CC BY
22
УДК 616.988.21
С.В.Генералов, Е.ГАбрамова, A.K.Никифоров, Л.В.Савицкая, М.В.Галкина, Л.Н.Минаева, Т.A.Mихеева, A.Г.Селезнёва, И.М.Жулидов, РА.Свинцов, Г.П.Лазаренко, Ю.В.Брандзишевский
ИЗУЧЕНИЕ АНАфИЛАкТОГЕННЬІХ СВОЙСТВ F(AB’L-ФРAГMЕНТОВ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО AНТИPAБИЧЕСKОГО ИММУНО ГЛОБУЛИНA
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
В тесте in vivo проведено сравнительное изучение анафилактогенных свойств гетерологичного антирабиче-ского иммуноглобулина и полученных на его основе F(ab,)2-фрaгментов. Показано отсутствие анафилактогенных свойств F(ab,)2-фрaгментов гетерологичного антирабического иммуноглобулина.
Ключевые слова: бешенство, антирабический иммуноглобулин, F(ab,)2-фрaгменты, реактогенность, анафилаксия.
Неблагополучная эпидемиологическая и эпизо-отологическая ситуация по бешенству в Российской Федерации, особенно обострившаяся в последнее десятилетие, способствует увеличению числа лиц, ежегодно обращающихся за антирабической помо-шью (около 450 тыс. чел.) [9].
В России для постэкспозиционной профилактики гидрофобии используют вакцины КоКАВ, КАВ и антирабический иммуноглобулин, полученный из лошадиной или человеческой сыворотки. Несмотря на высокую степень очистки препарата гетерологично-го антирабического иммуноглобулина, у 1-2 % пациентов при его введении могут возникнуть побочные аллергические реакции в виде сывороточной болезни и анафилактического шока [14]. Анафилактический шок имеет место в результате взаимодействия между фиксированными на клетке IgE и специфическим антигеном с последующим высвобождением медиаторов из клеток-мишеней: базофильных лейкоцитов или тучных клеток. Сывороточная болезнь - это аллергическая реакция, связанная с образованием иммунных комплексов в крови или тканях и активацией комплемента. При использовании гомологичного иммуноглобулина таких осложнений не возникает, однако, его себестоимость существенно выше таковой гетерологичного иммуноглобулина.
В РосНИПЧИ «Микроб» разработана биотехнологическая схема получения антирабического препарата на основе бивалентных F(ab’)2-фрагментов антител путем ферментативного расщепления белков у-глобулиновой фракции иммунной сыворотки [7, 8]. При этом представляется вероятным, что полученные таким образом F(ab’)2-фрагменты менее реактогенны, чем нерасщепленный антирабический иммуноглобулин, из которого они были выделены [13].
Единого метода, с помощью которого можно зарегистрировать аллергизирующее действие фармакологических средств, не существует [4]. Аллергодиагностика включает в себя набор реакций in vivo и in vitro, которые позволяют выявлять разные
типы гиперчувствительности. В работах Т.А.Меняв-цевой ранее была изучена сенсибилизирующая активность антирабического иммуноглобулина и его фракций in vitro в тестах непрямой дегрануляции тучных клеток и реакции повреждения нейтрофилов в крови [5, 6]. Аллергизирующие свойства препаратов антирабического иммуноглобулина и сыворотки, очищенной методом ферментолиза, были также ранее изучены исследователями Томского НИИВС в тестах in vivo и in vitro [11, 12].
Целью настоящего исследования явилось изучение в тесте in vivo анафилактогенных свойств препарата F(ab’)2-фрагментов гетерологичного антира-бического иммуноглобулина, полученного методом ферментативного гидролиза с последующей хроматографической очисткой в сравнении с коммерческим антирабическим иммуноглобулином.
Материалы и методы
Анафилактогенные свойства F(ab’)2-фрагментов гетерологичного антирабического иммуноглобулина изучали в реакции активной анафилаксии в соответствии с рекомендациями Л.А.Степановой [11, 12]. В качестве биологических моделей использовали морских свинок массой 300-350 г (всего 21 животное). Животных однократно сенсибилизировали подкожным введением испытуемых препаратов в количестве 0,5 мл, содержащих 0,1 мг белка. На 21-й день свинкам внутрисердечно вводили разрешающие дозы соответствующих препаратов, содержащих 10, 40 и 80 мг белка. Животным контрольной группы по идентичной методике вместо анафилактогенов вводили 0,9 % раствор натрия хлорида. Объем разрешающей дозы составлял 1 мл. Каждая доза была исследована на 3 животных. Выбор схемы сенсибилизации также обусловлен рекомендациями санитарных правил СП 3.3.2.561-96 и методических указаний по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ [1, 4].
Учет результатов проводили по соотношению числа погибших животных к числу взятых в опыт и по тяжести реакции. Силу анафилактической реакции оценивали по 4-балльной схеме [10].
Анафилактический индекс определяли по формуле W.Weigle [11]:
(4а + 3Ь + 2с + 1й + 0е)
К =--------------------- ,
(а + Ь + с + й + е)
где 4, 3, 2, 1, 0 - оценка шока в баллах; а, Ь, с, й, е - количество животных, у которых имел место шок соответствующей тяжести.
Для статистической обработки результатов исследования использовали ранговый Х-критерий Ван-дер-Вардена [3].
Результаты и обсуждение
Реактогенность иммунных препаратов представляет собой сложный многокомпонентный показатель, главной составляющей которого являются анафилактогенные свойства.
Результаты по изучению активной анафилаксии представлены в таблице. Животным первой группы вводили антирабический гетерологичный иммуноглобулин, получаемый риванол-спиртовым способом. При введении разрешающей дозы 10 мг белка, лишь у одной свинки наблюдалась анафилактическая реакция. При этом имели место следующие признаки анафилаксии: общее беспокойство, взъерошивание шерсти на затылке, зуд, кратковременные судороги. Примерно через 30 мин животное пришло в нормальное состояние. У остальных животных данной группы проявления признаков анафилаксии не наблюдалось. Анафилактический индекс в данной группе составил 1,0.
При внутрисердечном введении 40 мг иммуноглобулина также у одной свинки имел место более сильный анафилактический шок, чем в предыдущей группе. Анафилактическое состояние развивалось быстро, свинка падала на бок, наблюдались сильные
судороги, животное пало через несколько минут после введения разрешающей дозы. У остальных животных исследуемой группы признаков анафилаксии не наблюдалось. Дальнейшее увеличение концентрации белка в разрешающей дозе не вызывало сильных проявлений анафилаксии. В группе животных, которым было введено внутрисердечно 80 мг иммуноглобулина, у двух свинок наблюдались только слабые признаки анафилаксии. Значение анафилактического индекса составило 0,6.
Среди животных, которым в качестве сенсибилизирующего и разрешающего препарата вводили F(ab’)2-фрагменты антирабического иммуноглобулина, не было выявлено ни одного животного с проявлениями анафилаксии. Анафилактический индекс не зависел от концентрации белка в разрешающих дозах и был равен нулю. Различие анафилактогенных свойств гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его F(ab’)2-фрагментов статистически достоверно (р < 0,05; X = 4,5).
Реакция животных контрольной группы на введение 0,9 % раствора натрия хлорида также отсутствовала.
Наблюдаемое отсутствие анафилактогенных свойств препарата F(ab’)2-фрагментов антирабиче-ского иммуноглобулина может быть связано с меньшим молекулярным весом и особенностями антигенной структуры молекулы. Известно, что детерминанты С-концевой половины тяжелой цепи, основную часть которой составляет Fc-фрагмент, реагируют с комплементарными антителами, образующимися при сенсибилизации соответствующими иммуноглобулинами [2]. Возможно, вследствие отсутствия соответствующих детерминант, F(ab’)2-фрагменты вызывают при сенсибилизации организма меньшую продукцию комплементарных антител, что, в свою очередь, обусловливает отсутствие анафилактоген-ных реакций при повторном введении.
Таким образом, результаты проведенного тестирования свидетельствуют об отсутствии анафи-лактогенных свойств препарата F(ab’)2-фрагментов гетерологичного антирабического иммуноглобули-
Результаты исследования анафилактогенных свойств препарата F(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина
Группа Сенсибилизация Разрешающее введение препаратов
Исследуемый препарат Доза белка, мг Результаты
Исследуемый препарат доза белка, мг по тяжести реакции по выживаемости
4 3 2 1 0 К
1 Антирабический 0,1 Антирабический 10 0 1 0 0 2 1 0/3
иммуноглобулин иммуноглобулин 40 1 0 0 0 2 1,3 1/3
80 0 0 0 2 1 0,б 0/3
2 F(ab’)2-фрагменты 0,1 F(ab’)2-фрагменты 10 0 0 0 0 3 0 0/3
антирабического антирабического
иммуноглобулина иммуноглобулина 40 0 0 0 0 3 0 0/3
80 0 0 0 0 3 0 0/3
3 0,9 % раствор 0,0 0,9 % раствор 0,0 0 0 0 0 3 0 0/3
натрия хлорида натрия хлорида
бб
на, что указывает на перспективность его применения в качестве средства для лечебной профилактики гидрофобии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: Санитарные правила (СП 3.3.2.561-96). М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. 127 с.
2. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. М.: Высшая школа; 1985. 287 с.
3. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа; 1990. С. 128-30.
4. Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Федосеева В.Н. и др. Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Хабриев Р.У, редактор. М.: Медицина; 2005. С. 54-9.
5. Менявцева Т.А. Экспериментальная модель оценки сенсибилизирующей активности антирабического иммуноглобулина. В кн.: Биологические препараты и иммунологическая реактивность организма. Томск; 1981. С. 71-72.
6. Менявцева Т.А., Васильева О.А., Пилявская Е.А. Изучение in vitro сенсибилизирующей активности антирабического иммуноглобулина и его фракций. Журн. микробиол, эпидемиол. и им-мунобиол. 1979; 7:51-4.
7. Никифоров А.К., Генералов С.В., Волох О.А., Лобовикова О.А., АбрамоваЕ.Г., КиреевМ.Н. Применение нативного и иммобилизованного пепсина для получения Г(аЬ’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина. Биопрепараты. 2ш7; 2:20-1.
8. Никифоров А.К., Дятлов И.А., Волох О.А., Лобовикова
О.А., Киреев М.Н. Получение и анализ основных свойств препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина, состоящего из F(ab’)-фрагментов. Пробл. особо опасных инф. 2007; 2(94):75-8. 2
9. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2006 году: Государственный доклад. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Ро спотребнадзора; 2007. 360 с.
10. Руководство по иммунологии. Вязов О.Е., Ходжаев Ш.Х., редакторы. М.: Медицина; 1973. 387 с.
11. Степанова Л.А., Менявцева Т.А. Изучение анафилакто-генных свойств ферментированного антирабического иммуноглобулина методами ин виво и ин витро. Вирусные и бактерийные препараты. Томск; 1983; 31:85-9.
12. Степанова Л.А., Музафарова НХ. Сравнительная оценка некоторых свойств антирабического иммуноглобулина и сыворотки, очищенной методом ферментолиза. Вирусные и бактерийные препараты. Томск; 1981; 30:93-9.
13. SedlacekH.H., GronskiP., Hofstaetter T. et al. The biologi-
cal properties of immunoglobulin G and its split products [F(ab’). and Fab]. Klin. Wochenschr. 1983; 61:723-36. 2
14. WHO Expert Consultation on Rabies: first report. Geneva; 2004. 121 p.
Об авторах:
Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Савицкая Л.В., Галкина М.В., Минаева Л.Н., Михеева Т.А., Селезнёва А.Г., Жулидов И.М., Свинцов Р.А., Лазаренко Г.П., Брандзишевский Ю.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, Университетская, 46. Тел.: (845-2) 26-21-31. E-mail: [email protected]
S.V. Generalov, E.G.Abramova, A.K.Nikiforov, L.V.Savitskaya, M.V.Galkina, L.N.Minaeva, T.A.Mikheeva, A.G.Selezneva, I.M.Zhulidov, R.A.Svintsov, G.P.Lazarenko, Yu.V.Brandzishevskiy
Study of Anaphylactogenic Properties of F(ab’)2-Fragments of Heterologous anti-Rabies Immunoglobulin
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov
Anaphylactogenic properties of heterologous anti-rabies immunoglobulin and its F(ab’)2-fragments were tested in vivo. It was shown that F(ab’)2-fragments of heterologous anti-rabies immunoglobulin did not possess anaphylactogenic properties.
Key words: rabies, anti-rabies immunoglobulin, F(ab’)2-fragments, re-actogenicity, anaphylaxis.
Authors:
Generalov S.V., Abramova E.G., Nikiforov A.K., Savitskaya L.V., Galkina M.V., Minaeva L.N., Mikheeva T.A., Selezneva A.G., Zhulidov I.M., Svintsov R.A., Lazarenko G.P., Brandzishevskiy Yu.V. Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: [email protected]
Поступила 31.10.08.
