CC BY
44
УДК 581.143.6:576.5+663.1
ОДЕРЖАННЯ КУЛЬТУРИ ТКАНИН СИНЯКА ПОДОРОЖНИКОВОГО (Echium plantagineum L.) — ПРОДУЦЕНТА ШИКОНІНОВИХ ПІГМЕНТІВ
¡¡ороннік О. О.
Шаблій В. А. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ
Кунах В. А. E-mail: oksana_poronnik@ukr.net
Одержано культуру тканин E. plantagineum із корінців насіннєвих проростків на агаризованому живильному середовищі 5С01. Культивування на живильному середовищі LS-м ініціювало біосинтез червоних шиконіно-вих пігментів. Відселектовано варіант калюсної культури (3Ер), що накопичує 2,11% похідних шиконіну від сухої біомаси, вихід якої на 14-ту добу росту становить16 г/л живильного середовища. Методами тонкошарової хроматографії (на пластинках Sorbfill УФ 254) та хроматографії на колонці (Silica gel 60) досліджено спектр ши-конінових похідних у процесі становлення культури. Встановлено, що органогенна культура на перших етапах культивування на живильному середовищі LS-м разом із червоними фракціями шиконінових пігментів синтезувала й сині. Проте через 1,5 року культивування клітини калюсу синяка синтезували тільки червоні фракції шиконінових пігментів.
Ключові слова: Echium plantagineum L., культура тканин рослин, червоні пігменти, похідні шиконіну, клітинні лінії — продуценти біологічно активних речовин.
Синяк подорожниковий — Echium plan-tagineum Ь. ( E. licopsis Ь.) належить до родини Boraginaceae, представники якої здавна привертають увагу як лікарські, барвні, алкалоїдовмісні, глікозидовмісні, вітамінні, ефіроолійні, кормові, харчові та декоративні рослини [1].
E. plantagineum — трав’яниста рослина-дворічник, 20-60 см заввишки. Зростає переважно в Криму, на Кавказі та Західному Закавказзі. Підземна частина рослини містить від 0,17 до 0,35% червоного пігменту шиконіну [2]. Шиконін та його похідні здавна використовували на Сході як найцінніший червоний барвник (технічний, харчовий, косметичний), що виявляє й лікарські властивості [3, 4]. Рослинні пігменти фенольного походження нетоксичні та перспективні для використання їх як дефіцитних природних харчових червоних барвників, оскільки застосовувані наразі антоціани є нестійкими. Синтетичні ж сполуки визнано шкідливими [5].
Природна рослинна сировина для одержання нафтохінонових пігментів у промислових масштабах в Україні відсутня. Ши-конін японського виробництва, що його одержують із культури тканин горобинника червонокореневого, є досить дорогим. Ціна його на світовому ринку сягає 4 500 дол. США за 1 кг.
Нами запропоновано культуру тканин E. plantagineum як джерело сировини для отримання червоних шиконінових пігментів. Перспективним є розроблення промислової біотехнології одержання шиконінових похідних.
Матеріали і методи
Насіння. Для проведення досліджень використано насіння E. plantagineum урожаю 2003 р., отриманого з колекції Національного ботанічного саду ім. М. М. Гришка НАН України (м. Київ).
Знезаражування. Знезаражування насіння проводили за допомогою хлоровмісної рідини «Купава» та етилового спирту за такою методикою: насіння заливали 25% -м розчином «Купави» з додаванням поверхнево-активної речовини TWEEN (0,2 мл на 100 мл) для кращого змочування насіння. Знезаражування тривало 20 хв за постійного перемішування. Насіння тричі відмивали стерильною дистильованою водою і переносили в 96%-й С2Н5ОН на 2 хв, після чого ще двічі відмивали дистилятом. Далі в стерильних умовах насіння переносили в маленькі пробірки з живильним середовищем (по одній насінині) для проростання.
Культивування. Культуру тканин отримували з насіннєвих проростків на агаризо-
ваному живильному середовищі з мінеральною основою, розробленою А. Г. Волосови-чем зі співавторами (1979). Склад використаного варіанта середовища 5С01 див. [6 ].
Біосинтез шиконінових пігментів ініціювали на модифікованому середовищі Лінсмайєр-Скуга (LS-м) [7].
Пророщували насіння та ініціювали ка-люсоутворення у пробірках об’ємом 30 мл, що містили 5 мл агаризованого живильного середовища. Отриману культуру тканин E. plantagineum вирощували в плоскодонних колбах об’ємом 100 мл, що містили 25 мл середовища, при температурі 25-27 0С без освітлення за відносної вологості повітря 70-80%.
Усі матеріали і складові живильних середовищ були вітчизняного виробництва.
Первинний добір культури на підвищення продуктивності за шиконіном. Невеликі частинки калюсу занурювали у рідкий парафін «Парекс». Через декілька хвилин відбувалась екстракція червоних пігментів. Перевагу надавали варіантам калюсу, що давали найяскравіше забарвлення парафінового екстракту [8].
Матеріали та обладнання для біохімічних досліджень. Для рідинної хроматографії використовували Silica gel 60 (Merck, Німеччина), пластинки для тонкошарової хроматографії Silufoll (Czechlab, Чехія) та Sorbfill (Росія), А12О3 (Czechlab, Чехія). Хроматографію проводили на хроматографі LKB Bromma (8300 Uvicord II, Чехія). Для спектрофотометричного аналізу застосовували спектрофотометр Specord UV VIS (Carl Zeiss Jena), кількісний вміст шиконіну визначали на фотоелектро-калориметрі Фотометр КФК-3. Решта реактивів —вітчизняного виробництва.
Методи біохімічних досліджень
Екстракція. Висушену до повітряно-сухого стану при температурі 40 0С і подрібнену біомасу вичерпно екстрагували етанолом в апараті Сокслета, екстракт упарювали в ротаційному випарювачі. Залишок заливали етанолом при температурі 50-70 0С. Ресуспендували і змивали розчинником ши-коніновий осад зі стінок колби. Готували 2-3% -й етанольний розчин Cu(OAc)2 або CuCO3 і додавали його до розчину шиконіно-вих похідних, прогрівали 3 хв при температурі 50-60 0С. Фільтрували розчин на скляному фільтрі під водострумним насосом. Фільтрат промивали етанолом, ацетоном, гексаном. Темно-фіолетовий осад висушували і обробляли розведеною HCl (5-10%).
Промивали дистильованою водою і елююва-ли похідні шиконіну гексаном в іншу колбу Бунзена.
Кількісний аналіз шиконінових пігментів. Оцінюючи кількісний вміст шиконіну та його ефірів у екстрактах калюсів, використовували фотоелектроколориметричний метод аналізу. Для досягнення цієї мети ми отримали калібрувальну криву, побудовану за наважками очищених нафтохінонів. Оптичну густину вимірювали при довжині хвилі X = 526 нм (log e526=3,87) в етанолі [7].
Адсорбційна хроматографія на силікагелі. Колонки розміром 1,5x7,0 набивали Silica gel 60 у хлороформі, зрівноважували системою розчинників гексан — етилацетат (50:1) до повної стабілізації базової лінії. Зразок сухої тканини масою 400 мкг наносили на колонку в гексані й елюювали в ступінчастому градієнті системи розчинників гексан — етилацетат у співвідношеннях: 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:1. Отримували сім фракцій, які аналізували методом тонкошарової хроматографії. Фракції І і ІІ мали жовте забарвлення (жовті пігменти), відповідно фракції ІІІ, IV і V — червоне забарвлення (червоні пігменти), останні дві фракції — синє забарвлення (сині пігменти).
Було розроблено умови швидкого виділення фракцій синіх пігментів. До етаноль-ного екстракту культури тканин додавали 2-3% етанольного розчину Cu(OAc)2, прогрівали 3 хв при температурі 50-60 0С до повного осадження червоних пігментів, після чого наносили екстракт на колонку розміром 1,5x7,0 (Silica gel 60). Елюцію проводили ступінчасто системами бензол — етилацетат — оцтова кислота у співвідношеннях 3:1:0,1 і 3:1:0,2. Отримали дві фракції: перша — розчин комплексу солей міді з червоними пігментами, друга — із синіми пігментами.
Тонкошарову хроматографію (ТШХ) здійснювали на пластинках Sorbfill УФ 254 у системі розчинників гексан - етилацетат -оцтова кислота, 100:15:1 [9].
Гідроліз шиконінових похідних. Гекса-новий розчин шиконінових похідних змішували з 0,1 н. NaOH, ресуспендували. Пігменти кількісно переходили з гексану в луг, забарвлюючи його в інтенсивно-блакитний колір. NaOH нейтралізували 0,1 н. НСІ і екстрагували похідні шиконіну петролейним ефіром у ділильній воронці.
Спектральний аналіз. Кожну фракцію, яку в чистому вигляді було виділено із колонки, висушували у роторному випарю-вачі, перерозчиняли у рівних об’ємах етанолу і вносили до вимірювального приладу.
Аналіз проводили у двох режимах: перший — при ультрафіолетовому освітленні (200-300 нм), другий — у видимій частині спектра (300-700 нм).
Статистична обробка. Застосовували загальноприйнятий метод варіаційної статистики [10]. Обчислення критерію Стьюдента виконували на ПК за допомогою програми Origin.
Результати та обговорення
Одержання первинних калюсів. Первинні калюси одержали з корінців насіннєвих проростків синяка подорожникового на середовищі 5С01, яке розроблено для рослинних культур тканин-суперпродуцентів [6].
Перші проростки синяка з’явились через місяць після перенесення на живильне середовище. З 35 насінин утворилося 6 проростків. Проростки довжиною 2-3 см, що перебували на живильному середовищі того самого складу і торкались поверхні середовища, протягом 1-2 днів утворили калюс (варіанти 1Ер, 2Ер, 3Ер, 4Ер та 6Ер). Одна з насінин дала карликову рослинку розміром 3 мм, яка на середовищі 5С01 упродовж тривалого часу не росла і не розвивалась. І тільки через два місяці утворився первинний калюс (варіант 5Ер). Первинні калюси, утворені з проростків різних насінин синяка, на початку культивування були ідентичними. Вони складались із світло-коричневих клітинних агрегатів розміром 2-3 мм (рис. 1, а). Однак через три пасажі варіант 1Ер загинув.
Через чотири місяці культивування первинний калюс було перенесено на живильне середовище LS-м, розроблене для рослинних культур тканин, що продукують шиконін [7] (рис. 1, б). Адаптація всіх варіантів куль-
тури пройшла відмінно. Культура активно росла, спостерігали також окремі червоно забарвлені мікроділянки калюсу. Калюс був відносно щільним, складався з клітинних агрегатів (глобул) розміром 1-3 мм.
Протягом другого пасажу на середовищі LS-м спостерігали масове утворення дрібних ниткоподібних корінців. Поверхневий шар цих корінців наприкінці пасажу синтезував невелику кількість шикопіпу, про що свідчило червопе забарвлення. Калюс при цьому також набув бурого забарвлення (рис. 1, в). Утворення корінців можна пояснити дією індолілоцтової кислоти (ЮК), що входить до складу середовища LS-м. Відомо, що невисока концентрація ЮК (0,28-0,3 мг/л) спричинює ризогенез [11]. У цей період нами проведено первинний добір культури на підвищений вміст шиконіну за допомогою рідкого парафіну [8]. Як пайперспективпіший за вмістом шиконіну й інтенсивністю росту визначено варіант калюсу 3Eр, який утворював найменше корінців (рис. 2).
Отримані з різних насінин калюсні тканини синяка мали значні фенотипні відмінності (табл. 1). Порівняльні дані з продуктив-пості за похідними шикопіпу подано в табл. 2. Через 20 пасажів варіант 5Eр загипув.
Відселектовапий калюс культури E. plantagineum 3Eр накопичує 2,11% шикопіпу па суху масу, маючи приріст біомаси 16 г/л за тривалості пасажу 14 діб. Саме цей варіант отриманої калюсної культури тканин синяка використаний нами в подальшому для вирощування у вигляді суспензії, що є проміжним етапом у створенні біотехнології одержання червоних пігментів.
Біохімія вторинних метаболітів. Під час становлення культури тканин рослини
б
Рис. 1. Первинний калюс культури тканин синяка подорожникового Echium plantagineum:
а — перетворення насіннєвого корінця на калюс (живильне середовище 5С01); б — 3-й пасаж калюсу на живильному середовищі LS-м; в— 5-й пасаж: клітини калюсу починають синтезувати пігменти (стрілкою позначено червоний корінець)
б
Рис. 2. Селекція на підвищений вміст шиконінових пігментів калюсу культури ЕсШит plantagineum Ь. на живильному середовищі ЬЯ-м: а, б, в — різні етапи селекції
Таблиця 1. Фенотипні відмінності варіантів калюсу Echium plantagineum, отриманих з різних насінин
Таблиця 2. Вміст шиконінових ефірів,
% від сухої маси
Варіант калюсу E. plan-tagineum Характеристика агрегатів тканини
Розмір Структу- ра Забарв- лення Інтен- сивність росту
2Ер До 2 см Щільна Поверхня частково червоно-бура, у розрізі — світло-жовта Інтен- сивний
3Ер До 3 мм Се- редньої щіль- ності Яскраво- червоне Інтен- сивний
4Ер До 6 мм Щільна Буро-чер- воне Повіль- ний
5Ер До 1 см Середньої щіль- ності Червоно- бурувате Се- редній
6Ер Н,' В До 5 мм Пухка Світле Інтен- сивний
Па- саж № Варіант калюсу Echium plantagineum
2Ер 3Ер 4Ер 5Ер 6Ер
5 Сліди 0,38± 0,019 Сліди Сліди Сліди
13 0,36± 0,018 0,94± 0,047 0,39± 0,019 0,95± 0,047 Сліди
17 0,30± 0,015 1,25± 0,062 0,27± 0,013 1,00± 0,050 Сліди
19 0,29± 0,014 1,24± 0,062 0,85± 0,042 0,52± 0,026 Сліди
20 0,64± 0,032 1,18± 0,059 0,46± 0,023 0,59± 0,029 0,33± 0,016
22 0,40± 0,020 1,22± 0,061 0,51± 0,025 - 0,20± 0,010
E. plantagineum у процесі її пасажування на живильному середовищі LS-м спостерігали мінливість кількісного і якісного складу ефірів шиконіну. Так, протягом перших пасажів одразу після перенесення калюсу з живильного середовища 5С01 на LS-м калюс формував багато червоноколірних корінців. Кірковий шар корінців синтезував шиконін та його похідні. Сам калюс також почав синтезувати шиконінові пігменти (рис. 3).
Однак якісний склад етанольних екстрактів калюсу і утворених корінців відрізнявся. На тонкошарових хроматограмах в екстрактах, виділених із корінців, спостерігали лише фракцію червоних пігментів, тимчасом як у калюсі поряд із червоними були також і сині пігменти (рис. 4). Такий умовний розподіл шиконінових ефірів було зроблено на основі кольору плям на тонкошаровій хроматограмі. Синтез клітинами первинного калюсу E. plantagineum синіх
а
1 2
Рис. 3. Тонкошарова хроматографія складу шиконінових похідних у різних частинах первинного калюсу:
1 — етанольний екстракт калюсу E. plantagineum;
2 — етанольний екстракт корінців.
Стрілками позначено:
» >• червоні пігменти;
----► сині пігменти
пігментів, не характерних для культур — продуцентів червоних шиконінових пігментів, можна пояснити стресовими умовами, в яких перебувають клітини рослини під час калюсоутворення. При цьому змінюється реалізація генетичної інформації (активуються репресовані або сплячі гени, діють гени-модифікатори), припиняється синтез одних і починається утворення інших речовин вторинного синтезу. Проте з часом відбувається пристосування рослинних клітин (калюсу) до нових умов існування і може мати місце зворотний процес, коли нетипові для цієї рослини речовини, раніше чи пізніше, припиняють синтезуватись і в ка-люсі [12].
Після гідролізу етанольного екстракту біомаси синяка в 0,1 н. КОН з наступним хроматографічним аналізом методом тонкошарової хроматографії на силікагелі (див. розділ Матеріали і методи) було виявлено одну речовину червоного забарвлення (рис. 5). Методом спектрального аналізу в ультрафіолетовій та видимій частинах спектра було встановлено максимуми поглинання, а саме 275 нм, 490 нм, 520 нм
» >
0
1 2
Рис. 4. Тонкошарова хроматографія етанольного екстракту калюсу культури E. plantagineum:
1 — етанольний екстракт;
2 — етанольний екстракт після проведення гідролі зу 0,1 н. розчином КОН
~ІГ О © ^ О
1 2 3 4 5
Рис. 5. Тонкошарова хроматографія етанольних екстрактів різних пасажів варіанту 3 Ер калюсної культури Е. plantagineum:
1 — 3 Ер/7; 2 — 3 Ер/10;
3 — 3 Ер/13; 4 — 3 Ер/15;
5 — 3 Ер/17
і 556 нм, які відповідають шиконінам [13]. Тому нами зроблено висновок, що червоні та сині пігменти є похідними шиконіну.
У процесі подальшого пасажування і проведення селекції калюсів, спрямованої на відбір зразків, в яких ризогенез був відсутній, кількість синіх пігментів у етанольно-му екстракті калюсів знижувалась на фоні стабільного загального вмісту шиконінових похідних (рис. 6).
<*
т -
1 2
Рис. 6. Тонкошарова хроматографія одержаної фракції синіх пігментів:
1 — етанольний екстракт калюсу E. plantagineum;
2 — очищена фракція синіх пігментів.
Стрілками позначено:
» >• червоні пігменти;
----сині пігменти
Нами було виділено окремо фракцію синіх пігментів з етанольного екстракту методом титрування CuAc2, який з шиконіна-ми утворює нерозчинний осад в органічних розчинниках [7], і подальшим хроматогра-фуванням на колонці (Silica gel 60). Порівняння етанольного екстракту калюсу E. plantagineum та очищеної фракції синіх пігментів на тонкошаровій хроматограмі наведено на рис. 7.
Було підібрано також умови для розділення пігментів на колонці Silica gel 60 без попереднього осадження у вигляді нерозчинного комплексу (див. розділ Матеріали і методи). Попередній метод розділення є досить зручним і швидким, оскільки базується на двостадійній елюції, однак він, на відміну від останнього, не забезпечує розділення інших ефірів шиконіну .
Окрім шиконінових ефірів культура тканин синяка синтезувала два пігменти жовтого кольору, які було виділено методом ад-
1 2 3
Рис. 7. Тонкошарова хроматографія бензехінофуранів калюсної культури тканин E. plantagineum:
1 — сумарний склад бензехінофуранів;
2, 3 — очищені методом адсорбційної хроматографії на силікагелі фракції бензехінофуранів
сорбційної хроматографії на колонці Silica gel 60 (рис. 4) і проаналізовано методом спектрального аналізу в ультрафіолетовій та видимій частинах спектра. Максимуми поглинання відповідають бензехінофуранам, а саме: 265 нм, 270 нм, 282 нм та з2о нм [13].
Порівняння якісного складу цих пігментів у різних варіантах калюсної культури на пізніших етапах культивування показало, що спектр барвників стає стабільним, тим-часом як кількість шиконінових пігментів може варіювати.
Таким чином, у культуру in vitro введено синяк подорожниковий E. plantagineum L. Первинні калюси отримали з корінців насіннєвих проростків на середовищі 5С01, створеному для рослинних культур тканин-суперпродуцентів. Одержані калюсні тканини адаптовано до середовища LS-м, розробленого для синтезу шиконінових похідних.
Визначено якісний склад пігментів, що синтезують клітини отриманих калюсів. З’ясовано, що на перших етапах становлення культури тканин E. plantagineum клітини разом із червоними синтезують сині пігменти, які також належать до похідних ши-коніну. Однак через 1,5 року культивування в культурі виявлено тільки червоні пігменти. Це явище можна пояснити процесами адаптації клітин рослини E. plantagineum до
умов in vitro. Спостерігали також утворення невеликої кількості жовтих пігментів із класу бензехінофуранів. На пізніх стадіях становлення різні варіанти калюсу мали відмінності тільки в кількості червоних пігментів, якісний склад був подібним.
Методом добору дрібних клітинних агрегатів проведено початкову селекцію на підвищену продуктивність за похідними шиконіну. Відібрано найбільш перспективний за показниками продуктивності варіант культури тканин (клітинна лінія E. plan-tagineum 3Ер).
Відселектована клітинна лінія синяка 3Ер накопичує 2,11% похідних шиконіну у
сухій масі, маючи приріст біомаси 16 г/л за тривалості пасажу 14 діб. Цей варіант калю-су використано нами в подальшому для вирощування синяка у вигляді суспензійної культури, що є проміжним етапом у створенні біотехнології одержання червоних нафтохінонових пігментів.
Особлива подяка співробітникам відділу квітникарства Національного ботанічного саду ім. М. М. Гришка НАН України С. Машковській та Р. Іваннікову за надане для роботи насіння синяка подорожникового Е. plantagineum L.
^ЛІТЕРАТУРА
1. Доброчаева Д. Н. Бурачникоцветные (Boraginales Hutch.) Европейской части СССР: Дис. ... докт. биол. наук: 03.00.12 — К., 1977. — С. 269-290.
2. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Caprifoliaceae — Plantagi-naceae / Под ред. П. Д. Соколова. — Л.: Наука, 1990. — С. 109-133.
3. Papageorgiou V. P., Assimopoulou A. N., Coula-douros E. A. et al. The Chemistry and Biology of Alkannin, Shikonin, and Related Naphthazarin Natural Products //Angew. Chem. Int. Ed. — 1999. — V. 38. — P. 270-300.
4. Pietrosiuk A., Syklowska-Baranek K., Wiedenfeld H. et al. The shikonin derivatives and pyrrolizidine alkaloids in hairy root cultures of Lithospermum canescens (Michx.) Lehm. // Plant Cell Rep. — 2006. — V. 25. — P. 1052-1058.
5. Барабой В. А. Растительные фенолы и здоровье человека. — М: Наука, 1984. — 160 с.
6. Кунах В. А, Можилевская Л. П., Потап-чук Е. А. и др. Получение культуры тканей Ungernia Victoris и её особенности при выращивании на питательных средах различного состава // Биотехнология. — 2007. — № 1. — С. 14-21.
7. Давыденков В. Н., Патудин А. В., Попов Ю. Г. и др. Культура клеток Arnebia euchroma (Royle) Jonst — новый источник получения шиконина // Хим.-фарм. журн. — 1991. — № 1. — С. 53-55.
8. Zakhlenjuk O.V., Kunakh VA. Arnebia euchroma: In vitro culture and the production of shikonin and other secondary metabolites // Biotechnology in agriculture and forestry. — V. 41. — Berlin; Heidelberg: Springer-Verl., 1998. — P. 28-44.
9. Федореев С. А., Денисенко В. А., Булгаков В. П. Исследование химического состава хиноидных пигментов из клеточной культуры ВК-39 Lithospermum erythrorhi-zon // Хим.-фарм. журн. — 1993. — №1. — С. 33-37.
10. Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики. — М.: Финансы и статистика, 1982. — 344 с.
11. Голубенко А. В. Морфогенез та особливості вегетативного розмноження видів роду Gentiana L. in vitro: Автореф. дис. ... канд. біол. наук.: 03.00.12. — К., 2005. — С. 17.
12. Кунах В. А Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. — К.: Логос, 2005. — 730 с.
13. Bang Y. H., Jai S. R. Monoamine Oxidase Ingibitory Nahptoquinones from the Roots of Lihtospermum erythrorhizon // Arch. Pharm. Res. — 2005. — V. 28, N 4. — P. 400-404.
ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ СИНЯКА ПОДОРОЖНИКОВОГО
(Echium plantagineum L.) — ПРОДУЦЕНТА ШИКОНИНОВЫХ ПИГМЕНТОВ
О. А. Поронник В. А Шаблий В. А. Кунах
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев
E-mail: oksana_poronnik@ukr.net
Получена культура тканей E. plantagineum из корешков семенных проростков на агаризо-ванной питательной среде 5С01. Культивирование на питательной среде LS-м инициировало биосинтез красных шикониновых пигментов. Отселектирован вариант каллюсной культуры (ЗЕр), накапливающий 2,11% производных шиконина от сухой биомассы, выход которой на 14-е сутки роста составляет 16 г/л питательной среды. Методами тонкослойной хроматографии (на пластинках Sorbfill УФ 254) и хроматографии на колонке (Silica gel 60) исследован спектр шикониновых производных в процессе становления культуры. Установлено, что органогенная культура на первых етапах культивирования на питательной среде LS-м наряду с красными фракциями шикониновых пигментов синтезировала и синие. Однако через 1,5 года культивирования клетки каллуса синяка синтезировали только красные фракции шикониновых пигментов.
Ключевые слова: Echium plantagineum L., культура тканей растений, красные пигменты, производные шиконина, клеточные линии — продуценты биологически активных веществ.
GENERATION OF Echium plantagineum L. TISSUE CULTURE WHICH IS PRODUCENT OF SHIKONIN PIGMENTS
О. О. PoronniK V. А. Shablij V. А. Kunakh
Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: oksana_poronnik@ukr.net
E.plantagineum tissue culture has been generated from the roots of seed shoots on 5C01 agarized nutrient medium. Cultivation on the LS-m nutrient medium induced biosynthesis of the red shikonin pigments. Variant of callus tissue (3Ep), accumulating 2.11% of shikonin derivatives per dry biomass whose yield on the 14th day of growth constituted up to 16 mg/L of nutrient medium was selected. Through the thin layer chromatography (in Sorbfill UV 254 plates) and column chromatography (Silica gel 60) there was evaluated the spectrum of shikonin derivatives in the course of culture establishment. Organogenic culture at the first steps of culturing on the LS-m nutrient medium was found to synthesize alongside with red fractions of shikonin pigmentes the blue ones as well. But after 1,5 year of cultivation Echium callus cells synthesized exclusively red fractions of shikonin pigments.
Key words: Echium plantagineum L., plant tissue culture, red pigments, shikonin derivatives, cell lines, producents of biologically active substances.
