CC BY
40
DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10805 УДК633.521:631.52:632.4
Использование биотехнологических методов для создания новых генотипов льна, устойчивых к антракнозу
Н. В. ПРОЛЁТОВА
Федеральный научный центр лубяньх культур, ул. Луначарского, 35, Торжок, Тверская обл., 172002, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью разработки селективной in vitro системы для создания устойчивых к антракнозу генотипов льна. В питательной среде исследуемых штаммов гриба Colletotrichum lini через 7.. .50 сут. обнаружены аминокислоты аланин, глицин, аспарагин, цистеин, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, аргинин, треонин. Сделано предположение о взаимосвязи между наличием в культуральных фильтратах (КФ) аспарагина, аланина, глицина, аспарагиновой и глютаминовой кислот и стимулированием морфогенетической активности клеток льна-долгунца в селективных условиях in vitro при соответствующем подборе концентраций КФ. Схема дифференцировки генотипов льна по устойчивости к антракнозу включает выращивание растений-доноров незрелых зародышей (НЗ); асептическое изолирование незрелых зародышей; культивирование НЗ на модифицированной среде Sh-2, содержащей КФ смеси штаммов; визуальную оценку сформированных каллусов и дифференцировку генотипов по устойчивости к антракнозу. По количеству сформированного морфогенного каллуса в первом и втором пассажах можно судить о резистентности исследуемых форм льна к антракнозу и дифференцировать их по этому признаку. В результате отбора in vitro получена 21 устойчивая линия культуры. При скрещивании этих форм с восприимчивыми сортами в последующих поколениях, в основном, происходит рецессивное наследование признака устойчивости к антракнозу, и его тип сложно определить. Отобраны две гибридные формы (НЭ-38 х Ленок и НЭ-38 х Росинка), которые в первом и последующих поколениях сохранили резистентность к патогену на уровне 62,5.66,7 %.
Ключевые слова: лен, антракноз, устойчивость, селективный агент, культуральный фильтрат, аминокислоты, незрелый зародыш, каллус.
Сведения об авторах: Н. В. Пролётова, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: nataljaprljotva@rambler.ru). Для цитирования: Пролетова Н. В. Использование биотехнологических методов для создания новых генотипов льна, устойчивых к антракнозу // Достижения науки и техники АПК. 2019. Т 33. № 8. С. 24-28. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10805.
Use of Biotechnological Methods for the Development of New Flax Genotypes Resistant to Anthracnose
N. V. Proletova
Federal Scientific Center of Bast-Fiber Crops Breeding, ul. Lunacharskogo, 35, Torzhok, Tverskaya obl., 172002, Russian Federation
Abstract. A series of studies was conducted to develop a selective in vitro system for obtaining flax genotypes resistant to anthracnose. In the medium, where the studied strains of the Colletotrichum lini fungus were cultivated, such amino acids as alanine, glycine, asparagine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, arginine and threonine were detected in 7-50 days. An assumption was made that the presence of asparagine, alanine, glycine, aspartic and glutamic acids in culture filtrates (CF) could stimulate the morphogenetic activity of flax cells under selective in vitro conditions and appropriate CF concentrations. Differentiation of flax genotypes in terms of their resistance to anthracnose includes cultivation of donor plants of immature embryos (IE); aseptic isolation of IE; cultivation of IE using a modified Sh-2 medium containing a CF consisting of a mixture of strains; visual assessment of the formed callus; and differentiation of flax genotypes in terms of their resistance to anthracnose. The amount of the morphogenic callus formed in the first and second passages allows an appropriate differentiation of flax species in terms of the resistance. As a result of in vitro selection, 21 stable culture lines were obtained. When these forms were crossed with susceptible varieties, a recessive inheritance of the anthracnose resistance trait occurred in subsequent generations. As a result, the type of inheritance is difficult to determine. Two hybrid forms were selected (NE-38 x Lenok and NE-38 x Rosinka), which retained the pathogen resistance at the level of 62.5-66.7% in the first and subsequent generations. Keywords: flax; anthracnose; resistance; selective agent; culture filtrate; amino acids; immature embryo; callus. Author Details: N. V. Proletova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: nataljaprljotva@rambler.ru).
For citation: Proletova N. V. Use of Biotechnological Methods for the Development of New Flax Genotypes Resistant to Anthracnose. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2019. Vol. 33. No. 8. Pp. 24-28 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10805.
Лен - ценнейшая техническая культура с расширенным ареалом произрастания. Однако почвенная патогенная микрофлора создает барьеры для роста растений с высоким качеством продукции. Современные сорта льна-долгунца устойчивы к наиболее опасным болезням: ржавчине и фузариозному увяданию [1]. В то же время ежегодные изменения в ценозе болезней этой культуры, создают новые условия для их проявления, причем с различной степенью патогенности.
Антракноз льна - широко распространенное и вредоносное заболевание. До массового распространения химических протравителей семян этот патоген был причиной гибели посевов в фазе всходов на больших площадях. С появлением эффективных протравителей вред от антрак-ноза был снижен, однако их использование отрицательно сказывается на развитии молодых растений. Селекция на устойчивость могла бы уменьшить уровень заражения семян и сделать технологии возделывания льна более экологически безопасными. Задача повышения устойчивости может быть успешно решена лишь на основе интегрированного подхода к системе хозяин-паразит-среда [2, 3]. Только
в условиях инфекционного фона, который характеризуется популяционным составом возбудителя, одинаковым по качеству и количеству для всех испытуемых образцов, возможна дифференциация селекционного материала по степени устойчивости и проведение отбора [4, 5].
Важную роль в регулировании устойчивости к фитопато-генам играют биотехнологические приемы создания in vitro новых генотипов. Поэтому цель исследований заключалась в разработке эффективной селективной системы in vitro для создания устойчивых к антракнозу генотипов льна.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института льна (ВНИИЛ) в 2008-2018 гг. В качестве объекта исследования использовали лен культурный (Linum usitatissimum L., 2n = 30). Образцы имели следующие характеристики. Л 1506-8-4, Л 957-8-7, Алексим, Зарянка, Росинка, Ленок - линии и сорта долгунцового типа селекции ВНИИЛ с высоким проявлением хозяйственно-ценных признаков, устойчивые к фузариозному увяданию и ржавчине, восприимчивые к антракнозу. Пенджаб - сорт индийской селекции межеу-
мочного типа, урожайный по семенам, восприимчив к ан-тракнозу. Эр. 130-3 - линия-донор, обладающая R-генами устойчивости к антракнозу, позволяющая обеспечить высокую эффективность отбора на устойчивость к патогену в ранних поколениях, относительно устойчивая к антракнозу. НЛ-40-2, НЛ-40-1, НО-76, НЭ-38, НЭ-36, НЭ-15 и др. (всего 21 линия) - линии, созданные в лаборатории биотехнологии ВНИИЛ при селекции in vitro на первом этапе исследований. Характеризуются относительной устойчивостью к антракнозу.
В эксперименте использовали несколько штаммов возбудителя антракноза Colletotrichum lini Manns et Bolley, предоставленных сотрудниками лаборатории иммунитета ВНИИЛ из коллекции микроорганизмов - возбудителей болезней льна. Штаммы 527, 680, 677* - сильновирулентные штаммы возбудителя антракноза, быстрорастущие, с обильным спороношением, штамм 674 - средневиру-лентный, быстрорастущий, с обильным спороношением, штаммы 602, 674* - слабовирулентные, быстрорастущие, с обильным спороношением.
Схема проведения исследований включала несколько этапов:
выращивание растений-доноров пыльников и незрелых зародышей (НЗ) - на высоком агрофоне с площадью питания 1 растения 6,25 см2 (по 50 растений на сосуд, в трехкратной повторности). Родительские формы высевали в сосудах Митчерлиха в вегетационном домике, согласно методике [6], по 50 растений на сосуд, в трехкратной повторности. Размножение гибридного материала и семян чистых линий льна осуществляли в зимне-весенний период в сосудах Митчерлиха на установке СУВР (по рекомендациям [7]) и в условиях вегетационного домика в весенне-летний период. Таким образом выращивали все формы, участвующие в экспериментах (растения, от которых брали бутоны - доноры пыльников на стадии одноядерной вакуолизированной микроспоры и коробочки - доноры незрелых зародышей);
асептическое изолирование пыльников и 8...9-суточных НЗ из коробочек- по 100 пыльников/зародышей на вариант (10 пробирок по 10 пыльников/зародышей), в трехкратной повторности;
культивирование мицелия гриба на жидких средах Чапека и Sh-2, не содержащих регуляторы роста - в течение 50 сут., интенсивность спороношения биообразцов определяли в капле дистиллированной воды с помощью камеры Горяева под микроскопом МБИ-6. Количество спор в 1 см3 рассчитывали по формуле: N / 20 х 106, где N - количество конидий в поле зрения микроскопа в камере Горяева;
определение аминокислотного состава культурального фильтрата (КФ) - на 7, 14, 23, 30, 40, 50 сут., исследования проводили методом бумажной хроматографии. Рассчитывали Rf - отношение расстояния, пройденного пятном, к расстоянию, пройденному растворителем [8]. Использовали штаммы 527, 602;
визуальная оценка прироста биомассы гриба-возбудителя антракноза и определение токсичности культурального фильтрата - на 7, 14, 23, 33, 40 и 50 сут. Для изучения фитотоксических свойств КФ проводили замачивание в нем семян льна в течение 24 ч по методике Курчаковой [9]. Контроль - проращивание семян льна в воде. Для селекции in vitro использовали штаммы 680, 677*, 674, 674*;
культивирование пыльников на селективной среде, состоящей из компонентов питательной среды Sh-2 и КФ слабовирулентного (674*) штамма в концентрациях от 0 до 20 мл/л с шагом в 5 мл/л - по 100 пыльников на вариант (10 пробирок по 10 пыльников), в трехкратной повторности;
культивирование незрелыхзародышей на селективной среде, состоящей из компонентов питательной среды Sh-2 и КФ в концентрациях 0.. .44 мл/л с шагом 4.. .6 мл/л (смесь КФ сильновирулентных (680, 677*), средневирулентного (674) и слабовирулентного (674*) штаммов, взятых в равных пропорциях) - по 100 зародышей на вариант (10 пробирок по 10 зародышей), в трехкратной повторности;
культивирование первичного и пересадочного морфогенного каллуса льна на модифицированной среде Sh-2, содержащей 32, 36 и 40 мл/л КФ (смесь КФ сильновирулентных (680, 677*), средневирулентного (674) и слабовирулентного (674*) штаммов, взятых в равных концентрациях - по 8, 9 и 10 мл/л каждого штамма) - количество культивируемых клеток зависело от размеров сформированного морфогенного каллуса. Контроль - среда не содержащая КФ;
отбор растений-регенерантов, обладающихустойчиво-стью к культуральному фильтратувозбудителя антракноза -согласно рекомендациям, изложенным в патенте [4];
оценка регенерантов и исходных генотипов - на искусственном инфекционно-провокационном фоне (оценку растений-регенерантов и линий выполняли сотрудники лаборатории иммунитета с использованием методических указаний [10]) и в условиях in vitro;
проведение скрещиваний междулиниями, полученными при отборе in vitro, проявившими устойчивость к антрак-нозу, и сортами льна-долгунца Ленок и Росинка - восприимчивыми к болезни - по 20 скрещиваний на комбинацию. В качестве материнских форм использовали линии НЭ-36, НЭ-17, НЭ-17-2, НЭ-17-5, НО-85, НЭ-38 и НО-65;
оценка гибридов и родительских форм на искусственном инфекционно-провокационном фоне и в селективных условиях in vitro - для составления искусственной полевой популяции использовали расширенный набор штаммов. Согласно методическим указаниям, она состояла на 50 % из сильновирулентных штаммов (725, 726, 729, 730, 735, 739) и по 25 % средне- (724, 728, 737) и слабовирулентных (712, 714, 723) штаммов.
Годы исследований значительно различались по метеоусловиям в период вегетации льна. Относительно благоприятными для роста и развития растений были 2008, 2009, 2012, 2014, 2015, 2016 гг. Засушливые периоды во все фазы вегетации отмечали в 2010, 2011 гг. Дождливыми и холодными в фазы «елочка» и «быстрого роста» были погодные условия в 2017, 2018 гг.
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel, с использованием метода первичной статистической обработки результатов эксперимента - определения выборочной средней величины.
В работе было прослежено влияние минерального состава питательных сред Чапека (рекомендована для культивирования штаммов большинства грибов) и Sh-2 (разработана в лаборатории биотехнологии ВНИИЛ для культивирования клеток и тканей льна-долгунца) на продолжительность роста гриба-возбудителя антракноза Colletotrichum lini Manns et Bolley штаммов 527 и 602, на токсичность полученного КФ и, как следствие, на возможность использования среды Sh-2 для наращивания биомассы возбудителя антракноза льна.
Результаты и обсуждение. Наблюдения показали, что изучаемые штаммы хорошо развивались как на среде Чапека, так и на Sh-2. Культуральные фильтраты, полученные на их основе, после 40 дней выращивания гриба обладали высокой токсичностью. При анализе проростков фиксировали стабильное снижение роста корешков, загнивание их кончиков, угнетение и гибель проростков у восприимчивого
к антракнозу образца Пенджаб (у86,7.. .90,0 % проростков) и у относительно устойчивой линии Эр. 130-3 (у66,7.70,0 % проростков). В контроле угнетения и гибели проростков не наблюдали.
Отмечено повышение токсичности культуральных фильтратов на обеих средах в течение 40 дней культивирования возбудителя антракноза. С 7-го по 40-й день токсичность возросла на 40,7 %. При более длительных сроках культивирования (до 50 сут.) она практически не изменялась. Так, на 40-е сутки загнивание кончика корешков, угнетение и гибель проростков у восприимчивого к антракнозу образца Пенджаб наблюдали у 88,6.90,0 % растений, на 50-е сутки - у 87,9.90,0 %. Вероятно, за 40 дней запасы питательных веществ в среде были исчерпаны, гриб не имел возможности продолжать рост и, как следствие, накапливать токсические метаболиты. Поэтому выделяемые в среду продукты жизнедеятельности с 40-го по 50-й день были незначительны и не оказывали влияние на изменение токсичности КФ.
Известно, что грибы рода Colletotrichum продуцируют разнообразные по химической структуре метаболиты с широким спектром биологической активности, среди которых выявлены вещества с антимикробными, цитотоксическими, антиоксидантными, гормоноподобными и фитотоксически-ми свойствами [5, 11, 12]. Набор известных биологически активных соединений, у грибов рода Colletotrichum, не столь широк, как, например, у фитопатогенных грибов родов Alternaría, Fusarium и Phoma. Ни один представитель рода Colletotrichum не отнесен к токсигенным видам [12].
Определение аминокислотного состава фильтрата в динамике показало присутствие, начиная с 7 сут. культивирования, таких аминокислот, как аланин, глицин, аспарагин, цистеин, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, а так же аргинин (у штамма 602). По мере роста мицелия гриба в КФ происходило снижение концентраций аланина, аспарагина, глицина, аспарагиновой и глютаминовой кислот, вместе с тем к 23-м сут. культивирования отмечено появление треонина. Одновременно возрастало содержание цистеина, которое было наибольшим у 40-суточного КФ. Известно, что треонин участвует в процессе обезвреживания токсинов и вместе с другими аминокислотами: цистеином, аланином, лизином и аспарагиновой кислотой укрепляет иммунитет [11, 12]. Возможно, что присутствие в КФ таких аминокислот, как аспарагин, аланин, глицин, аспарагиновая и глютаминовая кислота при соответствующем подборе оптимальных концентраций КФ в среде стимулирует мор-фогенетическую активность клеток льна-долгунца, в то же время присутствие треонина влияет на индуцирование иммунитета клеток льна к действию КФ.
При добавлении в среду Sh-2 КФ в концентрациях 0. 20 мл/л с целью последующего культивирования пыльников, наблюдали дифференцировку клеток пыльниковых экс-плантов генотипов Пенджаб и Эр 130-3 во всех вариантах, кроме 20 мл/л. Это позволило выделить клеточные клоны, устойчивые к КФ в концентрациях 5, 10, 15 мл/л. Однако в дальнейшем в клеточных колониях как восприимчивого сорта Пенджаб, так и устойчивой линии Эр 130-3, мор-фогенные очаги не формировались. При последующем субкультивировании клетки погибали даже на свободной от токсических метаболитов среде. Вероятно, в селективных условиях клетки пыльников более уязвимы, а продукты метаболизма гриба оказывают сильное воздействие на их жизнедеятельность. При использованных концентрациях культурального фильтрата интоксикация была высокой. Патологический процесс гибели клеток запускался, начиная с культивирования первичного экспланта. Поэтому в дальнейших исследованиях было принято решение об
использовании незрелых зародышей льна, так как они более устойчивы.
После 10.14 сут. инкубации незрелых зародышей появлялись два типа структур: каллус и (или) побеги. Стимулирование пролиферации каллуса отмечено при концентрациях КФ 28, 32 и 36 мл/л. В этих вариантах формировались морфогенные каллусные очаги и стекловидные, слабох-лорофильные побеги. На средах с относительно низкой концентрацией КФ (4, 8, 12, 16, 20, 24 мл/л) стремительно нарастала водянистая клеточная биомасса, при этом морфогенные очаги не образовывались, либо формировались в единичных количествах. В вариантах, где КФ добавляли в среду в дозах 40 и 44 мл/л, формировался твердый каллус без признаков морфогенеза.
В ходе исследований было выявлено, что первичная каллусная ткань, сформированная на селективной среде, обладала пролиферативной и морфогенетической активностью, в отличие от каллусной ткани, образовавшейся на среде, свободной от КФ. Было отмечено некоторое инги-бирование роста и развития каллуса (0.31 %) на среде, содержащей 32 и 36 мл/л КФ, относительно свободной от токсических метаболитов среды. В этих вариантах побеги были сформированы, однако они оказались слаборазвитыми и уродливыми. В варианте с использованием КФ в концентрации 40 мл/л морфогенные участки не развивались, и клетки каллуса через неделю погибали.
Морфогенная каллусная ткань, перенесенная в дальнейшем на среду Sh-2, не содержащую КФ, продолжала развиваться и формировать морфогенные очаги, из которых образовывались побеги. В результате селекции были отобраны растения-регенеранты, устойчивые к культуральному фильтрату in vitro.
В ходе исследований была разработана схема диффе-ренцировки генотипов льна по устойчивости к антракнозу. Она включает выращивание растений - доноров незрелых зародышей на высоком агрофоне с площадью питания 6,25 см2; асептическое изолирование 8.9-суточных НЗ из коробочек; культивирование НЗ на модифицированной среде Sh-2, содержащей 36 мл/л КФ (смесь КФ сильновирулентных (680, 677*), средневирулентного (674) и слабовирулентного (674*) штаммов, взятых в равных концентрациях - по 9 мл/л каждого штамма); визуальную оценку сформированных каллусов и дифференцировку по устойчивости в зависимости от количества формирующегося морфогенного каллуса на 10.14 сутки.
На этапе субкультивирования проявлялось влияние генотипа на потенцию к морфогенезу в селективных условиях. Клетки генотипов Л 957-8-7, Алексим, Пенджаб, Зарянка обладали высокой морфогенетической активностью. В течение семи пассажей у них формировались морфогенные очаги, и были отобраны устойчивые к КФ клетки. Морфоге-нетический потенциал генотипов Л 1506-8-4, Росинка был исчерпан уже ко 2.3 пассажу.
При разработке схемы селекции льна in vitro на устойчивость к антракнозу с использованием эмбриокультуры было получено 86 побегов от генотипов Л 957-8-7, Зарянка, Алексим, Пенджаб, Эр 130-3 различной степени приживаемости.
В ходе оценки устойчивости растений к антракнозу в условиях in vitro и на искусственном инфекционно-провокационном фоне установлено, что при культивировании незрелых зародышей на среде Sh-2, содержащей культуральный фильтрат гриба-возбудителя антракноза смеси штаммов 680, 677*, 674, 674* в концентрации 36 мл/л, количество сформированного морфогенного каллуса в первом и втором пассажах, выраженное в процентах, и показатель полевой устойчивости генотипа к антракнозу
на искусственном инфекционно-провокационном фоне близки по значению. Так, на селективном фоне in vitro у линии НП-8 в первом пассаже был сформирован 31 % морфогенных каллусов, относительно общего числа культивируемых каллусов, во втором - 24 %. Полевая устойчивость на искусственном инфекционно-провокационном фоне отмечена на уровне 23,8 % - генотип неустойчив к антракнозу. У линии НЭ-38 в первом пассаже сформировано 54 % морфогенных каллусов, во втором - 62 %. Полевая устойчивость составляла 62,5 % - генотип устойчив к антракнозу (табл. 1). Таким образом, по количеству морфогенных каллусов, сформированных в первом и втором пассажах, можно дифференцировать исследуемые генотипы по устойчивости к патогену.
Таблица 1. Формирование морфогенного каллуса в культуре незрелых зародышей после 1...3
пассажей в зависимости от генотипа льна, концентрация КФ 36 мл/л
Генотип Полевая устойчивость к антракнозу, % Количество морфогенного каллуса после пассажа, % ± Sp
1 1 2 I 3
Росинка 29,0 45,0 ± 3,3 40,0 ± 3,2 20,0 ± 4,4 Ленок 38,0 54,0 ± 5,2 40,0 ± 3,2 18,0 ± 5,1 НП-8 23,8 31,0 ± 4,4 24,0 ± 3,3 25,0 ± 4,6 НЭ-38 63,9 58,0 ± 2,8 62,0 ± 3,5 55,0 ± 2,2 НЭ-17-2 54,1 60,0 ± 4,4 60,0 ± 3,7 53,0 ± 3,4
Проверка растений-регенерантов на искусственном инфекционно-провокационном фоне показала, что генотипы различались по устойчивости. Наряду с устойчивыми и среднеустойчивыми к антракнозу линиями (устойчивость на уровне 50,0...75,0 %), были и формы, восприимчивые к болезни (табл. 2). У устойчивых и среднеустойчивых генотипов величина этого показателя была на 12,0.37,0 % выше, чем у исходных форм. Однако линии, проявившие вначале высокую устойчивость к антракнозу, в последующие годы снизили ее на 10,0.50,0 %. У среднеустойчивых линий она возросла на 2,2.26,8 % и в течение последующих двух лет находилась на уровне 50,0.62,0 % (среднеустойчивые и устойчивые). Ряд созданных линий (НО-85, НО-85-1, НО-65, НО-65-1 и др.), кроме устойчивости к антракнозу, характеризовался устойчивостью к ржавчине и фузариозному увяданию, что было дополнительно установлено в инфекционно-провокационном питомнике в лаборатории иммунитета.
Таблица 2. Устойчивость к антракнозу некоторых форм льна и линий, полученных при селекции ¡п
vitro на инфекционно-провокационном фоне
Линия/ Устойчивость, % ± Sp
сорт 1 год 1 2 год 3 год
НЭ-36 75,0 ± 1,7 51,3 ± 1,1 45,0 ± 2,1
НЭ-17 57,0 ± 2,2 39,2 ± 3,1 48,3 ± 2,7
НЭ-17-5 75,0 ± 2,1 23,6 ± 2,4 54,6 ± 2,4
НЭ-17-2 57,0 ± 3,2 34,0 ± 2,2 36,6 ± 2,8
НО-85 43,7 ± 4,4 51,0 ± 2,7 48,3 ± 3,1
НЭ-38 66,7 ± 2,1 62,5 ± 1,9 62,5 ± 2,4
НО-65 45,0 ± 2,8 54,6 ± 1,3 49,0 ± 2,1
НЭ-36 75,0 ± 1,4 48,3 ± 3,4 62,5 ± 2,1
НП-8 26,7 ± 1,3 28,5 ± 2,6 16,3 ± 1,9
НЭ-17 57,0 ± 2,2 57,1 ± 1,2 48,3 ± 1,9
НЭ-38-8 62,5 ± 4,1 60,0 ± 2,7 66,7 ± 3,1
НО-65-1 45,0 ± 3,4 48,3 ± 2,1 45,0 ± 3,2
НО-85-1 43,7 ± 1,5 43,0 ± 2,1 39,0 ± 3,2
НЭ-17-6 75,0 ± 2,4 62,5 ± 1,9 58,0 ± 1,7
НЭ-15 12,3 ± 2,1 18,6 ± 1,2 15,3 ± 1,6
НП-16 6,3 ± 1,1 10,3 ± 2,1 6,3 ± 1,9
Эр 130-3 75,0 ± 1,7 75,0 ± 1,9 75,0 ± 1,9
Пенджаб 36,0 ± 3,2 38,0 ± 2,2 36,6 ± 2,8
Л 957-8-7 33,7 ± 1,5 39,0 ± 2,1 36,6 ± 3,2
Это связано с тем, что родительские формы, в основном, были высокоустойчивыми к этим возбудителям.
При оценке хозяйственно ценных признаков линий, созданных в результате отбора in vitro на устойчивость к антракнозу, было выявлено, что они, в основном, несколько уступают исходным формам. В то же время, у ряда генотипов (НО-85-1, НО-65, НЭ-38-8) величины некоторых показателей (высота растения, масса технической части стебля, количество семян с 1 растения, содержание волокна) превосходили сорт-стандарт Алексим на 25,5.38,9 %. Приобретенные изменения носили относительно стабильный характер. Возможно, это связано с различной по годам инфекционной нагрузкой в инфекционно-провокационном питомнике.
При оценке гибридов F1-3 и их родительских форм на искусственном инфекционно-провокационном фоне в полевых условиях выявлено, что степень устойчивости гибридов НЭ-38 х Ленок и НЭ-38 х Росинка составила 62,5 % и находилась практически на одном уровне с исходной формой НЭ-38 (66,7 %), при устойчивости восприимчивых родительских форм 38 % (сорт Ленок) и 29 % (сорт Росинка) (табл. 3). Результаты анализа других гибридных комбинаций от скрещивания контрастных по устойчивости форм свидетельствуют о преимущественно высокой степени поражения гибридов (устойчивость на уровне 0.25 %). Возможно, у созданных линий экспрессия генов устойчивости к поражению антракнозом зависела от внешних условий и патогенности возбудителя антракноза в годы испытаний. По мнению Б. Ф. Карпунина [13], однозначно определить тип наследования сложно, меньшая поражаемость антракнозом наследуется по типу неполного или полного доминирования у одних форм или неполного доминирования восприимчивости у других. В наших исследованиях, при скрещивании устойчивых линий льна-долгунца, созданных путем селекции in vitro, с восприимчивыми сортами в последующих поколениях, в основном, происходит рецессивное наследование признака устойчивости к антракнозуи его тип сложно определить.
Таблица 3. Устойчивость к антракнозу гибридов льна первого - третьего поколений на инфекционно-провокационном фоне
Устойчи- Роди- Устойчи-
Гибрид F1 - F3 вость, % тельская вость, %
± Sp форма ± Sp
НЭ-36 X Ленок 25,0 ± 2,5 НЭ-36 75,0 ± 1,7
НЭ-17 х Ленок 0,0 ± 1,4 НЭ-17 57,0 ± 2,2
НЭ-17-5 х Ленок 25,0 ± 3,3 НЭ-17-5 75,0 ± 2,1
НЭ-17-2 х Ленок 41,7 ± 3,7 НЭ-17-2 57,0 ± 3,2
НО-85 х Ленок 25,0 ± 1,9 НО-85 43,7 ± 4,4
НЭ-38 х Ленок 62,5 ± 4,4 НЭ-38 66,7 ± 2,1
НО-65 х Ленок 25,0 ± 2,6 НО-65 45,0 ± 2,8
НЭ-36 х Росинка 25,0 ± 2,8 НЭ-36 75,0 ± 1,4
НЭ-38 х Росинка 62,5 ± 3,1 НЭ-38 66,7 ± 1,3
НЭ-17 х Росинка 0,0 ± 1,1 НЭ-17 57,0 ± 2,2
НЭ-38-8 х Росинка 0,0 ± 1,8 НЭ-38-8 62,5 ± 4,1
НО-65 х Росинка 25,0 ± 2,2 НО-65 45,0 ± 3,4
НО-85 х Росинка 0,0 ± 0,5 НО-85 43,7 ± 1,5
НЭ-17-5 х Росинка 0,0 ± 1,1 НЭ-17-5 Росинка Ленок 75,0 ± 2,4 29,0 ± 2,4 38,0 ± 2,6
Выводы. Таким образом, биотехнологические методы (клеточная селекция in vitro, эмбриокультура), эффективны при создании генотипов льна-долгунца, более устойчивых к антракнозу, чем исходные формы.
В результате исследований разработана селективная система in vitro «гриб Colletotrichum //n/ Manns et Bolley - лен», позволяющая отбирать клетки льна-долгунца, устойчивые к культуральному фильтрату, из которых можно с большей
эффективностью получать растения-регенеранты, обладающие резистентностью к патогену.
Сделано предположение о взаимосвязи между присутствием в культуральных фильтратах таких аминокислот как аспарагин, аланин, глицин, аспарагиновая и глютаминовая кислота и стимулированием морфогенетической активности клеток льна-долгунца в селективных условиях in vitro при соответствующем подборе концентраций КФ.
Разработана схема дифференцировки генотипов льна по устойчивости к антракнозу. При культивировании незрелых зародышей на среде Sh-2, содержащей культуральный фильтрат гриба-возбудителя антракноза смеси штаммов 680, 677*, 674, 674* в концентрации 36,0 мл/л количество сформированного морфогенного каллуса в первом и втором пассажах, выраженное в процентах, и показатель полевой устойчивости генотипа к антракнозу на искусственном инфекционно-провокационном фоне близки по значению. Поэтому по количеству морфогенного каллуса можно диффе-
ренцировать исследуемые генотипы по устойчивости к патогену.
Выявлено влияние генотипа льна на потенции клеток к морфогенезу в селективных условиях. Клетки генотипов Л 957-8-7, Алексим, Пенджаб, Зарянка обладали высокой морфогенетической активностью. Морфогенетический потенциал генотипов Л 1506-8-4, Росинка был исчерпан уже ко 2.3 пассажу.
В результате отбора in vitro получена 21 линия льна, устойчивая к антракнозу. Выявлено, что при скрещивании устойчивых линий льна-долгунца, полученных при селекции in vitro, с восприимчивыми сортами в последующих поколениях, в основном, происходит рецессивное наследование признака устойчивости к антракнозу, тип которого сложно определить.
Получены две гибридные формы: НЭ-38 х Ленок и НЭ-38 х Росинка, которые в первом и последующих поколениях сохранили устойчивость к антракнозу на уровне 62,5.66,7 %.
Литература.
1. Кудрявцева Л. П., Прасолова О. В. Групповая устойчивость сортов - важный приоритет селекции льна-долгунца // Аграрный вестник Верхневолжья. 2018. № 3 (24). С. 25-30.
2. Research of Genetic Polymorphism Species Linum usitatissimum L. on a Basis a RAPD-Method / T. A. Rozhmina, Y. B. Fu, A. Diederichsen, et al. // Journal of Natural Fibers. 2018. Vol. 15. Is. 2. P. 155-161.
3. Агрономическая и организационно-экономическая разработка способов применения средств, снижающих проявление сорняков и болезней в посевах льна, как элементов технологии его возделывания в Центральном Федеральном округе РФ / Ф. В. Алырчиков, О. А. Савоськина, Н. А. Кудрявцев и др.// Электронный журнал АгроЭкоИнфо. 2018. № 1 (31). С. 3.
4. Пролетова Н. В., Кудрявцева Л. П., Виноградова Е. Г. Способ получения регенерантов льна-долгунца, устойчивых к антракнозу, методами in vitro // Патент на изобретение № 2478282 от 10 апреля 2013 г.
5. Colletotrichum: Biological control, bio-catalyst, secondary metabolites and toxins /R. S. Jayawardena, X. H. Li, M. Liu, et al. // Mycosphere. 2016. Vol. 7 (8). P. 1164-1176.
6. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агро-промиздат, 1985. 351 с.
7. Клейн Р. М., Клейн Д. Т. Методы исследования растений / пер. с англ. В. И. Мельгунова. М.: Колос, 1974. 528 с.
8. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / О. Микеш, Й. Новак, З. Проходка и др. / пер. с англ. Ч. 1. М.: Мир, 1982. 400 с.
9. Курчакова Л. Н. Методика получения культуральных фильтратов гриба Fusarium oxysporum и F. semitectum и их применение в культуре in vitro для получения фузариозоустойчивых форм льна-долгунца // Сборник науч. трудов ВНИИЛ. Вып. 28-29. Торжок, 1994. С. 127-128.
10. Селекция и первичное семеноводство льна-долгунца: методические указания/В.П. Понажев, Л.Н. Павлова, Т.А. Рож-мина и др. Тверь: Твер. гос. ун-т, 2014. 140 с.
11. García-Pajón C. M., Collado I. G. Secondary metabolites isolated from Colletotrichum species // Nat. Prod. Rep. 2003. Vol. 20 (4). P. 426-431.
12. Полуэктова Е. В., Берестецкий А. О. Грибы рода Colletotrichum как продуценты биологически активных соединений и биогербицидов // Микология и фитопатология. 2018. Т. 52. № 6. С. 367-381.
13. Карпунин Б. Ф. Антракноз льна: селекция на устойчивость. Lambert Academic Publishing. 2016. 113 c.
References
1. Kudryavtseva LP, Prasolova OV. [Group resistance of varieties is an important priority for flax breeding]. Agrarnyi vestnik Verkhnevolzh'ya. 2018;24(3):25-30. Russian.
2. Rozhmina TA, Fu YB, Diederichsen A, et al. Research of Genetic Polymorphism Species Linum usitatissimum L. on a Basis a RAPD-Method. Journal of Natural Fibers. 2018;15(2):155-61.
3. Alyrchikov FV, Savos'kina OA, Kudryavtsev NA, et al. [Agronomic, organizational and economic development of methods for using means that reduce the manifestation of weeds and diseases in flax crops, as elements of the technology of its cultivation in the Central Federal District of the Russian Federation]. AgroEkolnfo. 2018;31(1):3. Russian.
4. Proletova NV, Kudryavtseva LP, Vinogradova EG, inventors. Sposob polucheniya regenerantov l'na-dolguntsa, ustoichivykh k antraknozu, metodami in vitro [The method of obtaining flax regenerants, resistant to anthracnose, by in vitro methods]. Russian Federation patent RU 2478282. 2013 Apr 10. Russian.
5. Jayawardena RS, Li XH, Liu M, et al. Colletotrichum: Biological control, bio-catalyst, secondary metabolites and toxins. Mycosphere. 2016;7(8):1164-76.
6. Dospekhov BA. Metodika polevogo opyta [Field Experiment Methodology]. Moscow: Agropromizdat; 1985. 351 p. Russian.
7. Klein RM, Klein DT. Metody issledovaniya rastenii [Plant Research Methods]. Mel'gunov VI, translator. Moscow: Kolos; 1974. 528 p. Russian.
8. Mikesh O, Novak J, Prokhazka Z, et al. Laboratornoe rukovodstvo po khromatograficheskim i smezhnym metodam [Laboratory Manual for Chromatographic and Related Methods]. Vol. 1. Moscow: Mir; 1982. 400 p. Russian.
9. Kurchakova LN. [Method of obtaining culture filtrates of Fusarium oxysporum and F. semitectum and their application in vitro to obtain fusarium-resistant forms of flax]. Sbornik nauch. trudov VNIIL. 1994;28-29:127-8. Russian.
10. Ponazhev VP, Pavlova LN, Rozhmina TA, et al. Selektsiya i pervichnoe semenovodstvo l'na-dolguntsa: metodicheskie ukazaniya [Breeding and primary seed production of flax: guidelines]. Tver' (Russia): Tverskoi gosudarstvennyi universitet; 2014. 140 p. Russian.
11. Garcia-Pajon CM, Collado IG. Secondary metabolites isolated from Colletotrichum species. Nat. Prod. Rep. 2003;20(4):426-31.
12. Poluektova EV, Berestetskii A. [Fungi of the genus Colletotrichum as producers of biologically active compounds and bioherbicides]. Mikologiya i fitopatologiya. 2018;52(6):367-81. Russian.
13. Karpunin BF. Antraknoz l'na: selektsiya na ustoichivost' [Flax anthracnose: breeding for resistance]. Lambert Academic Publishing; 2016. 113 p. Russian.
