Получение компонентов тест-системы на основе конкурентного иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу бешенства

Варвара Андреевна Лобанова; Валентина Ивановна Клюкина

Ветеринарный врач. 2022 . № 2 . С. 29-39. The veterinarian. 2022; (2):29-39. Научная статья

УДК 578.824.11; 57.083.224, 57.083.24, 57.083; 57.088.3; 578.74 DOI 10.33632/1998-698Х.2022_29_39

Получение компонентов тест-системы на основе конкурентного иммуноферментного анализа

для выявления антител к вирусу бешенства

Варвара Андреевна Лобанова 12, Валентина Ивановна Клюкина 1

1 Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Московская область, г. Россия, varvara.ustinova1995@gmail.com

2 Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, г. Москва, Россия, klyukinavi@yandex.ru

Автор, ответственный за переписку: Варвара Андреевна Лобанова, varvara.ustinova1995@gmail.com

Аннотация. Бешенство - особо опасная нейротропная инфекция животных и человека, основным направлением борьбы с которой является вакцинация домашних и диких плотоядных. Актуальной задачей остается совершенствование методов выявления антител к вирусу бешенства (ВБ) в сыворотке крови животных для контроля напряжённости поствакцинального иммунитета. Цель работы - разработать технологии получения компонентов тест-системы для выявления антител к ВБ на основе конкурентного ИФА. Выделение и очистку культурального ВБ штамма «Щелково-51» осуществляли по собственной методике, включающей УЗ-обработку зараженной ВБ культуры клеток (КК) ВНК-21; осаждение и концентрирование ВБ ультрацентрифугированием; очистку гель-хроматографией через сефадекс G-200. Антирабическую сыворотку получали иммунизацией собак очищенным культуральным ВБ с масляным адъювантом «Montanid ISA 201 VG» (Seppic). Антирабические антитела получали иммунизацией кроликов очищенным культуральным ВБ с масляным адъювантом «Montanid ISA 201 VG» с иммуностимулятором «Иммунофан» (Бионокс). Выделение IgG проводили по модифицированной методике Levy N. B. et al. Антитела биотинилировали N-гидроксисукцинимидовым эфиром биотинамидогексановой кислоты по методике, описанной в Immunochemical protocols, 2005. Получен концентрированный чистый ВБ с содержанием белка не менее 1 мг/мл и антигенной активностью 1:128 в РДП, 1:320 в РСК и 1:4000 в непрямом ИФА. Концентрация антирабических антител в сыворотке крови иммунизированных собак в РН на КК составила 5,5±0,26 МЕ/мл. При иммунизации кроликов получена сыворотка с активностью в непрямом ИФА 1:3200. Из сыворотки получен препарат антирабических IgG с титрами 1:128 в РДП, 1:160 в РСК, 1:12800 в непрямом ИФА. Степень биотинилирования антител составила 5,2±0,34 молекул биотина на 1 молекулу антитела. Таким образом, разработаны технологии получения очищенного культурального ВБ, антирабической сыворотки крови собак, а также биотинилированных антирабических кроличьих антител для конструирования тест-системы на основе конкурентного ИФА.

Ключевые слова: вирус бешенства, штамм «Щелково-51», выделение и очистка вируса, ультрацентрифугирование, disc-электрофорез, иммунизация, биотинилирование антител, иммуноферментный анализ

Obtaining components of a test system based on a competitive elisa for the detection of antibodies to the rabies virus

Varvara A. Lobanova 1,2, Valentina I. Klyukina 1

1 All-Russian Research and Technological Institute of Biological Industry, Moscow Region, Russia, varvara.ustinova1995@gmail.com

2 Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural AcademyMoscow, Russia, klyukinavi@yandex.ru

Corresponding author: Varvara A. Lobanova, varvara.ustinova1995@gmail.com

Abstract. The main direction of preventing rabies is the vaccination of carnivores. Improving the methods for detecting antibodies to the rabies virus (RABV) in the animal serum to control the intensity of post-vaccination immunity remains an urgent task. The work aims to develop technologies for obtaining components of competitive ELISA for RABV antibody detection. Isolation and purification of the cultural RABV strain "Schelkovo-51" were carried out according to our method, including ultrasonic treatment of the cell culture (CC) BHK-21 infected with RABV; precipitation and concentration of RABV by ultracentrifugation; purification by gel chromatography. Rabies serum was obtained by immunizing dogs with cultural RABV with oil adjuvant "Montanid ISA 201 VG" (Seppic). Anti-rabies antibodies were obtained by immunization rabbits with cultural RABV with adjuvant and immunostimulant "Immunofan" (Bionox). The IgG isolation was prepared according to the modified method by Levy N.B. et al. Antibodies were biotinylated with N-hydroxysuccinimide ester of biotinamidohexanoic acid according to Immunochemical protocols, 2005. The purified RABV with a protein concentration of at least 1 mg/ml and antigenic activity of 1:128 in AGID, 1:320 in CFT and 1:4000 in indirect ELISA was received. The concentration of anti-rabies antibodies in the dog serum was 5.5 IU/ml in FAVN. Anti-rabies IgG with titers of 1:128 in AGID, 1:160 in CFT, 1:12800 in indirect ELISA were obtained. The degree of biotinylation was 5,2±0,34 biotin molecules per 1 antibody. Thus, technologies for obtaining a purified cultured RABV, anti-rabies dog serum and biotinylated anti-rabies rabbit antibodies for competitive ELISA have been developed successfully.

Keywords: rabies virus, strain "Shchelkovo-51", virus isolation and purification, ultracentrifugation, disc-electrophoresis, immunization, biotinylation of antibodies, enzyme-linked immunosorbent assay

Введение. Бешенство - острая особо опасная нейротропная инфекция животных и человека, вызываемая вирусом семейства Rhabdoviridae, рода Lyssavirus. В настоящее время повсеместно проводятся кампании масс-совой антирабической вакцинации домашних и диких плотоядных. Для контроля напряжённости поствакцинального иммунитета и определения уровня антител к вирусу бешенства (ВБ) Международным эпизоотическим бюро (МЭБ, OIE) рекомендованы тест-системы на основе реакций нейтрализации вируса (РН) в культуре клеток, а также иммуноферментного анализа (ИФА) [12]. При этом актуальной задачей является совершенствование методов выявления антира-бических антител в сыворотке крови животных, в том числе совершенствование техно -логий получения различных компонентов тест-систем для выявления антител к вирусу бешенства [3, 22]. Наиболее перспективной на данный момент является разработка тест-систем на основе конкурентного варианта иммуноферментного анализа, что во многом обусловлено высокой чувствительностью та-

ких тест-систем, а также их универсальностью при исследовании различных материалов от животных разных видов [9, 13, 19, 23]. Принцип проведения конкурентного, или блокирующего, ИФА основан на том, что специфические антитела исследуемой сыворотки, связываясь с сорбированным на дне лунок антигеном, блокируют связывание с ним диагностических конкурирующих антител. Выявление образовавшегося комплекса «анти-ген+антитело-конкурент» осуществляют с использованием пероксидазного конъюгата и субстрата, меняющего свою окраску в присутствии пероксидазы. Оптическая плотность раствора в лунке будет прямо пропорциональна количеству связавшихся с антигеном молекул конкурирующих антител и обратно пропорциональна концентрации антител в исследуемой сыворотке.

Цель работы - разработать технологии получения очищенного культурального вируса бешенства, антирабической сыворотки крови собак, а также биотинилированных антира-бических кроличьих антител для их дальнейшего использования в тест-системе для выяв-

з

ления антител к вирусу бешенства на основе конкурентного ИФА.

Материалы и методы. Очистка куль-турального вируса бешенства. Вирус бешенства штамма «Щелково-51» с титром инфекционной активности 6,2 lg ЦТД50/мл выделяли из суспензии культуры клеток ВНК-21. Штамм ВБ «Щелково-51» получен путем культивирования в перевиваемых клетках почки детеныша хомячка (ВНК-21) из штамма «Овечий ВГНКИ», являющегося производным от штамма «Москва», полученного, в свою очередь, из оригинального Пастеровского штамма «PAS» (Louis Pasteur virus) [4, 5].Очистку и концентрирование вируса проводили в несколько этапов.

Этап 1. Матрасы с монослоем зараженных клеток освобождали от культуральной жидкости, дважды промывали стерильным PBS (phosphate-buffered saline, 0,15 М, рН 7,6, MDL№ MFCD00131855, Sigma-Aldrich), замораживали при минус 20 С и оттаивали.

Этап 2. Суспензию размороженных клеток с вирусом обрабатывали ультразвуком на УЗ-диспергаторе (Sonic Dismembrator 550, Fisher Scientific). Флакон с суспензией погружали в чашу со льдом и подвергали УЗ-воздействию циклично в течение 3 мин с частотой ультразвуковых колебаний 40кГц (1 цикл - 30 с, продолжительность УЗ воздействия - 15 с). Ультразвуковая обработка в таком режиме позволяет дополнительно увеличить выход вируса из суспензии, не разрушая вирионы [10]. Затем вирус освобождали от клеточного дебриса центрифугированием (Sorvall WX ultra 80, ротор T -1250, Thermo Fisher) в течение 20 мин при 10 тыс. об\мин. (12,1 тыс. g).

Этап 3. Для осаждения и концентрирования вируса супернатант центрифугировали при 40 тыс. об/мин (192,7 тыс. g) в течение 90 мин.

Этап 4. Осадок вируса растворяли 10мМ трис-НС 1 буфером рН 7,4 до 1/10 центрифугируемого объема, инактивировали 0,025% ß-пропиолактоном (1:4000) и очищали гель-хроматографией на колонке 25х100, заполненной сефадексом G-200. 15 мл вирусной суспензии наносили на сефадекс G-200 и проводили хроматографию при скорости

потока 200 мл/час в том же буфере. Элюаты собирали порциями по 3 мл на коллекторе фракций и определяли содержание белка в них на спектрофотометре СФ-26 при 0П280: концентрацию вируса в мкг/мл определяли по концентрации белка, для построения калибровочной кривой использовали различные концентрации бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Этап 5. Материал каждого из элюцион-ных пиков объединяли, при необходимости концентрировали против 25% раствора поли-этиленгликоля с молекулярной массой 20 кДа (ПЭГ, CAS№ 25322-68-3, Sigma-Aldrich) в целлюлозной диализной тубе (Prod.№ D9652, Sigma-Aldrich) и исследовали на антигенную активность и специфичность в непрямом ИФА (с протеин А-пероксидазным конъюгатом) с референс-сывороткой антирабической сухой №1 (сер.СА-03) с активностью 20 МЕ/мл, ПВР-1-1.7/02044,ТУ9388-131-00494189-05, ВНИТИТБ), а также в реакциях диффузионной преципитации (РДП) и связывания комплемента (РСК) с компонентами, разработанными в отделе иммунологии ФГБНУ ВНИТИБП [1, 7, 12].

Степень очистки вируса бешенства и мол. массу вирусных белков определяли методом disc-электрофореза по U.K. Laemmli в вертикальном 10% полиакиламидном геле [16] в камере Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories), с окрашиванием 0,005% бром-феноловым синим. Образцы для анализа растворяли в буфере для образцов: 125 мМ Трис-HCl, 4,6% додецилсульфата натрия (SDS), 10% 2-меркаптоэтанола (2-ME), 0,005% бромфе-нолового синего и 20% глицерола, pH 6,8. Гели окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R 250 (CAS№ 6104-59-2, Sigma-Aldrich). Молекулярную массу белков определяли с помощью маркеров молекулярых масс Precision Plus Protein Standard Plugs (Bio-Rad). Концентрацию белка в сыворотке крови, препаратах вируса бешенства и антител определяли по методу O.H. Lowry et al. [18].

Иммунизация собак для получения антирабической сыворотки. Антирабическую сыворотку крови получали иммунизацией собак-метисов 3-12 месячного возраста очищенным культуральным ВБ штамма «Щел-

ково-51» с масляным адъювантом «Montanid ISA 201 VG» (Seppic, использовали в качестве разбавителя для ВБ в соотношении 1:1) и вакциной инактивированной сухой культу-ральной из штаммма «Щелково-51». Работу с собаками-метисами проводили на базе питомника при КСК «Русский Алмаз» (Московская область, Дмитровский район). Выбор оптимальной популяции собак для иммунизации осуществляли в соответствии с результатами проведенных ранее исследований о влиянии возраста собак на синтез антирабических вируснейтрализующих антител (ВНА) после вакцинации [2]. Четыре группы собак (n=4) иммунизировали подкожно очищенным культуральным вирусом бешенства штамма «Щелково -51» в объеме 2 мл вирусной суспензии с концентрацией белка 1 мг/мл трехкратно (0, 7 и 21 сутки) и вакциной антирабической сухой культуральной из штамма «Щелково-51» (Рабикан) подкожно однократно в объёме 2 мл согласно инструкции по применению вакцины [11]. Кровь брали на 35, 49, 63 сутки от начала иммунизации, на 30 и 40 сутки после вакцинации [11]. Активность, специфичность антирабических сывороток и динамику накопления антител определяли в непрямом методе флуоресцирующих антител (нМФА) и непрямом ИФА (нИФА) с референс-сывороткой анти-рабической сухой №1 (сер.СА-03) с активностью 20 МЕ/мл, ПВР-1-1.7/02044,ТУ9388-131-00494189-05,ВНИТИТБ) с компонентами, разработанными в отделе иммунологии ФГБНУ ВНИТИБП [1, 7], а также в реакции нейтрализации на культуре клеток BHK-21 (FAVN - fluorescent antibody virus neutralization test) [12].

Технология получения биотинилиро-ванных антирабических кроличьих антител. Кроликов породы «Советская шиншилла» массой 2,0-2,5 кг в возрасте 2-3 месяцев иммунизировали внутримышечно трехкратно на 0, 7 и 14 сутки очищенным культуральным вирусом бешенства штамма «Щелково-51» (0,5 мл суспензии ВБ с концентрацией белка 1 мг/мл) с масляным адъювантом «Montanid ISA 201 VG» (Seppic, использовали в качестве разбавителя для ВБ в соотношении 1:1) с и без иммуностимулятора «Иммунофан» (однократ-

но 1 мл с сочетанно с первым введением ВБ). Полученные на 35, 49 и 63 сутки от начала иммунизации сыворотки исследовали на антигенную активность в РДП, РСК и непрямом ИФА [1, 7, 12].

Выделение IgG из антирабической сыворотки крови кроликов проводили по модифицированной методике Levy N. B. et al. [17]. Модификация заключалась в выборе рН 0,02 М фосфатного буфера (6,8-7,4), соотношений ионообменника ДЭАЭ-целлюлозы (диэтила-миноэтилцеллюлоза, CAS№ 9013-34-7, Sigma-Aldrich) с сывороткой или глобулиновой фракцией, а также в технологических условиях выделения IgG. Разработанный нами метод ионообменной хроматографии - осаждение в объёме - позволяет выделить среди других сывороточных белков «медленную» по электро-форетической подвижности фракцию IgG, которая элюируется стартовым 0,02 М фосфатным буфером.

Антирабическую сыворотку кроликов диализировали против 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2 и смешивали с ионообменником (из расчета 25 мл влажной ДЭАЭ-целлюлозы с 10 мл антирабической сыворотки или 25 мл глобулиновой фракции) в колбе ротационной мешалки, закрепляли ее на мешалке и перемешивали смесь в течение 2-4 ч. Полноту связывания контролировали падением титра антител в РДП против преципитирующего антигена. Затем смесь переносили в стаканчик для центрифугирования и осаждали ионо-обменник при 5 тыс об/мин в течение 10 мин. Супернатант содержал фракцию IgG кролика, остальные сывороточные белки адсорбировались на ионообменнике.

Для увеличения выхода IgG антител использовали комбинированный метод, включающий предварительное получение глобули-новой фракции двукратным осаждением 50 мл антирабической сыворотки 50 мл сульфатом аммония ((NH)2SO4) 40% насыщения. Осадок глобулинов после второго осаждения растворяли в 25 мл 0,02 М фосфатного буфера (рН 7,2) и диализировали в течение 24 ч против него при 4 С. Диализированную глобулиновую фракцию смешивали с ДЭАЭ-целлюлозой и проводили выделение IgG как в случае работы с цельной сывороткой. Фракцию IgG антител

от 3-4 опытов объединяли и концентрировали против 25% раствора ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа (CAS№ 25322-68-3 Sigma-Aldrich) в целлюлозной диализной тубе (D9652, Sigma-Aldrich) до концентрации белка 10 мг/мл (в течение примерно 1,5 ч). Чистоту препарата подтверждали на disc-электрофорезе в 7,5% ПААГ [21].

Для выявления в препарате IgG антител из антирабической сыворотки крови кролика методом нМФА на мазки-отпечатки инфицированной ткани мозга мышей, павших после заражения фиксированным штаммом ВБ «CVS» наносили исследуемый препарат в разведениях 1:2-1:64 и инкубировали в течение 45 мин при 37 С. После промывки PBS рН 7,4 на мазки наносили ФИТЦ-протеин А конъюгат в рабочем разведении 1:2000 и выдерживали 30 мин, затем стекла промывали, подсушивали, наносили иммерсионное масло и просматривали под флуоресцентным микроскопом. В качестве положительного контроля на мазки наносили диагностическую антирабическую сыворотку овец [7], в качестве отрицательного контроля - сыворотку здорового барана в тех же разведениях.

Антирабические IgG, полученные от иммунизированных кроликов, биотинилиро-вали N-гидроксисукцинимидовым эфиром биотинамидогексановой кислоты (Sigma-Aldrich, CAS № 72040-63-2) по методике, описанной в Immunochemical protocols, 2005 [15]. Определение степени биотинилирования антител (degree of labeling - DOL) проводили по методу HABA, основанному на замещении темно-оранжевого красителя HABA (4'-гидро-ксиазобензол-2-карбоновая кислота) биотином из стрептавидина [14, 15].

Результаты исследований. Получение очищенного культурального вируса бешенства. В качестве антигена для конкурентного ИФА может выступать как цельный вирус

бешенства [19], так и отдельные вирусные белки (гликопротеин или нуклеопротеин) [8, 9], а также, например, вирусоподобные частицы [13]. Активность антигена в тест-системе обусловлена не только его природой, но и степенью очистки, а также концентрацией антигена в препарате для сенсибилизации планшетов. Поэтому при разработке технологии получения препарата вируса бешенства приоритетной задачей было получение очищенного препарата с высокой антигенной активностью в РДП, РСК и нИФА и концентрацией белка не менее 1 мг/мл.

При использовании предложенной комбинированной схемы очистки получен концентрированный чистый вирус бешенства с содержанием белка 1,3±0,19 мг/мл. Материал очищенного препарата вируса бешенства сохранял свои антигенные свойства и проявлял комплементсвязывающую и преципитирую-щую активность с референс-антирабической сывороткой в РСК, РДП и непрямом ИФА (таблица 1).

Хроматографический профиль очистки вируса бешенства на сефадексе G-200 представлен 3 белковыми пиками, при этом вирус бешенства содержится преимущественно в первом пике, в то время как второй и третий пики содержат белковую фракцию с низкой антигенной активностью, что подтверждается результатами непрямого ИФА (рисунок 1).

При проведении disc-электрофореза в ПААГ выявлены две фракции белков молекулярной массой 50-75 кДа, что соответствует белкам G (67кДа) и N (57 кДа) вируса бешенства. В связи с тем, что disc-электрофорез проводили в денатурирующих условиях, белки М1 (38,5 кДа) М2 (25 кДа) были выявлены в виде мономеров, что полностью соответствует имеющимся литературным данным [20, 22].

Таблица 1 - Характеристика вируса бешенства на различных этапах очистки

Этапы очистки вируса Характеристика препарата вируса бешенства

Объем, мл Концентрация белка, мг/мл, среднее±SD Антигенная активность, титр

РДП РСК нИФА

1 200 - - - -

2 200 3,2±0,25 - - -

3 20 1,5±0,11 1:4 1:40 -

4 60 0,25±0,05 1:64 1:160 1:1000

5 20-30 1,3±0,19 1:128 1:320 1:4000

Примечание: SD - стандартное отклонение

Рисунок 1- Хроматографический профиль очистки вируса бешенства на сефадексе G-200

Получение собачьих антирабических антител. Важной задачей при разработке тест-системы для выявления антител к вирусу бешенства является получение специфической референс-сыворотки крови собак для ее дальнейшего применения в качестве положительного контроля. Так как ключевое значение при оценке поствакцинального статуса животного имеет концентрация вируснейтрализующих антител (ВНА), при получении референс-сыворотки необходимо отдавать предпочтение схемам иммунизации, обеспечивающим максимальный синтез именно ВНА и не стимулирующим дополнительно образование компле-ментсвязывающих и преципитирующих антител.

В частности, по этой причине в схему иммунизации собак не был включен иммуностимулятор «Иммунофан».

В результате исследований установлено, что максимальный титр антирабических антител наблюдался в сыворотке крови собак, вакцинированных трехкратно очищенным культураль-ным вирусом бешенства штамма «Щелково-51» и адъювантом «Montanid ISA 201 VG» (таблица 2). Концентрация антирабических антител в такой сыворотке в реакции нейтрализации на культуре клеток составила 5,5±0,26 МЕ/мл, что позволяет использовать такую сыворотку в качестве положительной контрольной референс-сыворотки для разрабатываемой тест-системы на основе конкурентного ИФА.

Таблица 2 - Активность антител в сыворотке крови иммунизированных собак

Препарат для иммунизации Срок взятия крови, сутки Титр в нМФА Титр в нИФА Содержание ВНА в FAVN, МЕ/мл, среднее±SD

Очищенный культуральный вирус бешенства шт. «Щелково-51» (иммунизация на 0, 7, 21 сутки) 35 1:4 1:800 0,7±0,05

49 1 16 1:1600 1,2±0,09

63 1 16 1:3200 2,5±0,22

Очищенный культуральный вирус бешенства шт. «Щелково-51» + адъювант «Montanid ISA 201 VG» (иммунизация на 0, 7, 21 сутки) 35 1 16 1:800 1,2±0,04

49 1 32 1:1600 1,8±0,12

63 1 32 1:12800 5,5±0,26

Вакцина инактивированная сухая культуральная из шт. «Щелково-51» (однократно) 30 1:4 1:800 0,5±0,1

40 1:16 1:1600 1,2±0,23

Вакцина инактивированная сухая культуральная из шт. «Щелково-51» + адъювант «Montanid ISA 201 VG» (однократно) 30 1:16 1:1600 1,0±0,08

40 1:32 1:3200 4,0±0,37

Примечание: SD - стандартное отклонение

Получение биотинилированных кроличьих антирабических антител. При конструировании тест-систем на основе конкурентного ИФА в качестве конкурирующего компонента могут быть использованы как моноклональные, так и поликлональные антитела [3]. При создании тест-систем для выявления антител к конкретному вирусному белку в качестве антигена используют этот белок, а в качестве конкурирующего компонента - моно- или поликлональные антитела к нему [19, 6]. В случае же, если диагностический набор направлен на определение общего пула антител к вирусу, как это представлено в нашей работе, в качестве антигена используют цельный вирус либо его фрагменты, а в качестве конкурирующего компонента - поликлональные антитела к вирусу [13]. Для выявления обра-

зовавшегося комплекса «антиген + антитело-конкурент» изначально использовали антивидовые пероксидазные конъюгаты [9], однако со временем их заменили стрептавидин-перок-сидазные [13, 19]. Высокая аффинность стреп-тавидина к биотинилированным антителам обеспечивает высокую специфичность и чувствительность теста [23].

В результате трехкратной иммуниза-ции кроликов культуральным вирусом бе-шенства штамма «Щелково-51» с масляным адъювантом «Montanid ISA 201 VG» и им-муностимулятором «Иммунофан» получена сыворотка с активностью в непрямом ИФА 1:3200 (табл. 3), которая была использована для дальнейшего выделения IgG для приго-товления биотинилированных антирабических антител.

Таблица 3 - Антигенная активность сывороток крови иммунизированных кроликов

Препарат для иммунизации Срок взятия крови, сутки Антигенная активность, титр

РДП РСК нИФА

Очищенный культуральный вирус бешенства шт. «Щелково-51» + адъювант «Montanid ISA 201 VG» (иммунизация на 0, 7, 14 сутки) 35 1:4 1:40 1:400

49 1:8 1:80 1:800

63 1:32 1:160 1:1600

Очищенный культуральный вирус бешенства шт. «Щелково-51» + адъювант «Montanid ISA 201 VG» (иммунизация на 0, 7, 14 сутки) + «Иммунофан» (однократно, на 0 сутки) 35 1:16 1:80 1:800

49 1:32 1:160 1:1600

63 1:64 1:160 1:3200

При выделении из сыворотки крови иммунизированных кроликов антирабических IgG получен препарат антирабических IgG с титрами 1:128 в РДП, 1:160 в РСК, 1:12800 в ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИ

непрямом ИФА (табл. 4). Результаты непрямого МФА, а также disc-электрофореза в 7,5% ПААГ подтверждают накопление в препарате сыворотки крови кролика антирабических IgG. 1В ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ

Таблица 4 - Характеристика антител антирабической сыворотки кролика

Препарат Объем, мл Белок, мг/мл, среднее±SD Антигенная активность, титр

РДП РСК нИФА

Цельная антирабическая сыворотка крови кролика 100,0 32,8±3,50 1:64 1:160 1: 3200

Глобулиновая фракция 25,0 62,5±1,66 1:128 1:320 1: 6400

из антирабической сыворотки кролика 30,0 8,8±0,82 1:128 1:160 1: 12800

Примечание: SD - стандартное отклонение

Антирабические IgG, полученные от иммунизированных кроликов, биотинилировали N-гидроксисукцинимидовым эфиром биотинами-догексановой кислоты, степень биотинилиро-вания антител составила в среднем 5,2±0,34 молекул биотина на 1 молекулу антитела (сред-нее±SD). Использование аминореактивных производных биотина при рекомендуемом молярном соотношении меченных антител и маркера обычно приводит к DOL от 3 до 8 биотинов на интактную молекулу IgG, что является оптимальным для большинства парадигм обнаружения [15].

Заключение. При использовании предложенной комбинированной схемы очистки получен концентрированный чистый ВБ с содержанием белка не менее 1 мг/мл и антигенной активностью с антирабической референс-сыво-роткой в титре 1:320 в РСК, 1:128 в РДП и 1:4000 в непрямом ИФА. Хроматографический профиль очистки ВБ на сефадексе G-200 представлен 3 белковыми пиками, при этом вирус содержится преимущественно в первом пике, что подтверждается результатами непрямого ИФА. При проведении disc-электрофореза в ПААГ выявлены две фракции белков молекулярной массой 50-75 кДа, что соответствует белкам G (67кДа) и N (57 кДа) ВБ. Таким образом, получен препарат очищенного культу-рального ВБ штамма «Щелково-51», который может быть использован в качестве антигена при конструировании тест-систем на основе непрямого и конкурентного вариантов ИФА для выявления антител к ВБ.

При иммунизации собак очищенным культуральным вирусом бешенства штамма «Щелково-51» и адъювантом «Montanid ISA 201 VG» получена сыворотка с концентрацией антирабических антител в реакции нейтрализации на культуре клеток 5,5 МЕ/мл, что позволяет использовать такую сыворотку в качестве положительной контрольной референс-сыворотки в тест-системах на основе ИФА.

В результате иммунизации кроликов культуральным вирусом бешенства штамма «Щелково-51» с масляным адъювантом «Montanid ISA 201 VG» и иммуностимулятором «Иммунофан» получена сыворотка с активностью в непрямом ИФА 1:3200. При выделении из сыворотки крови иммунизированных кроликов антирабических IgG по предложенной методике получен препарат антирабических IgG с титрами 1:128 в РДП, 1:160 в РСК, 1:12800 в непрямом ИФА Степень биотинилирования полученных кроличьих антител составила в среднем 5,2 молекул биотина на 1 молекулу антитела (95% ДИ 4,8; 5,5), что позволяет использовать данные антитела в тест-системе на основе конкурентного ИФА.

Таким образом, разработаны технологии получения очищенного культурального вируса бешенства, антирабической сыворотки крови собак, а также биотинилированных антираби-ческих кроличьих антител для их дальнейшего использования в тест-системе для выявления антител к вирусу бешенства на основе конкурентного ИФА.

Список источников

1. ИФА для оценки эффективности вакцинации собак против бешенства / В. И. Клюкина [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2012. - № 6. - С. 28-29.

2. Лобанова В.А. Оптимизация схемы вакцинации собак против бешенства (Rhabdoviridae: Ьу88ау1гц8) при помощи математической модели / В.А. Лобанова, В.И. Клюкина // Вопросы вирусологии. -2021. - Т. 66. № 5. - С. 354-367. - doi: 10.36233/0507-4088-75. - РМГО: 34738451.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

3. Лобанова В.А. Биотехнологические аспекты совершенствования методов выявления антител к вирусу бешенства животных / В.А. Лобанова, В.И. Клюкина // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю. А. Овчинникова. - 2021. - Т. 17. № 1. - С. 62-75.

4. Метлин А.Е. Комплекс средств и методов диагностики и борьбы с бешенством: дис. ... докт. вет. наук: 06.02.02 / Метлин Артем Евгеньевич. - Владимир, 2018. - С. 79.

5. Нуклеотидная последовательность и филогенетический анализ G гликопротеина российского фиксированного штамма «Москва 3253» вируса бешенства / И.В. Тучков [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2013. - № 4. - С. 73-75.

6. Оптимизация схем гипериммунизации лабораторных животных высокоочищенным антигеном вируса бешенства / А.Г. Мухамеджанова [и др.] // Ветеринария. - 2020. - № 10. - С. 25-29.

7. Пат. 2609766 Российская Федерация, МПК C12P 21/00, A61K 39/205, A61P 31/12. Способ получения антирабической диагностической сыворотки / Клюкина В.И., Анисина О.В., Богомолова О.А., Романенко М.Н., Федоров Ю.Н.; заявитель и патентообладатель ФГБНУ ВНИТИБП. - № 2015147814; заявл. 09.11.2015; опубл. 02.02.2017, Бюл. № 4. - 8 с.

8. Получение антигена вируса бешенства методом трёхфазной экстракции / Р. М. Ахмадеев [и др.] // Ветеринарный врач. - 2020. - № 5. - С. 26-33.

9. Разработка и применение блок-иммуноферментной тест-системы для контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства / Н.А. Хисматуллина [и др.] // Ветеринарная медицина. - 2012. - № 96. -С. 64-66.

10. Устинова В.А. Ультразвуковая предобработка суспензии вируса бешенства для получения антигенсодержащих препаратов диагностических тест-систем / В.А. Устинова, В.И. Клюкина, О.В. Анисина // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы международного форума. - М., 2020. - С. 222-223. - ISBN: 978-5-6045396-0-6

11. Вакцина антирабическая инактивированная сухая культуральная из штамма «Щелково-51» для собак и кошек (Рабикан). - URL: https://www.biocombinat.ru/catalog/13/795/ (дата обращения: 20.01.2022). -Текст: электронный.

12. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Eighth Edition, 2018. - URL: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf. - (дата обращения: 20.01.2022). - Текст: электронный.

13. Fontana D, Rodriguez MC, Garay E, Russo S, Prieto C. Optimization and validation of a blocking ELISA for quantitation of anti-rabies immunoglobulins in multispecies sera. Appl Microbiol Biotechnol. 2020 May;104(9):4127-4139. doi: 10.1007/s00253-020-10490-6. Epub 2020 Mar 13. PMID: 32170383.

14. Green NM. A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin. Biochem J. 1965 Mar;94:23C-24C. doi: 10.1042/bj0940023c. PMID: 14340040.

15. Immunochemical protocols. - 3rd ed. / edited by Robert Burns. - 2005. - ISBN 1-58829-274-6. - URL: https://link.springer.com/content/pdf/bfm%3A978-1-59259-873-1%2F1.pdf. - (дата обращения: 20.01.2022). -Текст: электронный.

16. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5. doi: 10.1038/227680a0. PMID: 5432063.

17. Levy HB, Sober HA. A simple chromatographic method for preparation of gamma globulin. Proc Soc Exp Biol Med. 1960 Jan;103:250-2. doi: 10.3181/00379727-103-25476. PMID: 14416397.

18. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1):265-75. PMID: 14907713.

19. Mojzis M, Korytar P, Jerg S. Development and validation of ELISA test for detection of rabies anti-glycoprotein antibodies. Atlanta: Proceedings of the International Conference on Rabies in the Americas (RITA XIX); 2008. pp. 48-49.

20. Nakahara T, Toriumi H, Irie T, Takahashi T, Ameyama S, Mizukoshi M, Kawai A. Characterization of a slow-migrating component of the rabies virus matrix protein strongly associated with the viral glycoprotein. Microbiol Immunol. 2003;47(12):977-88. doi: 10.1111/j.1348-0421.2003.tb03458.x. PMID: 14695448.

21. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory. Ann N Y Acad Sci. 1964 Dec 28;121:321-49. doi: 10.1111/j.1749-6632.1964.tb14207.x. PMID: 14240533.

22. Trabelsi K, Ben Zakour M, Kallel H. Purification of rabies virus produced in Vero cells grown in serum free medium. Vaccine. 2019 Nov 8;37(47):7052-7060. doi: 10.1016/j.vaccine.2019.06.072. Epub 2019 Jul 9. PMID: 31300287.

23. Wasniewski M, Almeida I, Baur A, et al. First international collaborative study to evaluate rabies antibody detection method for use in monitoring the effectiveness of oral vaccination programmes in fox and raccoon dog in Europe. J Virol Methods. 2016 Dec;238:77-85. doi: 10.1016/j.jviromet.2016.10.006. Epub 2016 Oct 14. PMID: 27751949.

References

1. ELISA for evaluation of rabies vaccination effectiveness in dogs / Klyukina V.I., et. al. // Veterinary and Feeding. - 2012. - № 6. - pp. 28-29.

2. Lobanova V.A. Optimization of rabies (Rhabdoviridae: Lyssavirus) dog vaccination schedule using a mathematical model / V.A. Lobanova, V.I. Klyukina // Problems of Virology. - 2021. - vol. 66. №5. - pp. 354367. https://doi.org/10.36233/0507-4088-75

3. Lobanova V.A. Biotechnological aspects of improving animal antirabies antibodies detection methods / V.A. Lobanova, V.I. Klyukina // Bulletin of Biotechnology and Physico-Chemical Biology named after Yu.A. Ovchinnikov. - 2021. - vol. 17. № 1. - pp. 62-75.

4. Metlin A. E. A set of tools and methods for diagnosing and combating rabies: dissertation ... doctor of veterinary sciences: 06.02.02. - 2018. - p. 79.

5. Nucleotide sequence and phylogenetic analysis of glycoprotein-G of the russian fixed rabies virus strain "Moscow 3253" / I.V. Tuchkov, et.al. // Problems of Particularly Dangerous Infections. - 2013. - № 4. - pp. 73-75.

6. Optimization of laboratory animals hyperimmunization schemes with a highly purified rabies virus antigen / A.G. Mukhamedzhanova, et. al. // Veterinary. - 2020. - № 10. - pp. 25-29.

7. Patent № 2609766 RU, IPC C12P 21/00, A61K 39/205, A61P 31/12. Method of production of rabies diagnostic serum / V.I. Klyukina, O.V. Anisina, O.A. Bogomolova, M.N. Romanenko, Yu.N. Fedorov // Proprietor FGBNU VNITIBP (RU). - № 2015147814; filed 09.11.2015; published. 02.02.2017, Bull. № 4. - 8 p.

8. Obtaining rabies virus antigen by three-phase extraction / R.M. Akhmadeev, et. al. // Veterinarny Vrach. - 2020. - № 5. - pp. 26-33.

9. Development and application of a novel ELISA-block test-system to improve rabies vaccine prevention. / N.A. Khismatullina, et. al. //Veterinary Medicine. - 2012. - № 96. - pp. 64-66.

10. Ustinova V.A. Ultrasonic processing of rabies virus suspension for obtaining antigen-containing preparations for diagnostic test systems / V.A. Ustinova, V.I. Klyukina, O.V. Anisina // International Forum Biotechnology: State Of The Art And Perspectives. - 2020. - iss.18. - pp. 222-223. - ISBN: 978-5-6045396-0-6

11. Rabies vaccine inactivated dry cultural from the strain "Shchelkovo-51" for dogs and cats (Rabikan). -URL: https://www.biocombinat.ru/catalog/13/795/ (application date: 20.01.2022).

12. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Eighth Edition, 2018. - URL: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf. - (application date: 20.01.2022).

13. Fontana D, Rodriguez MC, Garay E, Russo S, Prieto C. Optimization and validation of a blocking ELISA for quantitation of anti-rabies immunoglobulins in multispecies sera. Appl Microbiol Biotechnol. 2020 May;104(9):4127-4139. doi: 10.1007/s00253-020-10490-6. Epub 2020 Mar 13. PMID: 32170383.

14. Green NM. A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin. Biochem J. 1965 Mar;94:23C-24C. doi: 10.1042/bj0940023c. PMID: 14340040.

15. Immunochemical protocols. - 3rd ed. / edited by Robert Burns. - 2005. - ISBN 1-58829-274-6. - URL: https://link.springer.com/content/pdf/bfm%3A978-1-59259-873-1%2F1.pdf. (application date: 20.01.2022).