CC BY
72
БИОТЕХНОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА
Известия ТСХА, выпуск 1, 2009 год
УДК 573.6:635.854.78:632.958.1
ПОЛУЧЕНИЕ IN VITRO КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР ПОДСОЛНЕЧНИКА, УСТОЙЧИВЫХ К БЕЛОЙ ГНИЛИ (SCLEROTINIA SCLEROTIORUM) И РОЛЬ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В АДАПТАЦИИ КЛЕТОК К ДЕЙСТВИЮ СЕЛЕКТИВНОГО ФАКТОРА
Е.А. КАЛАШНИКОВА, НГУЕН ТХАНЬ ХАЙ, Н.Б. ПРОНИНА (Кафедра с.-х. биотехнологии)
Оптимизирована питательная среда для получения каллусных тканей и рас-тений-регенерантов трех генотипа подсолнечника. Получены клеточные и тканевые культур подсолнечника, устойчивых к склеротиниозу, на основе культивирования каллусных клеток на питательной среде, содержащей культуральный фильтрат гриба Sclerotinia sclerotiorum. Показана роль фенольных соединений в адаптации клеток к действию селективного фактора.
Ключевые слова: подсолнечник, стерильные проростки, белая гниль, культуральный фильтрат, каллусная ткань, фенольные соединения, полифенолок-сидаза.
В связи с возрастанием роли подсолнечника как ценной продовольственной и кормовой культуры первостепенное значение приобретает разработка защитных мероприятий от комплекса болезней. Особую опасность для культуры подсолнечника представляют эпифитотии белой гнили (5с1егоИта эсЫгоиогит), а в последние годы фо-мопсиса (РНоторБгБ ЬеИаМЫ), являющиеся одними из основных причин значительного недобора урожая и снижения товарных и посевных качеств семян [3, 14]. Так, белая гниль ежегодно поражает подсолнечник на площади 1,5-2 млн га, снижая урожай на 4-5 ц/га. В годы эпифитотии урожай погибает почти полностью, а масло в собранных семенах не пригодно для пищевых целей. Данную проблему трудно решить, используя только тра-
диционные способы защиты растений и посевов: агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них в отдельности не обладает достаточной эффективностью.
Одним из новых, перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование современных методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия (со-маклональная вариабельность, соматическая гибридизация, индуцированный мутагенез, генетическая инженерия) и сократить сроки проведения селекции. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них целых растений [7].
Поиск генотипов подсолнечника, устойчивых к различным патогенам, в частности, к Sclerotinia sclerotiorum, возможен в культуре in vitro при культивировании эксплантов на питательных средах, содержащих продуцирующие токсины патогенов.
Целью работы было получение клеточных и тканевых культур подсолнечника, устойчивых к склеротинио-зу, и изучение механизмов адаптации клеточных культур к стресс-фактору.
Объекты и методы исследований
Объектом исследований служили семена подсолнечника трех генотипов (ВК 580, ВК 653, Кубанский 93), обладающие различной устойчивостью к склеротинии. В опыте придерживались разработанных на кафедре с.-х. биотехнологии РГАУ — МСХА имени К.А. Тимирязева методик по стерилизации растительного материала и работе с культурой клеток растений in vitro [2].
В качестве стресс-фактора изучали действие культурального фильтрата (КФ) патогена Sclerotinia sclerotiorum. КФ получали путем выращивания изолятора гриба в колбах 300 мл в жидкой питательной среде объемом 200 мл на качалке со скоростью вращения 100 об/мин. В каждую колбу вносили по 108 шт. конидий гриба. Культуральный фильтрат получали путем фильтрования суспензии гриба через фильтровальную бумагу с последующим его автоклавированием.
Культивирование каллусной ткани проводили на питательных средах, содержащих КФ патогена в концентрациях 5%, 15, 25, 35% от конечного объема питательной среды. КФ добавляли в питательную среду перед автоклавированием.
Прирост каллусной ткани и фитотоксичность культурального фильтрата определяли по формулам, изложенным в [2]. Суммарное содержание растворимых фенольных соединений, активность полифенолоксидазы опре-
деляли в первичном экспланте, а также в каллусной ткани, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях по методике Н.Б. Прониной [4].
Эксперименты проводили в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях. Все результаты обработаны статистически [1,8]. На графиках и в таблице представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения.
Результаты и их обсуждение
При оптимизации методов клеточной и тканевой селекции in vitro первостепенной задачей является разработка технологий, обеспечивающих повышение морфогенеза изолированных эксплантов. Известно, что процесс морфогенеза зависит от ряда факторов (генетических, физиологических, гормональных и физических), каждый из которых необходимо учитывать для определенной таксономической группы растений. Путем изменения условий культивирования, а также минерального и гормонального состава питательной среды можно регулировать морфогенетическую реакцию изолированных клеток, тканей и органов растений при их выращивании в условиях in vitro, что позволяет решать различные задачи клеточной биотехнологии [11,12,13].
В наших исследованиях было показано, что наилучшим эксплантом для получения хорошо пролиферирующей каллусной ткани, способной к морфогенезу, были гипокотильные сегменты, изолированные с 5-дневных проростков и культивируемые на питательной среде Мурасига и Скуга (МС), содержащей кинетин 2 мг/л и НУ К 1 мг/л. Причем данная ответная реакция имела генотипическую зависимость, как это неоднократно отмечалось в литературе [10,11,12,13]. Из всех изучаемых генотипов выделялся сорт Кубанский 93, для которого процесс морфогенеза происходил более интенсивно по сравнению с другими сортообразцами (таблица) и составил 10,2%.
Зависимость морфогенетического потенциала первичных эксплантов от исследуемого генотипа
Генотип
Морфогенез, %
Среднее число побегов на 1 эксплант, шт
Каллусогенез
Кубанский 93 ВК 580 ВК 653
10,20 ±0,21 7,84 ±0,15 6,38 ±0,15
1,80 ±0,75 1,50 ±0,5 1,67 ±0,47
При культивировании гипокотиль-ных эксплантов или каллусной ткани на среде с кинетином и НУК получены растения-регенеранты, которые были перенесены в почвенную культуру (рис. 1). Таким образом, нами были оптимизированы условия культивирования каллусной ткани, способной к регенерации.
В исследованиях по клеточной селекции необходимо правильно подобрать стресс-фактор, который оказывает определенное действие на культивируемые клетки каллусной ткани. В качестве селективного фактора использовали КФ патогена БсЫгоИта всЫгоИогит. Для проведения клеточной селекции необходимо оценить фитотоксичность получаемого фильтрата. Для этой цели в первую очередь определяют длительность культивирования КФ патогена в жидкой питатель-
ной среде и выявляют сроки его выращивания, при которых наблюдается максимальное накопление экзометаболитов гриба в культуральной среде. В результате исследований нами установлено, что при длине волны 320 нм КФ имеет максимальную оптическую плотность (рис. 2), равную
0,750 ед., поэтому данная длина волны была выбрана нами за основу и применялась в дальнейших экспериментах.
Во второй серии эксперимента определяли время выращивания патогена в жидкой питательной среде с целью получения культурального фильтрата, обладающего максимальной фитотоксичностью. Измерения оптической плотности проводили каждые
5 дней. Полученные результаты, представленные на рисунке 3, показывают, что начало активного выделения экзометаболитов в питательную среду
А Б
Рис.1. Морфогенез каллусной ткани:
А — образование адвентивных побегов, Б — растения-регенеранты
Рис. 2. Зависимость оптической плотности КФ от длины волны
Рис.З. Зависимость оптической плотности КФ от длительности культивирования патогена в питательной среде (при X =320 нм)
приходится на 20-е сут с начала культивирования патогена. В этом случае оптическая плотность жидкости составила 0,345 ед. При дальнейшем культивировании гриба наблюдалось значительное повышение оптической плотности культуральной жидкости, которое достигло максимума на 45-й день культивирования патогена в среде, и составила 0,750 ед. Однако начиная с 35-х сут повышение оптической плотности существенно не изменялось, что свидетельствует о нецелесообразности дальнейшего культивирования гриба в данных условиях.
Для доказательства фитотоксичности КФ его активность проверяли на различных эксплантах: семенах, гипо-котильных сегментах, изолированных с 5-дневных проростков, а также на каллусной культуре. Исследования показали, что КФ гриба Зс1егоИша
8с1егоИогит в различных концентрациях оказывает в той или иной степени влияние на прорастание семян подсолнечника, способность гипокотиль-ных сегментов формировать каллусную ткань и ее прирост. Установлено стимулирующее влияние культурального фильтрата патогена в концентрациях 25% для генотипов ВК 580 и Кубанский 93 на прорастание семян и дальнейшее формирование проростков, а также в концентрации 5% КФ для генотипа Кубанский 93 на формирование каллусной ткани из гипокотильных сегментов. При более высоких концентрациях проявляется ингибирующий эффект, который для отдельных генотипов выражается в полной гибели каллусной ткани. Поэтому клеточную селекцию подсолнечника целесообразно проводить в присутствии КФ патогена в концентрации 5~35% от конечного объема питательной среды.
Клеточную селекцию проводили на каллусной ткани, культивируемой на питательной среде с присутствием КФ патогена в концентрации 5%, 15, 25 и 35%. Исследования показали, что для всех изучаемых генотипов характерна общая закономерность в поведении каллусных тканей в стрессовых условиях. Так, с увеличением концентрации КФ в питательной среде уменьшается прирост каллусной ткани. Однако при длительном культивировании каллусной ткани в изучаемых стрессовых условиях прирост биомассы клеток существенно уменьшается к IV пассажу и начиная с V пассажа наблюдается стабилизация в приросте (рис. 4). Полученные данные свидетельствуют
об адаптации каллусных культур к действию селективного фактора.
Важным моментом в исследованиях по клеточной селекции на устойчивость к биотическим факторам является изучение изменений в метаболизме фенольных соединений (ФС) в каллусных культурах, подвергшихся стрессовым воздействиям. В связи с тем, что фенольные вещества играют важ-
■ Контроль • КФ 5%
-КФ 15%
-КФ 25%
- КФ 35%
(II)
(III) (IV)
Количество дней
(V)
(VI) (пассаж)
(І) (II) (III) (IV) (V) (VI) (пассаж)
—*— Контроль -о— КФ 5%
—КФ 15% КФ 25% КФ 35%
Рис. 4. Прирост каллусной ткани, культивируемой в присутствии КФ гриба БсІегоНпіа зсіегоїюгит: А — генотип Кубанский 93; Б — генотип ВК 580; В — генотип ВК 653
ную роль в защите клеток от стрессового фактора, нами были проведены исследования по изучению изменений количественного и качественного состава фенольных соединений в каллус-ной ткани различных генотипов подсолнечника, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях.
Исследования показали, что у изучаемых генотипов суммарное содержание растворимых фенольных соединений в первичном экспланте различное. Причем среди всех исследуемых генотипов заметно выделялся сортообра-зец ВК 580 (15,86 мг/г сырой массы), в клетках которого синтезировалось полифенолов на 30% больше по сравнению с сортообразцами Кубанским 93 и ВК 653. При культивировании кал-лусной ткани в условиях in vitro количество суммарных растворимых ФС у всех генотипов подсолнечника снижается в 2-4 раза по сравнению с его количеством в первичном экспланте.
Ранее было показано, что биосинтез ФС в присутствии стрессового фактора изменяется [5, 6, 9]. Нами также было отмечено, что при культивировании каллусной ткани в стрессовых условиях (присутствие КФ патогена в различных концентрациях) наблюдалось изменение учитываемого показателя, которое проявлялось в увеличении биосинтетической активности каллусной ткани всех изучаемых генотипов (рис. 5). Вероятно, длительное культивирование каллусной ткани подсолнечника в стрессовых условиях способствует повышению программируемой защитной реакции, проявляющейся в увеличении синтеза соединений фенольной природы, что неоднократно отмечали другие авторы [5, 9].
Для понимания процессов изменения биосинтеза растворимых фенольных соединений, происходящих в клетках первичных эксплантов, представлялось важным изучение качественного состава фенольного комплекса. Поэтому в следующей серии экспериментов нами были предприняты биохимические приемы, позволяющие
исследовать этот состав. В результате изучения этанольных экстрактов с использованием одномерной тонкослойной хроматографии нами было установлено, что в гипокотильных сегментах подсолнечника синтезируются как фенилпропаноиды, представленные фе-нолкарбоновыми кислотами, так и фла-воноиды, в т.ч. и флавонолы (рис. 6, I). Причем в клетках гипокотильных сегментов сорта Кубанский 93 фенольный комплекс представлен 5 соединениями, ВК 580 — 6, а ВК 653 — 4 соединениями.
Для более детального изучения процессов изменения биосинтеза растворимых фенольных соединений, происходящих в клетках длительно культивируемых каллусных культур на селективных средах и в контрольном варианте, представлялось важным изучение качественного состава фенольного комплекса в процессе культивирования in vitro. Данные исследования проводили на каллусной ткани различных генотипов подсолнечника на I, III и
V пассажах цикла клеточной селекции. В качестве селективного фактора был выбран вариант присутствия культурального фильтрата патогена в среде в концентрации 15%. Полученные результаты представлены на рисунке 6.
Как следует из приведенных на рисунках данных, состав фенольного комплекса изменяется в процессе культивирования каллусной ткани опытного и контрольного вариантов. Причем установленные нами изменения характерны для всех изучаемых генотипов.
При культивировании каллусной ткани в стрессовых условиях нами было показано значительное изменение в разнообразии фенольного комплекса. Во всех исследуемых генотипах наблюдалось обогащение спектра синтезируемых веществ фенольной природы за счет биосинтеза de novo соединений фенилпропаноидов и фла-воноидов. Так, для генотипа Кубанский 93 отмечалось наличие 15 соединений (рис. 6, И), для ВК 580 — 18 соединений (рис. 6, III), а для ВК 653 —
(II)
(III) (IV)
Количество дней
(V) (пассаж)
■& 2-
•— Контроль 3— КФ 5% к— КФ 15% х— КФ 25% —Ж— КФ 35%
(Ш) (IV)
Кол ичество дней
(V) (пассаж)
(И)
*— Контроль з— КФ 5% ь—КФ 15% *— КФ 25% -Ж- КФ 35%
(III) (IV)
Количество дней
(V) (пассаж)
Рис. 5. Содержание фенольных соединений в каллусных тканях при длительном культивировании: А — генотип Кубанский 93; Б — генотип ВК 580; В — генотип ВК 653
Рис. 6. Схема хроматограммы этанольных экстрактов фенольных соединений:
I — различные гипокотильные сегменты; II — различные ткани подсолнечника генотипа Кубанский 93; III — различные ткани подсолнечника генотипа ВК 580; IV — различные ткани подсолнечника генотипа ВК 653; А — контроль, Б — присутствие КФ патогена Бс/егоИта эс/егоИогит в питательной среде в концентрации 15% (а — гипокотиль, Ь — I пассаж,
с — III пассаж,
10 соединений (рис. 6, IV) фенольной природы.
Из полученных результатов следует, что присутствие КФ патогена в среде приводит к изменению состава фенольных соединений в сторону его увеличения по сравнению с контрольным вариантом, что подтверждают и данные биохимических исследо-
с1 — V пассаж)
ваний количественного и качественного содержания полифенолов.
Выводы
1. Впервые для подсолнечника разработан метод получения клеточных и тканевых культур, обладающих устойчивостью к действию экзометаболита фитопатогенного гриба 8с1егоНта всЫго-
tiorum. Метод основывается на культивировании каллусных тканей на питательных средах, содержащих селективный фактор — культуральный фильтрат патогена (КФ). Впервые разработана технология получения высокотоксичного КФ гриба Sclerotinia sclerotiorum в условиях in vitro.
2. Выявлено положительное влияние фенольных соединений на адаптацию клеток к действию селективного фактора.
Они в большем количестве накапливаются в клетках, устойчивых к действию селективного фактора, что обусловлено изменением как количественного, так и качественного состава растворимых фенольных соединений.
3. Впервые оптимизированы условия культивирования изолированных экс-плантов, обеспечивающие получение растений-регенерантов непосредственно из первичного экспланта или каллусной ткани.
Библиографический список
Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Агропромиздат, 1985.
Калашникова Е.А., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии. М.: КолосС, 2006.
Комплексная защита подсолнечника от болезней / В.И. Якуткин // Тез. докл. «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии». Голицыно., 2003. С. 239-240.
Лабораторный практикум по сельскохозяйственной биотехнологии: Шевелу-ха B.C., Калашникова Е.А., Пронина Н.Б. и др. М.: МСХА, 2004.
Олениченко Н.А., Осипов В.И., Загоскина Н.В. Фенольный комплекс листьев озимой пшеницы и его изменение в процессе низкотемпературной адаптации растений // Физиология растений, 2006. Т. 53. № 4. С. 554-559.
Раскалиева В.А. Использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaria radicina: Автореф. канд. дис. М., 2001.
Сельскохозяйственная биотехнология: Уч., 3-е изд., перераб. и доп / B.C. Шеве-луха, Е.А. Калашникова, Е.З Кочнева и др. М.: Высшая школа, 2008.
Смиряев А.В., Килъчевский А.В. Генетика популяций и количественных признаков. М.: КолосС, 2007.
Сравнение действия биотического и абиологического стресса на каллусные культуры, инициированные из контрастных по устойчивости сортов льна-долгунца / Е.А. Гончарук, М.В. Молунова, Е.А. Калашникова // Материалы докладов, ч. 3.
VI съезд общества физиологов растений России: Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем». Сыктывкар., 2007. С. 157-159.
Nestares G., Mayor M.L., Zorzoli R. et al. Combining ability of sunflower inbred lines for in vitro traits // Helia. -Novi Sad., 2001. Vol. 24. № 35. P. 17-23.
Ozyigit 1.1., Bajrovic K., Gozukirmizi N., Semiz B.D. Direct plant regeneration from hypocotyl and cotyledon explants of five different sunflower genotypes (Helianthus annuus L.) from Turkey // Biotechnol.biotechnol.Equipm., 2002. Vol.16. № 1. P. 8-11.
Berrios E.F., Gentzbittel L., Serieys H. et al. Influence of genotype and gelling agents on in vitro regeneration by organogenesis in sunflower // Plant Cell Tissue Organ Cult., 1999. Vol. 59. № 1. P. 65-69.
Pajevic S., Vasic D., Sekulic P. Biochemical characteristics and nutrient content of the callus of sunflower inbred lines // Helia. -Novi Sad., 2004. Vol. 27; № 41. P. 143-149.
Vasic D.,Alibert G.,Skoric D. In vitro screening of sunflower for resistance to Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary // Helia. -Novi Sad., 1999. Vol.22. № 31. P. 95-103.
Рецензент — д. б. н. А.А. Соловьев
SUMMARY
The nutrient medium to obtain calluslike tissues and regeneration shoot of three different sunflower genotypes has been optimized. Cellular and histic sunflower cultures, resistant to white rot (Sclerotinia sclerotiorum) based upon calluslike cells cultivation in the nutrient medium containing cultural fungus filtrate Sclerotinia sclerotiorum have been obtained. The effect of phenol compounds on adaptation of cells to selective factor is focussed on.
