что использование бактериоста-тических средств на любом этапе получения профилактических препаратов нежелательно (необходимость этапа очистки и анализов для подтверждения чистоты конечного продукта), а применение ультрацентрифугирования приводит к дополнительным временным и материальным затратам, были проведены эксперименты по усовершенствованию технологии получения F(ab')2-фрагментов. С этой целью пепсинолиз проводили в асептических условиях, использовали 0,1 М ацетатный буфер (рН 4,2 и 4,8). Для ускорения и полноты процесса применяли термостатированную качалку RC-TK (США), реакцию проводили в 250 мл колбах и 100 мл флаконах. В работе использовали как кристаллический пепсин, так и его раствор, приготовленный ex tempore. Остановку реакции осуществляли доведением рН смеси до нейтральных значений, затем продукты реакции замораживали при минус 20 °С. Детекцию продуктов пепсинолиза проводили в SDS-ПААГ электрофорезе, очистку F(ab')2-фрагментов - ионообменной хроматографией на SP-sepharose-XL (элюирующий буфер -0,02 М Na-ацетатный, рН 5,5), гель-хроматографией на сефадексе G-150 (элюирующий буфер - 0,1 М фосфатный с 0,02 М NaCl, рН 7,4).
Показано, что результаты пепсинолиза иммуноглобулина не зависели от рН ацетатного буфера в реакционной смеси, от использования сухого фермента или его раствора, времени инкубации (от 20 до 24 ч). В этих случаях профили элюции препаратов при хроматографии были аналогичными, а в SDS-
А
Б
кДа
160
67
45
24
Получение Г(аЪ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина:
- профиль элюции продуктов пепсинолиза иммуноглобулина на 8Р^ерИагс«е-ХЬ; Б - 8Э8-ПААГ электрофорез продуктов пепсинолиза иммуноглобулина, М- маркеры мол. веса, 1-4 - пик 2 (Р(аЪ')2-фрагменты), 5-7 - пик 1 (остатки иммуноглобулина),
8-11 - этапы пепсинолиза, 12 - нативный иммуноглобулин
ПААГ электрофорезе отмечалось наличие мажорных полос с молекулярной массой 100 и 50 кДа (Б(аЪ')2- и Бс-фрагменты соответственно), а также присутствие незначительного количества остатков нативного иммуноглобулина (150 кДа) и пептидов (20-25 кДа). При ионообменной хроматографии отмечено 4 пика (рисунок, А), во втором (мажорном) элюировались Б(аЪ')2-фрагменты без примеси иммуноглобулина или Бс-фрагментов, как было установлено последующим 8Б8-ПААГ электрофорезом (рисунок, Б). Полученные при гель-хроматографии Б(аЪ')2-фраг-менты (пик 2) имели незначительную примесь цельного иммуноглобулина (полоса 150 кДа при электрофоретическом анализе). Увеличение концентрации иммуноглобулина в реакционной смеси (использовали 5 % раствор по белку) и фермента (соотношение 1:50) позволяло получать раствор Б(аЪ')2-фрагментов с большей концентрацией (по белку), что сокращало время концентрирования препарата.
С целью оптимизации процесса получения Б(аЪ')2-фрагментов проводили пепсинолиз растворенной, но неосветленной пасты полуфабриката ан-тирабического иммуноглобулина. Соотношение иммуноглобулин:фермент и условия реакции были аналогичны проведенным ранее экспериментам. В этом случае продукты пепсинолиза разделялись плохо - профиль элюции был смазан, пики нечеткие, их количество сократилось до 2. По-видимому, использование раствора иммуноглобулина большей концентрации (до 10-12 % по белку) для увеличения выхода Б(аЪ')2-фрагментов более перспективно.
Следующим этапом исследований было определение реактогенности и специфической активности полученных препаратов Б(аЪ')2-фрагментов. Проведены сравнительные исследования реактогенных и токсигенных свойств гетерогенного антирабического иммуноглобулина и выделенных из него Б(аЪ')2-фрагментов. Установлено, что все полученные серии препарата Б(аЪ')2-фрагментов являются непироген-ными - сумма повышений температуры у кроликов была в диапазоне от 0,9 до 1,8 °С. На модели мор-
ских свинок и белых мышей показано, что препараты Р(аЬ')2-фрагментов не токсичны. Определение вирус-нейтрализующей (специфической) активности препаратов проводили по стандартной методике. Считается, что препарат обладает достаточными защитными свойствами, если титр специфических вируснейт-рализующих антител не менее 150 МЕ/мл в реакции нейтрализации (РН) с фиксированным вирусом бешенства в количестве 100-1000 LD50. Активность
—5 8771 /
штамма составила 10 ’ /0,03 мл, что соответствует
паспортным данным штамма из ГИСК им. Л.А.Тара-севича и является достаточной для проведения последующей реакции биологической нейтрализации на мышах. Основную вирусную суспензию разводили до концентрации вируса (250±50) LD50/0,03 мл, и добавляли (1:1) испытуемые препараты иммуноглобулина (контроль) и Б(аЬ')2-фрагментов (конечные разведения препаратов 1:1000-1:16000). Одновременно проводили повторное определение LD50 вируса. После 1-часовой инкубации при температуре (37±0,5) °С содержимое из каждой пробирки вводили по 0,03 мл интрацеребрально белым мышам (11±1) г. Наблюдение за животными вели в течение 21 сут. Анализ результатов проводили по методу Reed и Muench, где титр иммуноглобулина представляли в виде нейтрализующего разведения, в котором препарат способен защитить 50 % белых мышей от 100 -1000 LD50 вируса бешенства (табл. 1).
Показано, что активность Б(аЬ')2-фрагментов (серии 01 и 02) была в два раза выше активности контрольного (нерасщепленного) препарата иммуноглобулина. Однако, несмотря на аналогичный профиль элюции при хроматографии и результаты белкового электрофореза, специфическая активность препарата, полученного реакцией пепсиноли-за с использованием сухого фермента (серия 03), была значительно ниже не только препаратов, полученных при ферментативном гидролизе с использованием раствора пепсина, но и нерасщепленного иммуноглобулина. Необходимо также отметить стабильность полученных серий Б(аЬ')2-фрагментов,
D
Таблица 1
Анализ специфической активности препаратов F(ab')2-фрагментов
Препарат Титр Кол-во мышей Paзвeдeпиe препарата
(N/n) i/iGGG i/2GGG 1 i/4GGG | i/8GGG i/i6GGG
Ig сер.14 1:1122 Абсолютные 3/3 G/б i/5 G/б G/б
(контроль) Кумулятивные* 4/3 i/9 i/i4 G/2G G/26
% летальности 42 9G 93 iGG iGG
F(ab')2 сер. 01 1:2633 Абсолютные 4/2 5/i i/5 i/5 G/б
Кумулятивные i i/2 7/3 2/8 i/i3 G/i9
% летальности 15 3G 8G 92 iGG
F(ab')2 сер. 02 1:1799 Абсолютные 5/i 3/3 G/б G/б G/б
Кумулятивные 8/i 3/4 G/iG G/i6 G/22
% летальности ii 57 iGG iGG iGG
F(ab')2 сер. 03 Мепее 1000 Абсолютные 2/4 i/5 G/б G/б G/б
Кумулятивные 3/4 i/9 G/i5 G/2i G/27
% летальности 57 9G iGG iGG iGG
* Кумулятивные данные: живые - в каждой графе суммируется количество мышей, выживших при данном и предыдущем разведении с учетом того, что каждая мышь, выжившая при меньшем разведении вируса, вероятно, выжила бы и при большем его разведении; павшие - в каждой графе суммируется количество мышей, павших при данном и больших разведениях.
Примечание. Б(аЪ')2 сер. 01 и 02: пепсинолиз раствором пепсина 01 серии в течение 24 ч, очистка - гель-хроматография + ионообменная; пепсинолиз 02 серии в течение 22 ч, очистка - ионообменная хроматография; сер. 03 - пепсинолиз сухим пепсином в течение 24 ч, очистка - ионообменная хроматография.
вируснейтрализующая активность которых не изменялась при хранении при минус 20 °С (табл. 2).
В связи с введением дополнительных технологических приемов очистки препарата его стоимость увеличивается примерно в два раза, но остается в 5 раз ниже стоимости препаратов человеческого иммуноглобулина. Низкая реактогенность в сочетании с высокой вируснейтрализующей активностью делает препарат нового гетерологичного иммуноглобулина предпочтительным.
Таким образом, пилотная технология получения Б(аЪ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина будет складываться из этапов ферментации пепсином антирабического иммуноглобулина, полученного традиционным способом, хроматографической очистки Б(аЪ')2-фрагментов от остатков Бс-части молекулы, концентрирования, стерилизующей фильтрации, стабилизации и лиофильного высушивания. Дальнейшее внедрение данного препарата в практику будет связано с изучением его эффективности в острых экспериментах по лечению уличного бешенства и всесторонней оценке фармакокинетики, являющихся основой для принятия решения о применении для постэкспозиционной профилактики бешенства у людей.
Таблица2
Изменение вируснейтрализующей активности препаратов К(аЬ')2-фрагаентов антирабического иммуноглобулина (МЕ) при хранении
I_________Препарат_____________|__________________________I_____________ti
Ig сер. 14 (контроль) 256 256
F(ab')2 сер. 01 6GG 512
F(ab')2 сер. 02 512 4iG
F(ab')2 сер. 03 Менее 228 Менее 200
Примечание. ^ - в момент получения Р(аЪ')2-фрагментов; ^ - через 10 мес. (срок наблюдения).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алсынбаев М.М., Исрафилов А.Г., Минакова Л.В. и др. // Акт. вопр. разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов. - Уфа, 2000. - Ч. 1. - С. 108-116. - 2. Барбан П.С., Пантюхина
А.Н. // Матер. Всесоюз. симп., посв. 60-летию Тбилисского НИИВС. - Тбилиси, 1984. - С. 491-495. - 3. Барбан П.С., Пантюхина А.Н. // ЖМЭИ. - 1976. - № 8. - С. 73-78. -4. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. // Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая школа, 1991. - С. 155-157. - 5. Кускова З.Р. // Вирусные и бактериальные препараты. - Томск, 1984. -Т. 33. - С. 106-109. - 6. Лимарева Т.Д., Ратнер Г.М.,
Кондратьева М.Л. // Там же. - С. 100-105. - 7. Мальцева Г.Г., Кускова З.Р. // Акт. вопр. иммунопрофилакт. вирусн. и бактериальн. инф. - Томск, 1981. - С. 80-81. - 8. Мирошни-ков П.Н., Лебедев Л.Г., Терещенко Т.А. // Биотехнология. - 2005. - № 1. - С. 11-18. - 9. О санитарно -эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2004 году: Государственный доклад. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2005. - С. 183184. - 10. Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - С. 413-423. - 11. ФСП 42-0020-4413-03 Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий. - 12. Davis M.E., Barrett A. J., Hembry R.M. // J. Immunol. Methods. - 1978. - N 21. - P. 305-315. - 13. Ishikawa E., Hashida S., Kohno T. et al. // Monoclonal Antibody Prod. Techn. and Appl. - New York, Basel, 1987. - P. 113-137 / Цит. по РЖ «Физико-химическая биология и биотехнология». - 1987. -№ 10. - 10Д186. - 14. Lang J., Attanath P., Quiambao B. et al. // Acta Tropica. - 1998. - N 70 - Р. 317-333. - 15. Omar A., Kempf C., Immelmann A. et al. // Transfusion. - 1996. -Vol. 36, N 10. - Р. 866-872.
A.K.Nikiforov, I.A.Dyatlov, O.A.Volokh, O.A.Lobovikova, M.N.Kireyev
Manufacturing and Analysis of the Main Characteristics of Heterologous Anti-Rabies Immunoglobulin Preparation Consisting of F(ab’)2 Fragments
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
Optimal conditions were determined for pepsin hydrolysis of the antirabies immunoglobulin molecule produced from equine blood. The methods of laboratory isolation of F(ab’)2 fragments and their purification were developed and used to obtain laboratory specimens of the preparations, consisting primarily of F(ab’)2 fragments, and to characterize them by assessing their protective and reactogenic properties on test animals. Further scaling of the purification processes based on F(ab’)2 the isolation techniques described above would enable experimental and productional series of the non-reactogenic antirabies immunoglobulin preparation to be obtained and to proceed with studying their efficacy and pharmacokinetics.
Key words: rabies, anti-rabies immunoglobulin, F(ab’)2 fragments.
Поступила 03.06.06.
