CC BY
65
УДК 619:616:579.841.93:807.7 Л.Н. Гордиенко
ПОЛУЧЕНИЕ L-ВАРИАНТОВ БРУЦЕЛЛ И ИХ МОРФОЛОГИЯ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ТРАНСФОРМАЦИИ
Показаны возможность и условия трансформации бруцелл в L-форму in vitro. Описана динамика изменений морфологических признаков L-вариантов в зависимости от дозы индуцирующего фактора. Ключевые слова: бруцеллы, морфология, трансформация, l-варианты, свойства.
L.N. Gordienko RECEPTION OF BRUCELLA L-VARIANTS AND THEIR MORPHOLOGY AT DIFFERENT TRANSFORMATION STAGES
Possibility and conditions of Brucella transformation into L-form in vitro are shown. Change dynamics of the L-variant morphology features which depend on the inducing factor dose is described.
Key words: Brucella, morphology, transformation, l-variants, features.
Открытие явления изменчивости микроорганизмов в начале XX столетия изменило сложившееся представление о закономерностях инфекционных и эпизоотических процессов при многих бактериальных заболеваниях. За этот период изучены факторы, способные вызвать трансформацию микроорганизмов in vitro [4, 7, 8] и in vivo [2, 6, 14], определены морфологические структуры многих патогенных бактерий [1, 3, 11 15] и предложена их классификация [10, 13]. Бруцеллы, как и другие виды микроорганизмов, подвержены воздействию индуцирующих факторов и способны трансформироваться в L-формы. Ряд исследователей считает, что именно измененные формы бруцелл играют роль в сохранении очагов инфекции и возникновении рецидивов в оздоровленных стадах [5, 9, 11].
Вместе с этим до настоящего времени среди ученых и практических специалистов не существует единого мнения об измененных формах бруцелл и многообразии их свойств.
Целью наших исследований являлась разработка способа получения L-форм бруцелл и изучить их свойства на разных стадиях трансформации.
Материалы и методы. Работу проводили в лаборатории экологии и идентификации L-форм бактерий ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии в соответствии с требованиями санитарных правил [12].
Для трансформации использовали штамм B.abortus 19^-форма). Трансформацию бруцелл проводили in vitro в условиях искусственных питательных сред, содержащих белковые компоненты (эритритол или нормальную лошадиную сыворотку). В качестве индуцирующего фактора был выбран бициллин-3. Концентрацию антибиотика рассчитывали на 1 мл питательной среды по методике, предложенной сотрудниками ВНИИМиЭ им. Н.Ф. Гамалеи. Посевы инкубировали в термостате при температуре плюс 37-380С.
Период появления роста культур, его энергию и характер оценивали визуально с описанием выросших колоний. Через каждые пять пересевов из нативной агаровой культуры готовили мазки и окрашивали их по методу Грама и Козловского. Морфологию и тинкториальные свойства изучали при помощи световых микроскопов (МБИ-6, Axioskop 40).
Результаты исследований. В результате исследований было отмечено, что при воздействии антибиотика в концентрации 5-10 ЕД/мл среды культуральные свойства бруцелл существенно не изменялись. При посеве 1 млрд взвеси L-клеток на скошенный агар рост отмечали через 3б-72 ч. Колонии были правильно контурированные, круглые, гомогенные, бесцветные с маслянистым оттенком, размером чаще всего от 1 до 3-4 мм. В полужидком агаре наблюдали наличие роста в виде голубовато-белого столбика шириной
0,5-1 см в верхней части среды. В бульоне отмечали помутнение и выпадение небольшого осадка. При длительном культивировании в жидкой среде наблюдали по периферии стекла кольцевидный рост сероватоголубого цвета, слегка поднимающийся над уровнем бульона.
При действии на бруцеллы пенициллина в концентрации 5-10ЕД/мл среды клетки сохраняли специфичность окраски по Граму и Козловскому. Как и типичные формы бруцелл, они окрашивались в розовый и красный цвет, клетки представляли собой в основном микрококки и слегка удлиненные овоиды размером от 0,3-0,4 до 0,5-0,8 мкм, беспорядочно расположенные в мазке. В таком состоянии бруцеллы полностью сохраняли агглютинабельные свойства исходного штамма, и только единичные культуры проявляли слабую положительную реакцию в растворе трипафлавина.
С постепенным повышением концентрации антибиотика в среде до 300-1000 ЕД/мл культивируе-
мые клетки заметно изменяли свои прежние свойства. Их рост замедлялся до 7-14 суток. Колонии становились более мелкими (до 1-2 мм), уплощенными, слегка матовыми. При посеве культур на полужидкую среду на ее поверхности появлялся слабый рост в виде серовато-голубого столбика. В бульоне образовывался осадок, который при встряхивании поднимался плотной косичкой или хлопьями. Пристеночного кольца, характерного для типичных S-форм бруцелл, не возникало. Клетки L-вариантов оставались грамотрицатель-ными, но утрачивали специфичность окраски по Козловскому: окрашивались в темно-коричневый и серовато-сиреневый цвет. При действии данной концентрации антибиотика культуры становились полиморфными: 40-50% клеток были еще мелкими, но округлившимися, а остальные увеличивали свои размеры до 0,81,0 мкм, и были похожи на кокки, расположенные беспорядочно. Культура становилась слизистой, крошко-ватой и не эмульгировалась в сыворотках и в физиологическом растворе. При посеве на элективные питательные среды в отсутствии индуцирующего фактора при одно- , двукратном пересеве культуры бруцелл реверсировали в исходную форму.
В процессе L-трансформации при воздействии пенициллина в дозах 5-20 тыс. ЕД/мл на 14-18 генерациях были получены L-варианты бруцелл типа сферопластов (Сп) с относительно стабильными свойствами. Полученные варианты заметно отличались от исходной культуры по энергии роста. Лишь на 14-20 сутки отмечался их слабый рост. Колонии становились плоскими, мелкими (размером менее 1 мм), со значительным матовым оттенком. На полужидкой среде образовывались серо-матовые полоски роста культуры разной конфигурации и размера. Эти L-варианты, отвитые на мясо-пептонный бульон, также не образовывали характерного для типичных бруцелл пристеночного кольца. При этом культура оставалась полиморфной, в ней преобладали шаровидные клетки диаметром до 1,0-1,2 мкм и более. Крупные сферопласты (2-4 мкм) были деформированы и неравномерно окрашивались, но оставались грамотрицательыми. До 10% от общего количества составляли мелкие округлившиеся клетки, по размерам близкие к типичным бруцеллам (0,81 мкм), но имеющие темно-красную или коричневую окраску.
Более продолжительное воздействие индуцирующего фактора вызывало прекращение синтеза клеточной стенки, вследствие чего размер клетки увеличивался до 8,0-10,0 мкм и она приобретала неравномерную окраску различной плотности. Форма клеток становилась сферической или эллипсоидной. В поле зрения светового микроскопа популяция L-форм состояла из гигантских клеток (до 80-90%) и мелких частиц округлой формы интенсивной плотности окраски. По Граму клетки окрашивались в фиолетовый или темносиний цвет, по Козловскому - в темно-коричневый цвет.
В таком состоянии L-культура при определенных условиях культивирования сохраняла приобретенные признаки в течение длительного времени (более 10 лет).
Родовую принадлежность измененных форм бруцелл определяли путем многократных пересевов на элективных питательных средах при отсутствии индуцирующего фактора, методом 2-3-кратных пассажей через организм лабораторных животных или в полимеразной цепной реакции (ПЦр).
Полученные научные данные о морфологических свойствах L-вариантов бруцелл на разных стадиях трансформации были использованы в дальнейшем при совершенствовании методов диагностики бруцеллёза. Это позволило в производственных условиях повысить диагностическую эффективность и выявить дополнительно до 20-30% животных с хроническим течением или латентными формами бруцеллеза, инфицированных измененными формами возбудителя.
Заключение
Необходимо отметить, что на модели бруцелл возможно воспроизвести процесс L-трансформации in vitro. Степень утраты клеточной стенки и фенотипических изменений микробных клеток зависит от концентрации антибиотика в питательной среде и продолжительности его воздействия.
На всех стадиях трансформации популяции культур бруцеллы отличаются полиморфизмом, изменением тинкториальных свойств и морфологических признаков.
Литература
1. Базиков И.А., Бондаренко А.Н. Ультраструктурная организация L-форм бруцелл и культур ре-вертантов // ЖМЭИ. - 1991. - №1. - С.17-20.
2. Гордиенко Л.Н. Персистенция типичных и измененных форм бруцелл у северных оленей в очагах инфекции // Междунар. вестн. ветеринарии. - СПб., 2008. - №4. - С.10-14.
3. Ищанова Р.Ж. Свойства L-форм бруцелл // Ветеринария. - 1986. - №9. - С. 30-32.
4. Клочков А.А. Получение слабовирулентного штамма бруцелл под воздействием ультрафиолетовых лучей // Ветеринария. - 1964. - №2. - С.36-40.
5. Косилов И.А. Изменчивость бруцелл и ее значение в проблеме бруцеллеза сельскохозяйственных животных: автореф. дис. ... д-ра вет. наук. - Фрунзе, 1975. - 40 с.
6. Кошкин Е.Н. Изменчивость бруцелл в организме свинок // Инфекционные и незаразные болезни сельскохозяйственных животных в Казахстане. - Алма-Ата, 1993. - С.63-67.
7. Красота Л.П. Влияние бактериофага и иммунных сывороток на культуры бруцелл // Сб. тр. Ле-нингр. ин-та. - 1973. - Вып.34. - С.84 - 93.
8. Островская Н.Н. Изменчивость бруцелл под влиянием бактериофага и перспектива новых вакцинных штаммов // Изменчивость микроорганизмов и бактериофагия. - М., 1960. - С. 43-58.
9. Пинигин А.Ф., Петухова О.С., Репина Л.П. Изменчивость бруцелл и ее значение в эпизоотологии бруцеллеза // Состояние и перспективы научных исследований по диагностике, профилактике туберкулеза и бруцеллеза и меры борьбы с этими болезнями сельскохозяйственных животных. - Омск, 1980. - С.70-71.
10. Прозоровский С.В., Л.Н. Кац, Каган Г.Я. L-формы бактерий. - М.: Медицина, 1981. - 239с.
11. Ременцова М.М., Семенцова В.М., Нифантьев В.М. Значение L-форм бруцелл в эпизоотическом процессе // Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация мед.помощи больным: тез. докл. Всесоюз. конф. (24-25 окт.1989 г., Новосибирск). - М., 1989. - С.93-94.
12. Санитарные правила СП 1.2.011-94. Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности. - М., 1994. - 152 с.
13. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. - Л.:Колос, 1976. - 280 с.
14. Цибин Б.П., Таран И.Ф. Получение L-форм бруцелл и изучение их приживаемости в организме белых мышей: тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. по бруцеллезу // Минздрав СССР. - М, 1978. - С.38-40.
15. Шувалов Л.П. Своства L-культуры бруцелл // Ветеринария. - 1986. - №9. - С. 30-32.
УДК 591.442:636.3 В.Ю. Чумаков, Р.Э. Красовская, П.П. Пазюк
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛИМФАТИЧЕСКОГО РУСЛА СЕРОЗНОЙ ОБОЛОЧКИ ТОЩЕЙ И ПОДВЗДОШНОЙ КИШОК СОБАК НА НЕКОТОРЫХ ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
В статье рассмотрены особенности морфологии и топографии лимфатических сосудов серозной оболочки тощей и подвздошной кишок на некоторых этапах постнатального онтогенеза.
Установлено, что самые крупные лимфатические посткапилляры были обнаружены в стенке подвздошной кишки взрослых собак, мельчайшие посткапилляры найдены в ворсинках тощей кишки новорожденных щенков. Лимфатические сосуды I, II, III порядка положительно коррелируют в возрастном аспекте.
Ключевые слова: лимфатическая система, лимфатические сосуды, лимфатические узлы, лимфатическое русло, лимфангион, онтогенез, капсула, строма.
V.Yu. Chumakov, R.E. Krasovskaya, P.P. Pazyuk
MORPHOMETRIC PECULIARITIES OF THE SEROUS MEMBRANE LYMPHATIC CHANNEL OF DOG EMPTY AND TWISTED INTESTINE IN SOME STAGES OF POSTNATAL ONTOGENESIS
The peculiarities of morphology and topography of the serous membrane limphatic vessels of empty and twisted intestines in some stages of postnatal ontogenesis are considered in the article.
It is determined that the biggest lymphatic postcapillaria were found in paries of the full-mouthed dog twisted intestine, the smallest one were found in the empty intestine villi of the puppies. The I., II., III. number lymphatic vessels correlate well in the age aspect.
Key words: lymphatic system, lymphatic vessels, lymphatic nodes, lymphatic channel, lymphangion, ontogenesis, capsule,stroma.
Введение
Современные представления о строении различных иммунных структур организма и в частности лимфатической системы, помогут разработать более эффективную профилактику и лечение аллергических и инфекционных заболеваний животных и человека, а также локальных воспалительных процессов слизистых оболочек [3].
